Морфометрические и клеточного анализа метод для мышиных нижней челюсти мыщелка

Резюме

Эта рукопись представляет методы для анализа морфометрических и клеточные изменения в пределах нижней челюсти мыщелка грызунов.

Аннотация

Височно-нижнечелюстного сустава (ВНЧС) имеет способность адаптироваться к внешним воздействиям, и загрузки изменения могут повлиять на позицию мыщелок, а также структурные и клеточные компоненты нижнечелюстной мыщелкового хряща (MCC). Эта рукопись описывает методы для анализа этих изменений и метод для изменения загрузки ВНЧС мышей (т.е., при сжатии статического ВНЧС загрузки). Структурной оценки, показанные здесь является простой морфометрические подход, который использует программное обеспечение Digimizer и выполняется в рентгенограммы мелких костей. Кроме того анализ сотовых изменения ведущие к изменениям в выражение коллагена, костного ремоделирования, деление клеток, и описан протеогликана распределения в MCC. Количественная оценка этих изменений в гистологических срезах - подсчитывая позитивные флуоресцентные пикселей с помощью программного обеспечения и измерения расстояния отображение изображений и окрашенных области с Digimizer - также продемонстрировал. Методы, показанный здесь, не ограничиваются мышиных височно-нижнечелюстного сустава, но могут быть использованы дополнительные кости небольших экспериментальных животных и в других регионах endochondral окостенения.

Введение

ВНЧС является уникальный несущие сустава, расположен в регионе краниофациальных и формируется костная. MCC ВНЧС имеет важное значение для функции сустава, включая движение беспрепятственный челюсти а masticating, выступая, но часто подвержена дегенеративные заболевания, включая¹остеоартрита. ВНЧС имеет способность адаптироваться к внешние раздражители и загрузки изменений, ведущих к структурной и клеточные изменения компонентов MCC^2,3,,45. Свойства несущих МСС можно объяснить взаимодействие между его составляющих, включая воду, коллагена сети и плотно упакованные протеогликаны. MCC имеет четыре различных клеточных зонах, которые выражают различные типы белков коллагена и не коллаген: 1) поверхностные или суставной зоны; 2) пролиферативную зоны, состоящий из недифференцированных мезенхимальных клеток и что отвечает на загрузку требования; 3 prehypertrophic зона, состоящая из зрелых хондроцитов, выражая коллаген типа 2; и 4) гипертрофических зона, регионе, где гипертрофических хондроцитов, выражая коллаген типа 10 умирают и пройти кальцификации. Минерализованных регион богат протеогликаны, которые обеспечивают устойчивость к сжимающей силы⁶.

Существует непрерывная минерализации в зоне гипертрофических MCC, где происходит переход от chondrogenesis к остеогенез, гарантируя надежную минерального состава субхондральной кости нижней челюсти мыщелка⁷. Клеточные изменения в районах unmineralized и минерализованных в конечном итоге привести к морфологических и структурных изменений в нижней челюсти мыщелка и нижней челюсти. Поддержание гомеостаза всех клеточных регионов MCC и минерализации в субхондральной части имеют важное значение для здоровья, несущая способность и целостности ВНЧС.

Несколько модель трансгенные мыши коллагена (как описано в Утега и др.) ⁸ представляет собой прекрасный инструмент для использования понять изменения в выражении коллагена, потому что все трансгенов выражаются в MCC. Для углубленной оценки гистологических гистологические пятна используются для изучения матрицы осаждения, минерализации, пролиферации клеток и апоптоз, а также выражения протеина в различных клеточных слоев MCC.

В этой рукописи, гистологические и морфометрического анализа используются для оценки сотовой и структурные изменения в MCC и субхондральной кости нижней челюсти мыщелка мышей. Кроме того описан метод количественной оценки клетки, для анализа флуоресцентные гистологические изображения и для отображения световой микроскоп слайды. При сжатии статического ВНЧС, загрузки метод, который вызывает сотовой и морфологические изменения в MCC и субхондральной кости⁹, также иллюстрируется для проверки наших методов.

Методы, описанные здесь может использоваться для определения морфометрических и гистологические изменения в нижней челюсти мыщелка и нижняя челюсть грызунов или для анализа других регионов endochondral окостенения и морфология дополнительных минерализованных тканей.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Комитет институционального ухода за животными центра здоровья университета Коннектикута одобрил все животные процедуры.

