Imobilização covalente de proteínas para a espectroscopia de força única molécula

Resumo

Este protocolo descreve a imobilização covalente de proteínas com um heterobifunctional agente de acoplamento silano para superfícies de óxido de silício projetado para a espectroscopia de força força atômica microscopia com base única molécula que é exemplificado a interação de RrgA (adesina pilus-1 ponta de S. pneumoniae) com fibronectina.

Resumo

Nos últimos anos, microscopia de força atômica (AFM) com base em espectroscopia de força única molécula (SMFS) estendida a nossa compreensão das funções e propriedades moleculares. Deu-na oportunidade de explorar uma multiplicidade de mecanismos biofísicos, por exemplo, como bacteriana adesinas se ligam a receptores de superfície de acolhimento mais detalhadamente. Entre outros fatores, o sucesso das experiências SMFS depende a imobilização funcional e nativa das biomoléculas de interesse sobre superfícies sólidas e AFM dicas. Aqui, descrevemos um protocolo simples para o acoplamento covalente de proteínas a superfícies de silício usando silano-PEG-carboxyls e a química N-hydroxysuccinimid/1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimid (CED/NHS) bem estabelecida na ordem para explorar a interação de adesina pilus-1 RrgA de bactéria Gram-positiva Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae), com a matriz extracelular da proteína fibronectina (Fn). Nossos resultados mostram que a superfície functionalization conduz a uma distribuição homogénea de Fn na superfície de vidro e a uma concentração adequada de RrgA na ponta do modilhão AFM, aparente pelo valor alvo de até 20% dos eventos de interação durante SMFS medições e revelou que RrgA vincula a Fn com uma força média de 52 pN. O protocolo pode ser ajustado para o casal através de site específico livre grupos tiol. Isso resulta em uma orientação predefinida de proteína ou molécula e é adequado para outras aplicações biofísicas além as SMFS.

Introdução

Ao lado da pinça óptica e magnética, a força atômica (AFM) de microscópio^1,2 surgiu como uma ferramenta útil para analisar e manipular moléculas e suas propriedades e funções, incluindo a sua resposta à força externa^{3 da sonda ,4}. Em contraste aos métodos como o ensaio de imunoabsorção ligado de enzima (ELISA), surface ressonância plasmon (SPR) ou configurações de cristal de quartzo micro-balança (QCM), AFM permite medir interações sobre a única molécula (SMFS)⁵ e o nível de célula única (SCFS)⁶ . Estas tecnologias renderam insights valiosos sobre mecanismos de ligação como os laços de capturas para a interação de Escherichia coli pilus proteína que fimh com manose⁷, ou o conjunto β-zíper repete formada por proteínas obrigatórias do Fn de S. aureus sobre vinculação a Fn⁸. Fomos recentemente capazes de mostrar que a adesina pilus-1 RrgA^9,10 de bactéria Gram-positiva Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae)¹¹ é capaz de ligar a fibronectina¹² com seus dois domínios terminais. Isto revelou um novo mecanismo de ligação de dois domínios que difere o β-zíper em tandem e pode permitir que piliated pneumococos formar e manter um transiente anfitrião contato para fibronectina contendo superfícies¹³.

O sucesso das experiências SMFS depende criticamente a imobilização funcional e nativa das biomoléculas sobre superfícies sólidas e AFM dicas. Como forças elevadas podem ocorrer durante as medições de SMFS, as proteínas de preferência devem ser covalentemente acopladas à superfície. Há um grande número de métodos diferentes de acoplamento para a imobilização de proteínas e outras biomoléculas, bem como células toda sobre superfícies sólidas (inorgânicas), nano-partículas e outros dispositivos descritos na literatura^{14,15 ,16,17,18,19,20,21,22,23,24, 25,26,27}. Estes protocolos, muitas vezes fazem uso de substâncias perigosas, são difíceis de realizar e/ou exigir equipamento especial (por exemplo, plasma líquido de limpeza). Uma maneira simples de moléculas de casal para vidro é anexar uma espessa camada de polímero de heterobifunctional crosslinkers com um silano-reativo de um lado e um grupo amina-reativa seu outro lado. Dependendo da aplicação, os agentes de acoplamento podem incluir flexíveis cadeias de hidrocarbonetos de comprimento variável, por exemplo., polyethylenglycol (PEG). Eles suprimem interacções não-específicas das superfícies modificadas (por exemplo, hidrofóbicas, eletrostáticas e as interações de van-der-Waals) e podem fornecer a liberdade rotacional da molécula acoplado.

Aqui, descrevemos um protocolo geral para o acoplamento covalente de proteínas contendo um ou mais grupos aminoácidos livres (-NH₂) de vidro, superfícies e nitreto de silício AFM dicas através de um heterobifunctional etoxi silano-PEG-carboxila (-COOH). Este protocolo pode ser usado em experimentos SMFS, que é exemplificado com base na interação de RrgA e proteínas da matriz extracelular Fn (ver Figura 1 para obter uma visão geral).

