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요약

이 프로토콜에 설명 합니다 heterobifunctional 실 란 커플링 에이전트와 원자 힘 현미경 검사 법 기반 단일 분자 힘 분광학을 위한 실리콘 산화물 표면에 의해 궁 행 되는 단백질의 화학식 동원 정지는 RrgA의 상호 작용 (pilus-1 팁 adhesin의 S. 균) fibronectin 함께.

초록

최근 몇 년 동안, 원자 힘 현미경 (AFM) 단일 분자 힘 분광학 (SMF) 분자 속성 및 기능에 대 한 우리의 이해를 확장을 기반으로. 그것은 우리에 게 자세히 호스트 표면 수용 체에 어떻게 세균 adhesins 바인딩 생물 메커니즘, 예를 들면의 다양성을 탐구 하는 기회를 주었다. 다른 요인 들 중 고체 표면 및 AFM 팁에 대 한 관심의 생체의 기능 및 기본 immobilization SMF 실험의 성공에 의하여 달려 있다. 여기, 우리가 순서로 silane-말뚝-carboxyls와 잘 설립 N-hydroxysuccinimid/1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimid (EDC/NHS) 화학을 사용 하 여 실리콘 표면에 단백질의 공유 결합에 대 한 간단한 프로토콜 설명 에 세포 외 기질 단백질 fibronectin (Fn)와 그람 양성 박테리아 구 균 (S. 균)에서 pilus-1 adhesin RrgA의 상호 작용을 찾아보기. 우리의 결과 표면 기능화 리드 유리 표면에 균일 분포 Fn SMF 중 상호 작용 이벤트의 최대 20%의 대상 값에 의해 명백한 AFM 캔틸레버 끝에 RrgA의 적절 한 농도를 보여합니다 측정 계시 RrgA 52 pN의 평균 힘 Fn에 바인딩합니다. 프로토콜 몇 사이트를 통해 특정 무료 thiol 그룹을 조정할 수 있습니다. 이 미리 정의 된 단백질 또는 분자 방향 귀착되 고 SMF 외 다른 생물 응용 프로그램에 대 한 적합 합니다.

서문

광학 및 자기 핀셋, 옆에 원자 힘 현미경 (AFM)1,2 유용한 도구를 분석 하 고 분자 조작으로 떠오르고 있다 및 그들의 속성 및 기능, 외부 힘3에 그들의 응답을 포함 하 여 조사 ,4. 반면 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA) 같은 방법, 표면 플라스몬 공명 (SPR) 또는 석 영 크리스탈 중량 (QCM) 설정, AFM 수 단일 분자 (SMF)5 및 단일 셀 수준 (SCFS)6에 상호 작용을 측정 하 . 이러한 기술은 나왔고 캐치 채권 S. 구 균에서에서 Fn 바인딩 단백질에 의해 형성 된 대장균 pilus 단백질만 노 오 스7, 또는 협동 β-지퍼 FimH 반복의 상호 작용에 대 한 발견 처럼 바인딩 메커니즘에 대 한 값진 통찰력 바인딩 Fn8시. 최근 pilus-1 adhesin RrgA9,10 그람 양성 박테리아 구 균 (S. 균)11 에서 fibronectin12 에 바인딩할 수는 보여줄 수 있었습니다. 와 그것의 2 개의 터미널 도메인. 이 새로운 2-도메인 바인딩 메커니즘을 탠덤 β-지퍼에서 다른 고 수 있습니다 형성 하 고 유지 과도 fibronectin 포함 된 연락처 호스트 표면13piliated pneumococci는 밝혔다.

SMF 실험의 성공을 비판적으로 고체 표면 및 AFM 팁에 생체의 기능 및 기본 동원 정지에 따라 달라 집니다. 높은 힘 SMF 측정 하는 동안 발생할 수 있습니다, 단백질 해야 선호 covalently 결합 표면에. 많은 단백질 등의 생체는 물론 (무기) 고체 표면, 나노 입자와 문학14,15에서에서 설명 하는 다른 장치에 전체 셀의 동원 정지에 대 한 다른 연결 방법 ,16,17,18,19,20,,2122,23,24, 25,,2627. 이러한 프로토콜은 자주 확인 유해 물질의 사용, 수행 및 특수 장비 (예를 들어, 플라즈마 클리너)를 필요로 하기 어렵습니다. 한쪽에 silane 반응 그룹 및 그들의 다른 쪽에는 아민 반응 그룹 heterobifunctional crosslinkers의 두꺼운 폴리머 레이어를 연결할 몇 분자 유리를 하는 간단한 방법이입니다. 어플리케이션, 커플링 에이전트 가변 길이, 예의 유연한 하이드로-탄소 사슬을 함유 할 수 있다., polyethylenglycol (나무 못). 그들은 수정 된 표면 (예를 들어, 소수 성, 정전기 그리고 van der Waals 상호 작용)의 일반적인 상호 작용을 억제 하 고 결합 된 분자 회전 자유를 제공할 수 있습니다.