1. при сжатии статического ВНЧС загрузки: Рот, взломали

Примечание: Четыре week-old трансгенных мышей укрывательство флуоресцентные репортеров для коллагена (Col2a1XCol10a1), любезно предоставленных д-р Дэвид Роув (Университет штата Коннектикут), были использованы для экспериментов, описанных в этой рукописи (n = 8; 4 кобеля и 4 суки). Col2a1 голубой (синий) трансген выражается в клетках в prehypertrophic зоне MCC, а Col10a1 вишня (красный) клетки присутствуют в гипертрофических региона⁸ (рис. 1). Мышей были поровну разделены на две группы: 1) загружен группа, где мышей были подвергнуты при сжатии статического ВНЧС загрузки (описано в шаге 2) и 2) в контрольной группе, где мышей получил никакого вмешательства.

Рисунок 1. Представитель сагиттальной мыщелка двойной коллаген флуоресцентные репортер мыши (Col2a1XCol10a1). Шкалы бар = 200 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

1. Изготовить Спрингс usingbeta титанового сплава брекетах (0,017 x 0,025 дюйма)(Рисунок 2).
2. Анестезировать экспериментальных животных, внутрибрюшинного введения смеси кетамин (90 мг/кг массы тела) и ксилазина (13 мг/кг веса тела).
3. Аккуратно откройте рот мышей и вставьте Спрингс, привлечение петли в верхней и нижней челюсти резцы (рис. 2B и C).
4. Побудить сжатия статических ВНЧС загрузки, сохраняя пружины в резцов наркотизированных мышей, за 1 ч. Повторите эту процедуру на 5 дней.
5. Внутрибрюшинно придать мышей с 5-ethnyl-2'-дезоксиуридина (EdU; 30 мг/кг веса тела) для анализа распространения клеток 2 дней и за 1 день до эвтаназии.

Рисунок 2. При сжатии статического ВНЧС загрузки: рот заставил открытая модель. (A) весной изготовлены из 0,017 х 0,025 бета титанового сплава дуга. (B) загружен мышь с весны. (C) рентгенограмме о загрузке и управления мышей показаны различия в позиционировании нижней челюсти. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

2. Нижняя челюсть диссекции и фиксация

1. В конечной точке процедур, вынужден открыть рот усыпить экспериментальных животных утвержденным методом.
2. Вскрыть мандибулы, резки мышечной вложения без соскабливания хряща мыщелка.
3. Место уборка мандибулы в формалина 10% за 24 часа для фиксации.
   Предупреждение: Формалин является раздражающее; носите соответствующие средства индивидуальной защиты.

3. рентгеновских изображений и морфометрические измерения

1. Мандибулы в плоский контейнер (например, в 55 мм х 16 мм Петри) и принять рентгенограммы образцов, используя систему кабинета рентгеновской 26 кв для 5 s.
   Примечание: Место линейки шкалы перед сохранением изображения.
2. Выполняют морфометрические измерения мандибулы, с помощью программного обеспечения для анализа изображений (см. Таблицу материалов).
   Примечание: Перед выполнением любых измерений, используйте линейку шкалы на рентгенограмме для определения блока. Этот шаг важен для правильно измерить анатомические структуры. Нажмите на кнопку «Единица» (рис. 3А).
3. Выберите Анатомические точки, с помощью «стиль маркера 2» в программе обработки изображений (рис. 3B). Чтобы следовать метод, описанный в этом документе, выберите следующее (рис. 3B):
   1. Выберите condylion (пункт 1), наиболее задней точки нижней челюсти мыщелка;
   2. Выберите процесс резца (пункт 2);
   3. Выберите точку глубочайшее в сигмовидной паз (пункт 3);
   4. Выберите глубокая точка в вогнутость нижнечелюстной ветви (пункт 4);
   5. Выберите наиболее передней точки мыщелкового суставной поверхности (пункт 5); и
   6. Выберите наиболее задней точки мыщелкового суставной поверхности (пункт 6).
4. После выбора точки анатомические, выполняют морфометрические измерения с помощью инструмента «длина», но для длины головы мыщелка, используйте средство «перпендикулярная линия» от точки (3) и (4) (рис. 3C).
   1. Измерьте длину нижней челюсти, от condylion (1) к процессу резца (2).
   2. Измерьте длину мыщелка головы - перпендикулярное расстояние от condylion (1) к линии проследить глубокая точка в вогнутость нижнечелюстной ветви (4) от глубокая точка на сигмовидной паз (3).
   3. Измерьте ширину головы мыщелка - расстояние от наиболее девяностодневного срока наиболее задней точки мыщелкового суставной поверхности (5-6).
   4. Копировать измерения из списка «измерения» на правой стороне экрана (рис. 3C).