O primeiro passo é a silanização da superfície^28,29,30,31. Envolve a hidrólise dos grupos etoxi do agente de acoplamento para formar grupos de SiOH altamente reativos. Estas podem reagir com grupos de SiOH no substrato. Em uma condensação primária passo, estas ligações de hidrogênio de forma silanols e espalhe sobre o substrato. Em uma reação de condensação secundária (que geralmente requer calor ou vácuo para remover a água), siloxano ligações são formadas. Isso resulta em uma camada de organo-silano covalentemente ligados.

O segundo passo é o acoplamento das proteínas para o funcional (-COOH) grupos que se estendem da polímero³². Primeiro, o ácido é convertido em um éster de N-hydroxysuccinimid (NHS) reativo intermediário, que é adquirido através do NHS/EDC bem estabelecida (1-etil - 3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimid química³³ e sofre substituição nucleofílica Finalmente formar um vínculo de Amida com aminas primárias sobre as proteínas.

Desta forma, RrgA foi acoplado ao dicas AFM de nitreto de silício e Fn humana para substratos de vidro em uma orientação aleatória e suas forças de interação foram analisadas ao nível da molécula. Nossos resultados mostram que a química de superfície descrita conduz a uma distribuição homogénea de Fn na superfície de vidro e a uma concentração adequada de RrgA na ponta, aparente pelo valor alvo de até 20% dos eventos de interação durante as medições de SMFS. Esta química reduz as interações de fundo específico, está sujeita a alteração pouco durante a aquisição de dados e, portanto, é excelentemente adequada para experimentos SMFS precisos.

Protocolo

1. imobilização de proteínas através de agentes de ligação de silano funcional

Nota: A Figura 1 dá uma visão geral sobre a química de superfície aplicada no presente protocolo.

Atenção: O seguinte protocolo, diferentes produtos químicos corrosivos e de pele irritante propriedades são usados. Usar luvas (ácido-resistente) adequadas, óculos e casaco de laboratório e sob a coifa ao preparar soluções a fim de evitar a inalação de vapores.