여기, 우리는 공유 결합을 포함 하는 하나 이상의 무료 아미노 그룹 단백질의 일반적인 프로토콜 설명 (-NH2) 유리를 표면 및 실리콘 나이트 라 이드 AFM 팁 통해 는 heterobifunctional ethoxy silane 못 carboxyl (-COOH). 이 프로토콜은 RrgA와 세포 외 기질 단백질 Fn의 상호 작용에 따라 궁 행 하는 SMF 실험, 사용할 수 있습니다 (에 대 한 개요 그림 1 참조).

첫 번째 단계는 표면28,29,,3031의 silanization 이다. 그것은 반응성이 매우 높은 SiOH 그룹을 형성 하기 위하여 커플링 에이전트의 ethoxy 그룹의 가수분해를 포함. 이 기판에 SiOH 그룹으로 반응 수 있습니다. 기본 응축에, 이러한 silanols 양식 수소 결합을 기판에 확산 있습니다. (요구 하는 일반적으로 열 또는 물을 제거 하는 진공) 보조 응축 반응, 실록 산 결합 형성 된다. Covalently 연결 된 유기 실 란 계층 결과.

두 번째 단계는 단백질 기능을 결합 (-COOH) 폴리머32에서 확장 하는 그룹. 첫째, 산 성은 반응 N-hydroxysuccinimid (NHS) 에스테 르 중간, 기초가 튼튼한 보 건국/EDC를 통해 얻은 변환 됩니다 (1-에틸-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimid 화학33 및 대체를 겪 습 및 마지막으로 단백질에 1 차 아민과 아 미드 유대를 형성 한다.

이 방법에서는, 실리콘 질 화물 AFM 팁 및 무작위 방향에서 유리 기판에 인간의 Fn RrgA 결합 했다 그리고 그들의 상호 작용 힘 단일 분자 수준에서 분석 했다. 우리의 결과 설명된 표면 화학은 유리 표면에 균일 분포 Fn SMF 측정 중 상호 작용 이벤트의 최대 20%의 대상 값에 의해 명백한 끝에 RrgA의 적절 한 농도를 보여 줍니다. 이 화학 일반적인 배경 상호 작용을 감소, 데이터 수집 기간 동안 작은 변경 적용 이며 따라서 무척 정확한 SMF 실험에 적합.

프로토콜

1. 기능성 실 란 커플링 에이전트를 통해 단백질의 동원 정지

참고: 그림 1 통해 표면 화학이이 프로토콜에 적용 한 개요를 제공 합니다.

주의: 다음 프로토콜에서 부식성과 속성을 자극 하는 피부와 다른 화학 물질 사용 됩니다. 적절 한 (산 성) 장갑, 안전 고글, 및 실험실 외 투를 착용 하 고 증기의 흡입을 방지 하기 위해 솔루션을 준비 하는 동안 증기 두건에서 작동.