Рисунок 3 . Представление морфометрические измерения нижней челюсти. (A) использовать линейку рентгенограмме для определения группы (кружил в красный цвет, шкалы бар: 10 мм). (B) выберите Анатомические точки с помощью «стиль маркера 2» (обведено красным). 1) Condylion; 2) процесс резцов; 3) глубокая точка на сигмовидной лётка; 4) глубокая точка в вогнутость нижнечелюстной ветви; 5) большинство передней точки мыщелкового суставной поверхности; 6) задней точки мыщелкового суставной поверхности. Линейки: 10 mm.(C) выполнять измерения с «Длина» и «перпендикулярно» инструменты (обведено красным). Измерения от точки 1 к 2: длина нижней челюсти; от точки 5-6: мыщелкового ширина; перпендикуляр от точки 1 к 4 - 3: мыщелкового головы длина. Сохранить измерения из списка «измерения». Шкалы бар = 10 mm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

4. мыщелка встраивание

Примечание: После взятия радиографические изображения, мандибулы можно врезать и секционного для гистологического анализа.

1. Место undecalcified мандибулы (которые были исправлены в шаге 2.3) в 30% сахарозы в ФБР на ночь до внедрения.
2. Вскрыть любой избыток мягких тканей и тщательно вырезать нижней челюсти мыщелка.
3. Налить некоторые вложения смолы (достаточно, чтобы покрыть образец) в одноразовых пластиковых форм и место поверхности медиального мыщелка против базы плесень, позиционирование образца параллельно в нижней части формы.
4. Исправьте образца в правильное место с куском сухого льда.
5. Заполните форму с внедренными смолы и место плесень с фиксированной выборки в холодных 2-метил Бутан, который может быть предварительно охлажденные в морозильной камере-20 ° C или ° C-80 или сухого льда.
6. Храните образцы при-20 ° C или при температуре-80 ° C до секционирование.

5. мыщелка сагиттальной разрезания и подготовки слайд

1. Создайте замороженных сагиттальной разделы мыщелков (5-7 мкм) и передать образцы слайдов с помощью ленты передачи метода^10,11.
2. Придерживайтесь гистологических срезах, переданы ленты с помощью УФ отверждаемыми метод¹⁰.

6. гистологические окрашивание и микроскопических изображений

Примечание: Большинство гистологические окрашивания выполняется, как описано в разделе гистологические бумаги Даймент et al¹⁰.