1. Functionalization de superfícies de vidro e do cantilever de nitreto de silício com silano, agentes de acoplamento
   1. Remova a poeira grossa e contaminações das lâminas de vidro com isopropanol e precisão de fiapos de toalhetes e os slides de corte no tamanho desejado (opcional).
      Nota: Ao lado do vidro, a superfície sólida pode ser sílica, quartzo e óxidos de alumínio, cobre, estanho, titânio, ferro, cromo, zircônio, níquel e zinco.
      Atenção: As lâminas de corte pode causar bordas afiadas.
   2. O vidro desliza em um frasco de coloração cheio de ácido clorídrico (33% HCl) diluída com água bidestilada (ddH₂O) 3-5% (v/v), fechar o frasco com tampa apropriada e coloque-o em um banho ultra-sônico para 90 min à temperatura ambiente.
      Nota: O frasco utilizado tem um diâmetro de 6 cm e um tamanho aproximado de 65-70 mL. Um volume adequado de HCl diluído para o pote é de 50 mL contendo 5 mL 33% HCl e 45 mL de DDQ₂O. O HCl efetivamente remove íons metálicos não vinculativo, especialmente de sódio, potássio e cálcio e reduz o silício para produzir uma superfície de vidro saturada de hidroxila.
      Atenção: O HCl é corrosivo e irritante da pele. Luvas resistentes a ácidos adequados, óculos de segurança e laboratório casaco e trabalham sob a coifa enquanto se prepara a solução para evitar a inalação de vapores.
   3. Coloque o nitreto de silício AFM do modilhão sondas sobre uma lâmina de vidro limpa com a ponta virada para cima e irradiar com ultra violeta luz de cima pelo menos 90 min.
      Nota: Para a espectroscopia de força única molécula, cantilevers com uma constante de mola nominal de 0,01 a 0,1 N m^-1 são adequados. Irradiação da superfície do cantilever com luz UV irá remover contaminantes orgânicos, principalmente substâncias gordas e renderizá-los hidrófilo em um lado. Se o outro lado está fortemente contaminado - que não deve ser o caso, ou se a consola sondas são usadas frescas fora do caixa dos fornecedores - pode afetar a medição SMFS. Uma limpeza completa do chip modilhão todo usando solução de piranha, que tem sido utilizada em muitos estudos³⁴, pode ajudar.
      Atenção: A luz UV é prejudicial aos olhos; Portanto, irradiação das sondas do cantilever deve proceder em uma câmara impermeável luz de UV. Solução de piranha é altamente reativa e pode queimar a pele, papel e outros materiais orgânicos. Não utilize recipientes plásticos. Se colocados em pratos ou potes mesmo com pequenas quantidades de contaminações superficiais orgânicas (por exemplo, do uso anterior), ele pode reagir rapidamente.
   4. Substituir o ácido clorídrico do frasco de coloração com DDQ₂O sem deixar que a superfície de vidro seco e coloque o frasco em banho de ultra-sons para outro 10 min. substituir a água duas vezes mais para 10 min respectivamente de corretamente lavar o clorídrico ácido.
   5. Entretanto, dissolver o ácido de polietilenoglicol de silano etoxi (ou metoxi) (Si (OC₂H₅)³-PEG-COOH) em uma mistura de etanol e ddH₂O (v/v 95 5%, pH 4.6 ajustado com ácido acético) a uma concentração final de 0,1 mg mL ^-1. Armazene a solução hermeticamente fechada para evitar a evaporação do etanol.
      Nota: Agentes de acoplamento silano são sensíveis à umidade e temperatura. Portanto, eles devem ser armazenados sob gás inerte (N₂), a baixa temperatura (-20 ° C) e sob condições de seca. Antes de abrir o frasco, certifique-se que os silanos chegaram a temperatura para minimizar a hidratação e, assim, passivação de determinados grupos. Agentes de acoplamento Heterobifunctional PEG estão disponíveis com numerosos espaçador de diferentes comprimentos e diferentes grupos funcionais. Para a imobilização aleatória de proteínas através de seus grupos aminoácidos livres (NH₂), conforme descrito no presente protocolo, o grupo funcional adicional para o silano etoxi/metoxi devem ser um éster de NHS. Ao lado a compra de um agente silano com éster do NHS, uma maneira simples de ganhar tal éster de NHS é ativar um grupo carboxila (-COOH) com 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimid (EDC) e NHS (ver 1.2.1. e 1.2.2.).
      Atenção: O etanol é inflamável e irritante da pele. O ácido acético é inflamável e corrosivo. Tome cuidado para não pegar os silanos reativos na pele ou nos olhos. Usar luvas adequadas, óculos e casaco de laboratório e sob a coifa para evitar a inalação de vapores.
   6. Despeje a solução de silano em dois pratos de Petri separado, coloque o preparado do modilhão sondas e corrediças de vidro em uma placa de Petri, respectivamente, selar hermeticamente (por exemplo, parafilm) para evitar a evaporação do etanol e incubar estacionário durante 90 minutos a temperatura ambiente.
      Nota: O tamanho ideal da caixa de Petri depende do número de sondas do cantilever e o tamanho das lâminas de vidro que deve ser acrescida. Um tamanho de diâmetro para bom manuseio e volume de reagente baixa é 50-60 mm. Para evitar indesejáveis de dobra do cantilever enquanto penetrando através da interface de água do ar cantilever deve ser realizada em um ângulo de 90° para a interface ar-água. A incubação das lâminas de vidro (mas não as sondas do cantilever), opcionalmente, pode ser realizada em um agitador orbital.
   7. Lave os slides do cantilever e vidro em três copos consecutivos contendo etanol puro de ser completamente lavado os compostos de silano desacoplado.
      Nota: Para evitar indesejáveis de dobra do cantilever enquanto penetrando através da interface de água do ar, o cantilever deve ser realizado em um ângulo de 90°.
   8. Coloque as lâminas de vidro funcionalizados no frasco do coloração e o cantilever em uma lâmina de vidro limpa e cura a 110 ° C por 30 min.
      Nota: Cura com calor induz a formação de ligações covalentes siloxano e a remoção de água. Como as lâminas de vidro foram apenas acrescidas de um lado, certifique-se de indicar corretamente o lado revestido.
   9. Armazenar as amostras de vidro silanizadas e consola sondas num exsicador de vácuo para uma semana.
      Nota: O protocolo pode ser pausado aqui.
2. Imobilização aleatória das proteínas em cantilever de nitreto de vidro e silicone silanizadas
   Nota: Para evitar indesejáveis de dobra do cantilever, a sonda do cantilever deve ser mantida em um ângulo de 90° enquanto penetrando quaisquer interfaces ar-água.
   1. Prepare uma solução contendo 42 mg mL^-1 de EDC e 20 mg mL^-1 NHS no soro padrão tamponado de fosfato (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 1.8 mM KH₂PO₄, pH 7,4).
      Cuidado: EDC é corrosivo e irritante da pele e pode causar danos oculares graves. Use luvas adequadas, óculos e casaco de laboratório.
   2. Cobrir as lâminas de vidro de silano revestido com a solução e colocar silanizada modilhão sondas em uma gota da solução de EDC/NHS e incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente.
      Nota: Para a incubação das sondas modilhão, caixa original do cantilever é adequada. A jovem proteínas através de seus grupos aminoácidos livres para os carboxyls (-COOH) dos agentes heterobifunctional silano-PEG, o grupo - COOH é ativado com a química EDC/NHS amplamente utilizada. EDC casais NHS ao ácido carboxílico, formando um éster de NHS "estável", que permite eficiente conjugação de aminas primárias no pH fisiológico em um próximo passo.
   3. Enxague os slides do cantilever e vidro completamente com PBS em três copos consecutivos fim Lave completamente a EDC/NHS excessivo.
      Nota: Esta etapa de lavagem é fundamental como proteínas de ligação cruzada de lata EDC/NHS restantes e, assim, alterar a sua funcionalidade.
   4. Incubar as lâminas de vidro ativado com e sondas de cantilever em uma gota da solução da proteína desejada em uma câmara úmida à temperatura ambiente. O tempo de incubação e a concentração de proteína deve ser adaptado para atender aos requisitos do experimento. Em geral, uma concentração entre 0,5 a 1 mg mL^-1 e incubação vezes de 30 min a 2 h são adequados para a maioria das proteínas. No caso de fibronectina (na lâmina de vidro) e proteína pilus-1 ponta RrgA (na consola), uma concentração molar de 1,5 µM e 3 µM, respectivamente e um tempo de incubação de 2 h são suficientes.
   5. Lavar as lâminas de vidro e o cantilever sondas completamente com PBS em três copos consecutivos para lavar as proteínas unbound.
   6. Saturar o éster de NHS restante com tris (hidroximetil)-aminomethan, colocando as pontas de prova em salino tris (TBS; 50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,6) por 20 min em temperatura ambiente.
      Nota: Este passo reduz indesejada acoplamento covalente de proteínas entre a superfície funcionalizada da ponta da AFM e o vidro, porque grupos aminoácidos de Tris podem vincular aos restantes grupos COOH registrados na superfície do cantilever e substrato.
   7. Lavar as lâminas de vidro e cantilever sondas completamente com PBS e loja-los em pratos de Petri separada cobertas de PBS até o uso.
      Nota: As amostras devem ser preparadas na hora e usada no mesmo dia.