  1. 유리 표면과 실 란 커플링 에이전트와 실리콘 나이트 라 이드 캔틸레버의 기능화
    1. 거친 먼지를 제거 하 고 소 프로 파 놀과 보풀 정밀 유리 슬라이드에서 오염 물티슈 고 슬라이드에 원하는 크기 (선택 사항).
      참고: 옆에 유리, 단단한 표면 수 실리 카, 석 영, 알루미늄, 구리, 주석, 티타늄, 철, 크롬, 지르코늄, 니켈, 그리고 아연의 산화물.
      주의: 유리 슬라이드를 절단 날카로운 모서리를 발생할 수 있습니다.
    2. 장소 얼룩 항아리에 슬라이드 유리 염 산으로 가득 (33 %HCl) 이중 증류수 (ddH2O) 3-5% (v/v)을 희석, 적절 한 뚜껑과 항아리 닫고 실 온에서 90 분 동안 초음파 목욕에.
      참고: 사용된 항아리는 6 cm의 직경 및 65-70 mL의 대략적인 크기. 병에 대 한 희석된 HCl의 적절 한 볼륨 50 mL 5 mL를 포함 하는 33 %HCl ddH2오 45 mL HCl은 효과적으로 비 바인딩 금속 이온, 특히 나트륨, 칼륨 및 칼슘을 제거 하 고 실리콘 수 포화 유리 표면 생성 하기 위하여 감소 시킨다.
      주의: HCl은 부식성과 피부 자극. 적절 한 부식 방지 장갑을 착용, 안전 고글과 실험실 코트와 증기의 흡입을 방지 하기 위해 솔루션을 준비 하는 동안 증기 두건에서 작동.
    3. 실리콘 나이트 라 이드 AFM 팁을 위쪽으로 향하게 깨끗 한 유리 슬라이드에 프로브를 외팔보와 울트라 바이올렛 적어도 90 분 위에서 빛을 비추는 장소.
      참고: 단일 분자 힘 분광학에 대 한 공칭 스프링 상수 0.01 0.1 N m-1 의 캔틸레버는 적당 하다. 캔틸레버 표면 자외선과 방사선, 주로 지방 물질, 유기 오염 물질을 제거 하 고 한쪽에 친수성 렌더링 것 이다. 다른 쪽이 무 겁 게 오염-어떤 경우에, 해서는 안 또는 SMF 측정에 영향을 미칠 수 있습니다 외팔보 프로브는 공급자의 상자-신선한를 사용 하는 경우. 많은 연구34에서 사용 되었습니다, 피 솔루션을 사용 하 여 전체 외팔보 칩의 철저 한 정리에 도움이 될 수 있습니다.
      주의: UV 라이트는 눈; 따라서, 외팔보 감지기의 방사선 조사는 UV 빛 불 침투성 챔버에 밖으로 실행 되어야 한다. 피 라 솔루션 반응성이 매우 높은 이며 피부, 종이 및 다른 유기 물질을 구울 수 있습니다. 플라스틱 용기를 사용 하지 마십시오. 요리 또는 적은 양의 유기 표면 오염 (예를 들어, 이전 사용에서) 함께 항아리에 배치 하는 경우 빠르게 반응할 수 있습니다.
    4. DdH2O 유리 표면 건조 하 고 다시 다른 10 분에 대 한 초음파 목욕에에서 항아리를 배치 시키기 없이 얼룩 항아리에 염 산 대체 물 두 번 더는 염 제대로 씻어 각각 10 분 교체 산입니다.
    5. 한편, ethoxy (또는 methoxy) 실 란 폴 리 에틸렌 글리콜 산을 녹 (Si (OC2H5)3-말뚝-COOH) (v/v 95% / 5%, pH 4.6 초 산 조정) 에탄올과 ddH2O의 혼합물에서 0.1 mg mL의 최종 농도에 -1. 에탄올의 증발을 방지 하기 위해 밀폐 봉인 솔루션을 저장 합니다.
      참고: 실 란 커플링 에이전트 습기와 온도에 민감합니다. 따라서, 그들은 저장 되어야 한다 불활성 가스 (N2), 아래에 낮은 온도 (-20 ° C) 및 건조 조건 하에서. 플라스 크를 열기 전에 실 화를 최소화 하기 위해 실내 온도 도달 했습니다 있는지 확인 함으로써 반응 그룹의 패 시 베이 션. Heterobifunctional 말뚝 커플링 에이전트 수많은 다른 기능 그룹 및 다른 공백 길이 함께 사용할 수 있습니다. 통해 단백질의 무작위 동원 정지에 대 한 그들의 무료 아미노 그룹 (NH2),이 프로토콜 기능 그룹 ethoxy/methoxy silane에 추가에 설명 된 대로 NHS 에스테 르 이어야 합니다. NHS 에스테 르 silane 에이전트의 구입, 옆에 같은 NHS 에스테 르를 얻을 수 있는 간단한 방법이 carboxyl 그룹을 활성화 하는 (-COOH)와 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimid (EDC) 및 보 건국 (1.2.1 참조. 및 1.2.2.).
      주의: 에탄올은 인화성 및 피부 자극. 아세트산은 가연성 및 부식성. 반응 실 피부 또는 눈에를 얻을 수 없는 주의. 적절 한 장갑, 보안 경 및 실험실 외 투를 착용 하 고 증기의 흡입을 방지 하기 위해 증기 두건에서 작동.
    6. 두 개의 별도 접시에 실 란 솔루션을 부 어, 1 개의 페 트리 접시에 준비 된 캔틸레버 프로브 및 유리 슬라이드를 각각 장소, 밀폐 봉인 (예를 들어, parafilm) 에탄올의 증발을 방지 하 고 90 분에 대 한 문구를 품 어 방 온도입니다.