1. Для базового сканирования, первым шагом является изображение для Col2a1 и Col10a1 трансгенов, как описано в Даймент et al¹⁰ .
   1. Место coverslips на вершине слайды в 30% глицерина и PBS. Выполнение базовых изображений ofthesectionswitha флуоресцентный микроскоп и соответствующие фильтры.
2. Выполняют окрашивание флуоресцентные тартрата стойкие кислой фосфатазы (ловушка).
   Примечание: Ловушка выражается гемопоэтических клеток, в том числе кости, resorbing клетки, остеокласты¹². Это пятно призвана анализировать MCC и субхондральной кости ремоделирования.
   1. Удалите coverslip слайдов путем замачивания их в PBS. Вымойте слайды в PBS три раза за 5 мин.
   2. Подготовьте ЛОВУШКУ буфера 1 путем растворения ацетат натрия безводный (9.2 g) и натрия тартрата L двуосновной дигидрат (11,4 г) в 1 Л дистиллированной воды. Отрегулируйте пэ-аш до 4.2 с уксусной кислотой и хранить ЛОВУШКУ буфера 1 на 4 ° C.
   3. Подготовьте ЛОВУШКУ буфера 2, свежезаваренным растворяя нитрита натрия (40 мг) в 1 мл дистиллированной воды.
   4. Подготовьте ЛОВУШКУ субстрата буфера (непосредственно перед окрашивание), смешивая 7,5 мл буфер 1 и 150 мкл буфера 2. Это решение (200 мкл) применить к каждому слайду 10 мин при комнатной температуре.
   5. Подготовка ЛОВУШКУ реакции буфера путем смешивания 1.840 мл буфера субстрата и 23 мкл флуоресцентные субстрата (см. Таблицу материалов).
      Примечание: Флуоресцентные substrategeneratesayellowfluorescentsignal ЛОВУШКУ активности.
   6. Удалите избыток ЛОВУШКУ субстрата буфера, нежно закупорить решение.
   7. Инкубируйте слайды с 200 мкл буфера реакции ловушка для 5 мин под черный свет лампы источника УФ.
   8. Вымойте слайды в PBS три раза за 5 мин.
   9. Место coverslips на слайды в 30% глицерина в PBS и выполнять микроскопических изображений¹⁰.
3. Выполняют окрашивание распространения клеток.
   Примечание: В этот assay, модифицированных тимидина аналоговые 5-ethynyl-2'-дезоксиуридина (EdU) включена в недавно синтезированных ДНК: делящиеся клетки помечены с флуоресцентной краской.
   1. После обработки изображений для ловушки, удалите coverslips и мыть слайды в PBS три раза за 5 мин. Следуйте инструкциям из комплекта распространения клеток 5-ethynyl-2'-дезоксиуридина пятно Гистологические срезы.
   2. Подготовить реакции коктейль, добавив 430 мкл 1 X буфер реакции, 20 мкл рабочего раствора CuSO₄, 1.2 мкл Люминесцентную краску и 1 X 50 мкл буфера добавка (суммарный объем 500 мкл является достаточно для одного слайда).
      Примечание: Производитель рекомендует добавить ингредиенты в порядке, описанном здесь.
   3. Инкубируйте слайды с подготовленной коктейли на 30 минут при комнатной температуре, в защищенном от света.
   4. Вымойте слайды в PBS три раза за 5 мин.
   5. Место coverslips на вершине слайды в 30% глицерина в PBS с 1:1,000 DAPI.
      Примечание: DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) является синий флуоресцентный ядерной пятно, что привязывается к AT-богатых регионов в ДНК.
4. Выполняют окрашивание толуидиновый синий (ТБ).
   Примечание: ТБ пятнать показывает распределение протеогликана на MCC.
   1. Промывайте indistilledwater слайды для удаления coverslips.
   2. После удаления coverslips, мыть слайды в дистиллированной воде 3 раза за 5 минут до полного удаления соли из PBS.
   3. Подготовить ТБ рабочего буфера, сделав решение (растворить 28.4 g натрия фосфат двухосновной в 1 Л дистиллированной воды) и решение B (растворить 27,6 g в 1 Л дистиллированной воды монокальций фосфат натрия). Mix 94,7 мл раствора A с 5,3 мл раствора развести B. это решение 1:1 в дистиллированной воде сделать 200 мл 0,1 м работает буфер. Исправьте рН 8.0 добавлением гидроксида натрия до тех пор, пока pH является фиксированным.
   4. Подготовка 1% акций ТБ: Смешайте 1 g ТБ в 100 мл дистиллированной воды.
   5. Подготовка рабочего раствора ТБ путем смешивания 40 мл 0,1 М рабочего буфера в 3 мл 1% акций ТБ.
   6. Инкубируйте слайды в рабочем растворе ТБ для 14-17 s.
      Примечание: Это пятно имеет очень время чувствительной; Время инкубации может потребоваться скорректировать для предотвращения overstaining.
   7. Вымойте слайды в дистиллированной воде 3 раза за 5 мин.
   8. Место coverslips на вершине слайды в 30% глицерина в дистиллированной воде. Выполнение визуализации¹⁰световой микроскоп.
      Примечание: Сделать не coverslip слайды витражи для ТБ в глицерин + PBS. PBS вымывает этот тип пятно.