2. microscopia de força atômica baseada única molécula espectroscopia de força

Nota: Neste trabalho, um microscópio de força atômica de JPK Instruments foi usado e set ups para obtenção de curvas de força-distância foi definido com o RampDesigner de força.

1. Calibração do cantilever com o ruído térmico método³⁵
   Nota: Para a calibração do cantilever, siga o passo no manual do fabricante. A maioria do modilhão estado fornecedores uma constante aproximada de primavera, que é normalmente calculada da forma nominal do cantilever (comprimento, largura e espessura) e, portanto, não é muito confiável. Como a constante de mola correta é crucial, é aconselhável realizar a calibração do modilhão descrita abaixo em triplicado e usar os valores médios de sensibilidade óptica alavanca e primavera constante. Pode ser útil gravar a deflexão do cantilever em volts (V) durante o experimento e converter a força (pN) em seguida, usando a sensibilidade óptica alavanca e mola constante valores médios. A sensibilidade de alavanca óptica e constante de mola pode ser determinada antes ou após a experiência, enquanto a posição do laser não é alterada em cantilever (a posição do laser refletida pode ser reajustada sobre o fotodiodo).
   1. Corrigir uma lâmina de vidro limpa, fresca no suporte de amostra da AFM e cobri-lo com o tampão PBS.
      Nota: A calibração deve ser efectuada numa superfície dura (por exemplo, vidro) e a mesma reserva como as experiências reais.
   2. Fixar a sonda modilhão preparado o titular do cantilever, coloque-o na cabeça AFM e molhado com cuidado o cantilever com uma gota de tampão PBS.
      Nota: A molhadela do cantilever reduz a tensão superficial aparecendo durante a penetração no buffer PBS sobre a lâmina de vidro de calibração e dobrando-se desse modo indesejável do cantilever.
   3. Mova lentamente o cantilever em direção à superfície de calibração até o cantilever é completamente imerso no buffer PBS, mas ainda longe da superfície de calibração.
   4. Usar o microscópio ótico de vista superior do AFM ou (se disponível) o microscópio invertido debaixo do AFM para posicionar o laser do AFM na parte de trás do cantilever. Lugar perto do fim do cantilever perto onde se encontra a ponta do laser.
      Nota: O ponto do laser deverá situar-se perto do fim do cantilever, mas ainda deve estar completamente em cantilever. Se nenhum microscópio óptico estiver disponível, use um pedaço de papel para diodos laser visível ou um cartão de detector de laser para diodos laser infravermelho, colocá-lo debaixo da cabeça AFM e mover o ponto do laser em direção à borda do modilhão-chip, onde se situam os cantilevers , até que você vê a mancha no detector de papel ou de cartão. Em seguida, mova o laser paralela à borda. Quando a mancha desaparece, é que é um braço do cantilever. Para cantilevers lineares, mova o ponto no final do braço de alavanca, até que ele apareça no detector de papel/cartão e move-lo de volta até que seja novamente sobre o braço de alavanca (desaparece a partir do papel/cartão). Para triangular, coloque o ponto no meio entre dois braços do cantilever e movê-lo no final do cantilever, até desaparecer do papel/cartão. Verifique se você está no meio do cantilever, movendo o ponto perpendicular ao eixo longo do cantilever.
   5. Ajuste a posição do fotodiodo de detector quatro quadrantes do AFM de tal forma que o feixe de laser refletida é posicionado no centro do fotodiodo.
      Nota: Proceda do seguinte modo: Utilize os parafusos de micrômetro perto o diodo detector para mover o diodo na horizontal e no sentido vertical, até que o sinal de soma de todos os quatro quadrantes é maximizado. Em seguida, mover o diodo no sentido vertical, até que o sinal de deflexão vertical é zero e mover o diodo no sentido horizontal, até que o sinal de deflexão lateral é zero. Cantilevers de nitreto de silício geralmente têm um revestimento de ouro e, portanto, um bimetálico com dois diferentes coeficientes de expansão térmica. Isso resulta em uma deriva térmica (aparente no sinal de deflexão vertical) especialmente em solução. Para reduzir essa deriva durante as medições, deixe todo o sistema equilibrar por alguns minutos antes de iniciar a calibração.
   6. Abra o Gerenciador de calibração no software AFM e calibrar a sensibilidade do cantilever e a constante de mola do cantilever com o método de ruído térmico, como segue.
   7. Cuidadosamente, aproximar a superfície do substrato e gravar uma curva força-distância.
   8. Determine a sensibilidade de alavanca óptica em nm/V por encaixe uma linha reta até a parte mais íngreme da curva de força de retração, onde a ponta está em contacto com a superfície do substrato. A sensibilidade permite converter a constante de mola do cantilever para pN/nm.
      Nota: O declive da curva de retração é o piezo viajar distância vs. a mudança na tensão de fotodiodo (medida em nm/V).