      참고: 페 트리 접시의 최적의 크기 외팔보 프로브 수와 functionalized 해야 유리 슬라이드의 크기에 따라 달라 집니다. 좋은 처리 및 낮은 시 볼륨에 대 한 직경 크기 50-60 m m 이다. 않도록 원치 않는 캔틸레버의 캔틸레버는 공기 물 인터페이스를 통해 침투 하는 동안 공기-물 인터페이스를 90 ° 각도에서 개최 한다. 유리 슬라이드 (하지만 하지 외팔보 프로브)의 외피 궤도 셰이 커에 선택적으로 실시 수 있습니다.
    7. 완전히 언바운드 silane 화합물을 씻어 순수 에탄올을 포함 하는 3 연속 비 커에 캔틸레버와 유리 슬라이드를 씻어.
      참고: 않도록 원치 않는 캔틸레버의 공기 물 인터페이스를 통해 침투 하는 동안, 캔틸레버는 90 ° 각도로 붙들어 야 한다.
    8. 착 색 병에 깨끗 한 유리 슬라이드와 30 분 동안 110 ° C에서 치료에 외팔보 기능성된 유리 슬라이드를 놓습니다.
      참고: 공유 실록 산의 형성과 물의 제거 유도 열 치료 합니다. 유리 슬라이드 했다만 기능성 1 개의 측에, 확인 제대로 코팅된 면을 나타냅니다.
    9. Silanized 유리 샘플을 저장 하 고 최대 1 주일 동안 진공 desiccator에 프로브를 외팔보.
      참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기.
  2. Silanized 유리 및 실리콘 나이트 라 이드 캔틸레버에 단백질의 무작위 동원 정지
    참고: 않도록 원치 않는 캔틸레버의, 외팔보 조사 해야 개최 90 ° 각도에서 모든 공기-물 인터페이스를 관통 하는 동안.
    1. 솔루션 포함 42 mg mL-1 edc와 20 mg mL-1 보 건국 버퍼링 표준 인산 염 (PBS, 137 mM NaCl, 2.7 m m KCl, 10mm 나2HPO4, 1.8 m m KH2포4, pH 7.4)에 준비 합니다.
      주의: EDC 부식성과 피부 자극 이며 심각한 눈 손상 될 수 있습니다. 적절 한 장갑, 안전 고글과 실험실 코트를 착용.
    2. 솔루션 실 란 코팅 된 유리 슬라이드를 커버 하 고 silanized 외팔보 프로브 EDC/NHS 솔루션의 한 방울 넣어 실 온에서 10 분 동안 품 어.
      참고: 외팔보 감지기의 보육에 대 한 원래 외팔보 상자는 적당 하다. carboxyls을 그들의 자유 아미노 그룹 단백질 을 통해 몇 가지를 (-COOH) heterobifunctional silane 못 에이전트의-COOH 그룹 널리 EDC/NHS 화학으로 활성화 됩니다. EDC는 다음 단계에서 생리 적 pH에서 1 차 아민을 효율적인 활용을 가능 하 게 "안정" NHS 에스테 르 형성 carboxylic 산에 보 건국 커플.
    3. 린스 철저 하 게 PBS와 캔틸레버와 유리 슬라이드 3 연속 비 커에 완전히 과도 한 EDC/NHS 떨어져 세척 하기 위하여.
      참고:이 세척 단계 나머지 EDC/NHS 수 crosslink 단백질 만큼 중요 하 고 그로 인하여 그들의 기능을 변경.
    4. 와 활성화 된 유리 슬라이드를 품 어 고 실 온에서 젖은 챔버에 원하는 단백질 해결책의 물방울에 캔틸레버 프로브. 단백질 농도 및 부 화 시간 실험의 요구 사항에 맞게 적응 해야 합니다. 일반적으로, 0.5 ~ 1 mg mL-1 과 보육 시간 30 분에서 2 시간 사이 농도 대부분 단백질에 적합 합니다. (유리 슬라이드)에 fibronectin 및 pilus-1 팁 단백질 RrgA (캔틸레버)에, 1.5 µ M와 3 µ M의 어 금 니 농도 각각, 2 h의 부 화 시간이 있으며 충분 한.
    5. 유리 슬라이드를 세척 하 고 캔틸레버 조사 철저 하 게 3 연속 비 커에 PBS를 가진 언바운드 단백질 떨어져 세척 하기 위하여.
    6. 나머지 NHS 에스테 르 트리 스 (hydroxymethyl) 포화-tris 버퍼 염 분 (TBS, 50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.6) 실 온에서 20 분에 프로브를 배치 하 여 aminomethan.
      참고:이 단계 감소 AFM 팁의 기능성된 표면 사이의 유리, 단백질의 원치 않는 공유 결합 때문에 트리 스 아미노 그룹 캔틸레버와 기판 표면에 남은 활성화 COOH 그룹에 바인딩할 수 있습니다.
    7. 유리 슬라이드를 세척 하 고 캔틸레버 PBS와 별도 접시에 그들 사용까지 PBS에 덮여가 철저 하 게 조사.
      참고: 샘플 갓 준비 해야 하 고 같은 날 사용.