7. флуоресцентные гистологические количественная оценка

1. Выполнять гистологические количественной флуоресцентных изображений с помощью программного обеспечения для анализа изображений (см. Таблицу материалов).
   Примечание: Основной принцип гистологические количественной оценки в этом методе является разделить количество флуоресцентные точек интереса на общее количество пикселей области интересов и умножить полученное число на 100, в результате чего процент положительных пикселей в рамках этого региона.
2. Выполните количественная оценка выражения Col10a1 в MCC сагиттальной секций мыщелков.
   1. При количественной оценке всех типов клеток и пятна, используя этот метод, выберите область, чтобы быть количественно. Откройте гистологические изображения в программное обеспечение анализа изображений и выберите область, используя «Лассо инструмент (L)» (рис. 4A). Для анализа, описанный здесь выберите регион MCC только; После выбора области, общее количество пикселей будет показан в поле «Гистограмма» на экране программного обеспечения (рис. 4A). Сохраните количество пикселов в области интереса.
   2. Выберите Col10a1 красные пиксели, используя средство выборки. Нажмите «Выбрать» на верхней панели, а затем «Цветовой диапазон». Нажмите на «инструмент «Пипетка», «выберите образец цвета для пикселя интерес в изображении и нажмите кнопку «ОК». Всех областях положительные для выбранного пикселя цвета будет выбран (Рисунок 4B). Скопируйте количество флуоресцентные пикселей (показан в поле «Гистограмма» экрана) и вставьте их в электронную таблицу или статистического программного обеспечения для анализа.
   3. Разделите количество пикселей, флуоресцентный над количество пикселей области интересов и умножить это число на 100: флуоресцентные пикселей / пикселы в области, представляющей интерес * 100.
      Примечание: Другой тип клеток, таких как голубой Col2a1, может быть определена количественно с этим же методом, но синий пикселей должен быть выбран вместо Col10a1 красный пикселей.

Рисунок 4 . Представление трансген количественной оценки Col10a1. (A) выберите область интереса с «Лассо» (L). Для Col10a1-положительных клеток выберите весь нижнечелюстной хряща. Сохраните количество пикселей в поле «гистограмма». (B) выберите пиксель интереса, в данном случае, красной флуоресцентной Col10a1 пикселей. Обратите внимание, что только красный пикселов в области интересов будет выбран. Сохраните количество красных точек из окна «гистограмма». Шкалы бар = 200 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

3. Выполните количественная оценка ЛОВУШКУ активности в MCC и субхондральной кости.
   1. Следуйте процедуре, описанной в шаге 8.2, но вместо только выбора области MCC, выберите области хряща и субхондральной кости (рис. 5A).
   2. Для анализа активности ЛОВУШКУ выберите желтый пикселей, порожденных ELF97 субстрат, как описано в шаге 8.2.2 (рис. 5B); копировать количество положительных пикселей; и вставьте их в электронную таблицу или статистического программного обеспечения для анализа.
   3. Получите процент ловушка позитивных пикселей путем деления количество желтых точек на общее количество пикселей в регионе субхондральной кости и умножения на 100.

Рисунок 5 . Представление флуоресцентные ЛОВУШКУ количественной оценки. (A) выберите область интересов (нижнечелюстной хряща и субхондральной кости) и сохранить количество пикселей этого региона. (B) выберите желтый флуоресцентный пикселей, представляющие ЛОВУШКУ активности. Обратите внимание, что только ловушка позитивных пикселей будет выбрать. Сохраните количество выделенных пикселов. Шкалы бар = 200 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

4. Выполните количественная оценка EdU положительных клеток.
   1. EdU окрашенных слайды counterstained с DAPI, поэтому вместо подсчета общее количество пикселей в регионе интереса, выберите DAPI-позитивных пикселей для вычисления доли EdU позитивных пикселей. Выберите область интереса, как описано в пункте 8.2, но не сохранять общее количество пикселей. Выберите DAPI синий пиксель в качестве пробы цвета, как описано в шаге 8.2.2; копировать количество пикселей, DAPI-позитивные (рисA); и вставьте их в электронную таблицу или статистического программного обеспечения для анализа.
   2. Далее выберите EdU положительных пикселей (Жёлтый флуоресцентный пикселей) и сохранить количество пикселей в поле «гистограмма» (Рисунок 6B).
   3. Вычислить процент EdU пикселей путем деления числа EdU позитивных пикселей на количество пикселей DAPI-позитивных и умножения полученного числа на 100.