   9. Grave vários espectros de ruído térmico do cantilever com o cantilever aproximadamente 100 µm ou mais longe da superfície, a fim de excluir qualquer superfície de amortecimento.
   10. Determine a constante de mola do cantilever em pN/V por um oscilador harmónico fornecido pelo software AFM para os espectros de ruído térmico de encaixe.
   11. Lentamente, retrair o cantilever e retirá-la da solução.
   12. Substituto a superfície de vidro usado para calibração do cantilever com a superfície da amostra contendo as proteínas imobilizadas. Certifique-se de que o cantilever e a superfície da amostra (e, assim, as proteínas) não seque enquanto mudando as lâminas de vidro.
2. Força de interação experiências sobre o nível de proteína única
   1. Mova lentamente o cantilever úmido em direção à superfície da amostra até o cantilever é completamente coberto pelo tampão PBS, mas ainda longe da superfície do substrato.
      Nota: Para reduzir a deriva térmica durante o experimento, deixe todo o sistema definido por alguns minutos antes de iniciar as medições de espectroscopia de força.
   2. Aproximar a superfície e gravar várias curvas de força-distância (≥ 500) em diferentes locais da superfície da amostra, com uma força de contato de pN 250, um tempo de contato de 1 s, um comprimento de retração de 2 µm e uma velocidade de retração de 1 µm s^-1.
      Nota: Para ajustes de espectroscopia de força geral, siga o manual do fabricante. Variações: A velocidade de retração pode ser variada entre 0,1 e 5 µm s^-1 para calcular dados de cinética dependendo da carga de força crescente. O tempo de interação pode ser variado para analisar o reforço de vínculo dependente do tempo. Em vez de manter a velocidade de retração constante, pode-se manter a força constante (forçar modo de braçadeira).
3. Análise de dados
   Nota: A análise dos dados foi realizada utilizando o software de processamento de dados. Dependendo das proteínas imobilizadas, o tempo de contato ou a velocidade de retração, se uma pegada foi incorporada ou não e outros parâmetros variáveis, as curvas de força-distância contêm várias informações diferentes. Interpretação e análise de dados podem variar muito entre diferentes experiências SMFS e, portanto, não podem ser descritos em detalhes aqui. Quanto a interação de RrgA e Fn, o seguinte protocolo pode ser um primeiro passo para a análise dos dados SMFS.
   1. Abra os arquivos de curva de força medidos, selecionando o ícone Open Batch de forçar digitalizar e processar as curvas força-distância da seguinte forma:
   2. Converta a deflexão do cantilever (V) para a força diretamente proporcional (F), selecionando o ícone de (Re) calibrar a V-deflexão por ajuste de sensibilidade e primavera constante .
      Nota: Se o cantilever calibração foi realizada antes do experimento, os valores são salvos nos arquivos de verificação de força e automaticamente são utilizados durante a calibração da V-deflexão. Se a calibração foi realizada após a experiência, o software usa os valores padrão, que podem ser alterados para os valores medidos.
   3. Subtrai a linha de base do canal de retração em uma região da curva força distante da superfície para definir o nível de força zero selecionando o ícone de Subtração da linha de base.
      Nota: Em alguns casos, a retração pode não ter o mesmo valor da força constante e a curva pode apresentar uma inclinação linear, que pode ser removida, selecionando Offset + inclinação.
   4. Defina o ponto onde a ponta entra em contato com a amostra, selecionando o ícone de Determinação de ponto de contato .
   5. Converta o sinal de altura para separação de ponta-amostra selecionando o ícone de Separação de ponta-amostra . Além de subtrair a posição do ponto de contacto, este procedimento subtrai cantilever curvatura para calcular a distância entre a superfície do substrato e AFM de ponta.
      Nota: Para a montagem de modelos de polímero elástico, como o modelo extensível de worm-tipo-corrente e a determinação de comprimentos de interação, é necessária a separação da ponta-amostra, que é corrigida para a dobra do cantilever. Para determinar a taxa de carregamento da inclinação da curva de força e a velocidade de z-piezo de força, as curvas de força não corrigida devem ser usadas.
   6. Tela os traços de força-distância para picos de força ocorrem em comprimentos de ruptura acima de 70 nm (comprimento do espaçador PEG esticado)³⁶ resolver interações inespecíficas e aplicar o modelo extensível de worm-como-cadeia para os picos seleccionados, selecionando o Ícone de caber um modelo de cadeia do polímero e escolheu o Extensible modelo de cadeia do tipo Worm. Os picos na curva de força de retração serão equipados com este modelo, e as forças de ruptura e comprimentos são obtidos, juntamente com os parâmetros elásticos do polímero.
   7. Exiba os dados como histogramas, mostrando as distribuições de força e comprimento. Use pelo menos 100 eventos desvinculação para os histogramas.