2. 원자 힘 현미경 기반 단일 분자 힘 분광학

참고:이 작품에서 JPK 악기에서 원자 힘 현미경 사용 되었다 세트 강제로 RampDesigner로 정의 했다 힘 거리 곡선을 얻기 위한 업.

  1. 캔틸레버 교정 열 잡음 방법35
    참고: 외팔보 교정 단계는 제조업체의 설명서에 따릅니다. 대부분 외팔보 공급 업체 상태는 대략적인 스프링 상수는 일반적으로 공칭 외팔보 모양 (길이, 폭, 두께)에서 계산 되 고 매우 신뢰할 수 있다 그러므로. 정확한 스프링 상수 결정적으로, 3 중에 아래 설명 된 캔틸레버 교정 수행 광학 레버 감도의 평균 값을 사용 하 고 상수 봄 적당 하다. 그것은 볼트 (V)에 외팔보 편향 실험 및 변환 (pN) 나중에, 광학 레버 감도 사용 하 여 강제로 상수 봄을 값을 의미 하는 동안 기록 유용할 수 있습니다. 봄 상수 및 광학 레버 감도 (반사 레이저의 위치는 광다이오드에 재조정 될 수 있습니다) 하는 캔틸레버에 레이저 위치는 변경 되지 않습니다 하기 전에 또는 실험 후 확인할 수 있습니다.
    1. AFM 샘플 홀더에 깨끗 하 고 신선한 유리 슬라이드를 수정 하 고 PBS 버퍼와 그것을 커버.
      참고: 보정 (예를 들어, 유리) 하드 표면에와 실제 실험으로 동일한 버퍼에 밖으로 실행 되어야 한다.
    2. 캔틸레버 홀더에 준비 된 캔틸레버 프로브를 수정, AFM 머리에 고 PBS 버퍼의 드롭 캔틸레버를 신중 하 게 젖은.
      참고: 캔틸레버의 일로 교정 유리 슬라이드와 캔틸레버의 그로 인하여 바람직하지 않은 절곡에 PBS 버퍼에 침투 하는 동안 나타나는 표면 장력을 감소 시킨다.
    3. 캔틸레버 완전히 하지만 여전히 교정 표면에서 PBS 버퍼에 잠기 다 때까지 천천히 외팔보 교정 표면 쪽으로 이동 합니다.
    4. AFM의 상위 뷰 광학 현미경을 사용 하 여 (가능한 경우) 또는 거꾸로 한 현미경 AFM 캔틸레버의 뒷면에 레이저 AFM의 위치를 아래. 레이저 팁이 있는 곳 가까이 캔틸레버의 끝 근처 자리 배치 합니다.
      참고: 레이저 자리는 캔틸레버의 끝 가까이 위치 해 있어야 하지만 그것은 아직도 완전히 캔틸레버에 있어야 한다. 없는 광학 현미경을 사용할 수 있는 경우 한 장의 종이 사용 하 여 보이는 레이저 다이오드 또는 적외선 레이저 다이오드 레이저 탐지기 카드, AFM 머리 아래 넣고 캔틸레버 있는 외팔보 칩의 가장자리 쪽으로 레이저 자리 이동 종이 또는 검출기 카드에 자리를 볼 때까지. 다음 레이저 가장자리에 평행 하 게 이동 합니다. 자리 사라지면 그것은 캔틸레버 팔 에입니다. 선형 캔틸레버에 대 한 종이/검출기 카드에 이동 될 때까지 다시 (종이/카드에서 사라집니다) 레버 팔에 다시 나타날 때까지 레버 팔의 끝 쪽으로 자리를 이동 합니다. 대 한 삼각형, 캔틸레버의 두 팔 사이 중간에 자리를 배치 하 고, 캔틸레버의 끝으로 이동 하는 종이/카드에서 사라질 때까지. 캔틸레버 중간 자리 수직 캔틸레버의 긴 축에 이동 하 여 확인 하십시오.
    5. 반사 레이저 빔 광다이오드의 중앙에 배치 되는 방식에 AFM의 4 개의 사분면 검출기 광다이오드의 위치를 조정 합니다.