Рисунок 6 . Представление EdU количественной оценки. (A) выберите пролиферативной регион MCC (наружный слой хряща). Выберите DAPI-позитивных пикселей и сохранить количество пикселей. (B) выберите EdU положительных пикселей (желтый флуоресцентный) и сохранить количество пикселей. Шкалы бар = 200 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

8. Количественная оценка толщины хряща и протеогликана распределения

1. Анализ толщины хряща (расстояние картирование) и толуидиновый синий окрашенных области с помощью программного обеспечения Digimizer изображения.
   Примечание: Используйте линейку шкалы в гистологической изображения для определения единицы (рисA).
2. Выполните измерение отображение расстояния.
   Примечание: Измерения расстояния сопоставления обеспечит толщины хряща на нижней челюсти мыщелка. В метод, описанный здесь выбраны пять регионов MCC, давая в среднем Общая толщина MCC. Исследователь может выбрать для измерения трех различных регионах, или даже одного региона в середине MCC.
   1. С помощью инструмента «длина», Измерьте длину хряща от внешней поверхности до конца толуидиновый синий окрашенных области (рис. 7Б) в пяти регионах, или как много мест как предпочтительный.
   2. Копировать измерения длины из списка «измерения».
      Примечание: Программное обеспечение также предоставляет в среднем измерений (рис. 7Б).
3. Измерьте толуидиновый синий окрашенные области.
   Примечание: В измерении толуидиновый синий окрашенные области, области протеогликана в MCC будет получен.
   1. Выберите инструмент «область» и контур толуидиновый синий окрашенных области (рис. 7C).
   2. Скопировать области измерения из списка «измерения».

Рисунок 7 : Представление протеогликана распределения количественной оценки. (A) использовать линейку гистологические изображения определить устройство, нажав на кнопку «единица» (кружил в красный цвет., блок выбран: 500 мкм). (B) измерения толщины хряща в разных местах, используя средство «Длина» (обведено красным). Сохраните измерения из списка «измерения» в верхней правой панели. Программное обеспечение также предоставляет «статистика» в нижней правой панели, таким образом среднее и SD измерений могут быть получены непосредственно. (C) Измерьте толуидиновый синий окрашенных области с помощью инструмента «область» (обведено красным). Обведите область интересов и сохранить измерение из списка «измерения». Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Описательная статистика были выполнены для изучения распределения морфометрические измерения (длина нижней челюсти, мыщелкового длина, мыщелкового ширина) и гистологический анализ. Результаты были сопоставлены между загруженной группы (то есть, мышей подверга?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Эта рукопись описал методы морфометрические измерения и клеточного анализа мышиных нижнечелюстной мыщелков и мандибулы. Радиографические морфометрические измерения может также использоваться для анализа других костей от небольших экспериментальных животных. Кроме того клеточного...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
MX20 Radiography System	Faxitron X-Ray LLC
Digimizer Image software	MedCalc Software
Shandon Cryomatrix embedding resin	Thermo Scientific	6769006
Manual microscope Axio Imager Z1	Carl Zeiss	208562
yellow fluorescent protein filter  - EYFP	Chroma Technology Corp	49003
cyan fluorescent protein filter - ECFP	Chroma Technology Corp	49001
red fluoresecent protein filter - Cy5	Chroma Technology Corp	49009
sodium acetate anhydrous	Sigma-Aldrich	S2889
sodium L-tartrate dibasic dihydrate	Sigma-Aldrich	228729
sodium nitrite	Sigma-Aldrich	237213
ELF97 substrate	Thermo Fisher Scientific	E6600
ClickiT EdU Alexa Fluor 594 HCS kit	Life Technologies	C10339	includes EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine)
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Thermo Scientific	D1306
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	S3264
Sodium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	71505
Toluidine Blue O	Sigma-Aldrich	T3260
Adobe Photoshop	Adobe Systems Incorporated
Phosphate buffered saline tablets (PBS)	Research Products International	P32080-100T
CNA Beta III Nickel-Free Archwire	Ortho Organizers, Inc.
GraphPad Prism	GraphPad Software, Inc.