Resultados

O protocolo descrito aqui resulta em uma imobilização covalente de proteínas através de suas aminas primárias acessíveis com orientação aleatória (Figura 1). A Figura 2 mostra uma imagem AFM de uma superfície de vidro silanizadas com (esquerda) e sem (à direita) Fn imobilizada, gravado após a desidratação das amostras sob uma ligeira corrente de nitrogênio. A camada de polímero de silano mostra apenas corrugações superfície pequenas com uma altura de aproximadamente 2-5 nm (Figura 2, direita), enquanto na superfície acrescida com Fn, aproximadamente 10 nm alta Fn moléculas são aparente (Figura 2, à esquerda). Em close-ups, a estrutura dimérica do Fn pode ser reconhecida. As moléculas de Fn parecem ser compacto, com uma altura de 4-5 nm acima o revestimento de superfície de PEG e um comprimento de ~ 120 nm (ver inserções).

Para investigar as forças de interação de RrgA com Fn, que recentemente foi descrito detalhadamente por nosso grupo¹³, RrgA foi acoplado a uma ponta AFM de nitreto de silício e Fn humana ao substrato de vidro (Figura 3a). A Figura 3 mostra representativa ponta curvas de separação de amostra da interação do RrgA com Fn gravado a uma velocidade puxa de 1 µm s^-1. A química de superfície utilizada levada a uma interação de baixo fundo e eventos de interação individual (ou duplo) bem formados (Figura 3a), que foram instalados usando um verme extensível como modelo de cadeia (eWLC) (curvas de vermelhos). Plotar os resultados do ajuste (força de ruptura e - comprimento, ver Figura 4) mostra que, após superar a superfície inespecificas entre ponta AFM e substrato e os linkers PEG (> 70 nm), estendendo-se até ~ 19% das curvas força mostrou ruptura eventos com uma ruptura significa forçar para o RrgA - interação de Fn de ~ 52 pN em uma distâncias de ponta-amostra de cerca de 100 nm. Em contraste, uma química de superfície inaplicável (aqui, extinguendo omitido com Tris tamponada salina Figura 3b) apresentará uma avaliação clara dos eventos de interação única devido às interações inespecíficas, múltiplos proteína de ligação (traço 2 e 3) e/ou acoplamento covalente de proteínas entre a superfície da amostra e a ponta do modilhão AFM. Este leva a ruptura alta forças (traço 1) eventualmente acompanhadas de desdobramento dos domínios da proteína (Fn) (traço 4 e 5).

Figura 1: visão geral sobre a química de superfície. A hidrólise de etoxi silano-PEG-carboxila é seguida pela sua condensação na superfície de vidro hidratado e a formação de ligações cruzadas de siloxano. A reação de EDC com os grupos carboxila resulta em um reativo o- acylisourea, um intermediário reativo-amina com uma meia-vida extremamente curta em solução aquosa (hidrólise). O intermediário é estabilizado pela formação de um éster de NHS que sofre substituição nucleofílica para finalmente formar uma ligação Amida com aminas primárias sobre as proteínas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Imobilização de fibronectina em um vidro substrato através de heterobifunctional etoxi silano PEG agente de acoplamento de carboxila. Imagens AFM de vidro funcionalizado superfícies com (esquerda) e sem (direita), nota de rodapé números indicam moléculas individuais de Fn, que são distribuídas homogeneamente na superfície do substrato (inserções). As moléculas adotam uma estrutura dimérica e compacta, com uma altura de 4-5 nm acima o PEG revestimento e um comprimento de > 100 nm. Isto assemelha-se a estrutura da Fn em solução e é consistente com os dados anteriores AFM em outras superfícies, por exemplo, mica (barra de escala de embutimentos = 500 nm)³⁷. Abaixo o AFM imagens são perfis de altura ao longo das linhas indicadas nas imagens de AFM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: ilustração de um experimento SMFS e representante forçar curvas de distância da RrgA - interação de Fn. (a) RrgA e Fn foram ligados covalentemente através de silano etoxi heterobifunctional PEG agente de acoplamento carboxila de um AFM de nitreto de silício do modilhão dica e uma superfície de vidro, respectivamente. Representante SMFS forçar distância curvas obtidas para RrgA - interação de Fn a uma velocidade de retração de 1 µm s^-1 com a imobilização descrita de RrgA e Fn são mostradas. As curvas vermelhas representam o fits extensível tipo worm cadeia aplicado para obter forças de ruptura e comprimentos. A figura foi modificada de Becke, et al, 2018 ACSnano¹³. (b) representante SMFS forçar curvas distância obtidas para o RrgA - interação de Fn sem têmpera com Tris-buffered salina. Neste caso, a amina primária de Tris estava ausente para que o restante ativo ésteres NHS foram deixados insaturados durante o experimento. Isto levou à proteína multi ligação (traço 2 e 3) e a fixação de proteínas entre a superfície e a ponta AFM que resultou na ruptura alta força domínio acompanhados (Fn-) desdobramento (rastreamento 1, 4 e 5; Observe as diferentes escalas). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: distribuição de força e comprimento de RrgA único - interações Fn. Ruptura força e correspondente histogramas de comprimento de ruptura obtidas de RrgA - medições de interação Fn SMFS (n = 1400) a uma velocidade de retração de 1 µm s^-1. Os histogramas revelam um mais provável ruptura força f_MP de 51.6 pN (Gauss caber, linha preta) e um acúmulo de comprimentos de ruptura em torno de 100 nm. A figura foi modificada de Becke, et al, ACSnano, 2018¹³. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Desde a introdução do AFM baseado SMFS, evoluiu para uma técnica amplamente utilizada para sondar diretamente intra e intermoleculares forças de individuais de proteínas, ácidos nucleicos e outras biomoléculas^3,4,5. Para experiências bem sucedidas de SMFS, uma superfície adequada estratégia de acoplamento é um pré-requisito. Para sondar as forças intramoleculares em polímeros naturais e sintéticos, os polímeros podem ser acoplados diretamente à superfície do substrato e AFM dica^{36,38,39,40,41}. Para a investigação de interações inter moleculares, tais como ligações moleculares, no entanto, é aconselhável a utilização de moléculas de vinculador flexível como hetero-bifuncional PEG linkers, ou as correntes do polypeptide, anexar os parceiros de interação para a ponta AFM e o superfície do substrato, para permitir a orientação correta dos parceiros vinculação, para superar as forças de superfície de curto alcance e evitar a desnaturação e desdobramento de proteínas^{21,22,23, 24,25,26,},^27,42. Portanto, descrevemos um protocolo simples e direta para a imobilização covalente de proteínas através de suas aminas primárias acessíveis usando espaçadores de PEG hétero-bifuncional.

Temos demonstrado sua aplicabilidade com a investigação da interação forças entre adesina RrgA de S. pneumoniae e a proteína da matriz extracelular Fn, como recentemente descrito em detalhe em outro lugar¹³.

A química de superfície é bem estabelecida e abordagens analisadas e similares têm sido utilizadas com sucesso em vários SMFS experimentos^19,42,,^43,44,45. O silylether utilizado para acoplamento do polímero de silano na superfície, está sujeita a hidrólise. O grau de hidrólise depende da quantidade de títulos de siloxano formado, o que pode ser controlado durante o processo de silanização. Se forças de interação alta (≥ 1000 pN) são esperadas durante as medições de SMFS, a silanização deve ser realizada através do vapor-fase deposição³⁰ que resulta na formação de uma camada contínua de siloxanos. Quanto a muitas experiências (por exemplo, muitas proteínas – interações da proteína), as forças de interação estão na faixa de uns cem pN e o procedimento descrito, na qual siloxano formação é realizada pela deposição de uma fase aquosa e desassociada organo-silanos são cuidadosamente lavado com etanol (etapa 1.1.7), seguido de fotopolimerização com calor (etapa 1.1.8), é suficientes.

Outro passo crítico é para lavar o restante EDC e moléculas de NHS fora da superfície (etapa 1.2.3), como as sobras conduzirá à ativação de grupos carboxila sobre as proteínas. Isto pode de qualquer resultado na reticulação de proteínas na mesma superfície, que pode alterar a sua funcionalidade ou covalentemente casal ativado proteínas a outras proteínas na superfície oposta. Isso pode levar à fixação das proteínas entre a superfície e a ponta AFM, que resulta em ruptura alta forças eventualmente acompanhadas de desdobramento do domínio (ver Figura 3b, rastreamento de 1, 4 e 5, desdobramento de domínios Fn)⁴⁶. O mesmo problema pode ocorrer, se os ésteres de NHS ativos do espaçador de PEG são deixados insaturados. Portanto, a incubação com soro fisiológico Tris em buffer é recomendável (etapa 1.2.6), como a amina primária de Tris sacia os grupos restantes de aminoácidos reativos.

Seguindo o protocolo gradual leva a uma distribuição homogénea das Fn no vidro silanizadas de superfície (ver Figura 2), deixando uma forma dimérica da proteína. Isto assemelha-se a estrutura de Fn´s em solução e é consistente com os dados anteriores AFM em outras superfícies de amostra³⁷. Além disso, uma concentração adequada de RrgA na ponta AFM é obtida, o que gera um valor-alvo de ~ 20% dos eventos de interação bem definidas durante as medições de SMFS (Figura 3 e Figura 4). Outra maneira elegante para controlar a quantidade de moléculas acoplado à ponta de substrato e cantilever com amostra além variando os tempos de concentração e/ou incubação de proteína, é a combinação de silano-agentes com diferentes grupos de funcionais secundários. Alterando a proporção dos grupos reativo proteína, estendendo-se desde o PEG-polímero, o número de proteínas imobilizadas pode ser controlada^15,16,17,18.

O protocolo descrito aqui também pode ser usado para imobilizar outras moléculas contendo de₂ -NH ou ser ajustados às proteínas par a outra superfície de óxido de silício, além de nitreto de vidro e silicone. Dependendo do design de proteína, o grupo carboxila reativas amina pode ser alterado para um grupo sulfidrila reativos (por exemplo, maleimide ou orto-pyridyl dissulfeto) para acoplar a proteína através de seu livre – grupos SH. Para Fn, isso resulta em uma orientação predefinida^13,17,20.

Em resumo, este protocolo pode ser ajustado para atender diferentes necessidades e é adequado para outras aplicações biofísicas além de experimentos de espectroscopia de força única molécula.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material
2-Propanol	Carl Roth	6752
1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide	Sigma-Aldrich	03450	EDC
Acetic acid	Carl Roth	3738	100 %; analytical purity
Doubly distilled water
Ethanol	Carl Roth	9065	≥ 99.8 %; analytical purity
Ethoxy silane polyethylene glycol acid	Nanocs	PG2-CASL-5k	5 kDa; COOH-PEG-Si(OC2H5)3
Hydrochloric acid	Carl Roth	X896	32 %
N-Hydroxysuccinimid	Merck	804518	NHS; for synthesis
Phosphate Buffered Saline - Dulbecco	Biochrom	L1825	PBS
Probe molecule e.g. Fibronectin, human plasma	Sigma-Aldrich	F1056
Probe molecule e.g. RrgA			Produced in laboratory
Sodiumchlorid	Carl Roth	9265	NaCl
Tris(hydroxymethyl)-aminomethan	Carl Roth	AE15	≥ 99,3 %; TRIS; Buffer Grade
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Beakers
Glass cutter
Glass slides	Carl Roth	0656
Inert gas desiccator	Sicco
Inverted Microscope - Zeiss Axiovert 200	Zeiss
JPK NanoWizard 1	JPK Instruments
JPK NanoWizard SPM and DP software	JPK Instruments
Laboratory oven	Binder
Magnetic stirrer	IKA
Micro spatula
Microcentrifuge tubes
Microsoft Excel	Microsoft
Parafilm M	Brand	701606
Petri dishes
pH-meter	Knick
Pipettes	Starlab		10-100 µl, 50-200 µl, 100-1000 µl
Precision balance	Acculab
Silicon nitride cantilever - MLCT	Bruker AXS S.A.S		Spring constant ≤ 100 pN/nm
Sonication bath	Bandelin
Staining jar
Stereo microscope - Zeiss Stemi	Zeiss
Stir bar
Kimtech science precision wipes	Kimberly-Clark
Twezzers
UV PenRay	UVP, LLC	90-0012-01	Mercury spectrum with the primary energy at 254 nm
Vacuum desiccator
Vacuum pump
Vortex mixer	VWR
Weighing paper	Carl Roth	TP64