      참고: 다음을 수행: 검출기 다이오드 근처 마이크로미터 나사를 사용 하 여 모든 4 개의 사분면에서 합계 신호 최대화 될 때까지 다이오드 수평 및 수직 방향으로 이동. 다음 다이오드 수직 방향, 수직 편향도 신호를 0 때까지 이동 다이오드 수평 방향으로 측면 편향 신호는 0이 될 때까지. 실리콘 나이트 라 이드 캔틸레버 일반적으로 골드 코팅 되며 따라서 바이메탈 열 확장의 2 개의 다른 계수와. 이 솔루션에서 특히 열 드리프트 (수직 편향도 신호에 명백한) 결과. 측정 하는 동안이 드리프트를 줄이기 위해, 보정을 시작 하기 전에 몇 분 동안 equilibrate 전체 시스템을 보자.
    6. AFM 소프트웨어에서 교정 관리자를 열고 열 잡음 방법 외팔보 감도 캔틸레버의 스프링 상수를 다음과 같이 보정 합니다.
    7. 조심 스럽게 기판 표면에 접근 하 고 힘 거리 곡선을 기록 합니다.
    8. 팁 기판 표면 접촉은 피팅 철회 힘 곡선의 가파른 부분을 직선으로 nm/v에서 광학 레버 감도 결정 합니다. 감도 pN/nm 외팔보 스프링 상수를 변환할 수 있습니다.
      참고: 철회 곡선의 기울기는 압 전 여행 거리 대는. (nm/V에서 측정 되는) 포토 다이오드 전압의 변화.
    9. 어떤 표면 댐핑을 제외 하기 위해 표면에서 캔틸레버 약 100 µ m 이상의 캔틸레버의 여러 열 잡음 스펙트럼을 기록 합니다.
    10. 열 잡음 스펙트럼을 AFM 소프트웨어에서 제공 하는 고조파 발진기를 피팅 하 여 pN/V에서 캔틸레버의 스프링 상수를 확인 합니다.
    11. 천천히 캔틸레버를 철회 하 고 솔루션에서 그것을 철회.
    12. 대체 유리 표면 고정된 단백질을 포함 하는 샘플 표면 외팔보 캘리브레이션에 사용 합니다. 있는지 확인 캔틸레버와 샘플 표면 (고 단백질) 유리 슬라이드를 변경 하는 동안 건조 하지 마십시오.
  2. 상호 작용 강제로 단일 단백질 수준에 대 한 실험
    1. PBS 버퍼에 의해 하지만 여전히 기판 표면에서 캔틸레버 완전히 덮여 때까지 서서히 촉촉한 외팔보 샘플 표면 쪽으로 이동 합니다.
      참고: 실험 기간 동안 열 드리프트를 줄이기 위해, 전체 시스템 힘 분광학 측정을 시작 하기 전에 몇 분 동안 설정 하자.
    2. 표면에 접근 하 고 기록 250 pN의 접촉 힘으로 샘플 표면의 서로 다른 위치에 여러 개의 힘 거리 곡선 (≥ 500) 1의 연락처 시간 s, 2 µ m의 철회 길이 1 µ m s-1의 수 축력 속도.
      참고: 일반적인 힘 분광학 조정에 대 한 제조업체의 따라. 유사: 철회 속도 수 수 변화 0.1 5 µ m s-1 사이 증가 힘 부하에 따라 kinetical 데이터를 계산 하. 상호 작용 시간 시간 종속 유대 강화를 분석 하는 다양 한 수 있습니다. 대신 수 축력 속도 일정 유지, 힘 상수 (포스 클램프 모드)을 유지 수 있습니다 하나.
  3. 데이터 분석
    참고: 데이터 분석 데이터 처리 소프트웨어를 사용 하 여 실행 되었다. 에 따라 고정된 단백질, 접촉 시간 또는 철회 속도, 발자국 안 통합 여부 및 다른 가변 매개 변수, 힘 거리 곡선 여러 다른 정보가 포함 됩니다. 데이터 분석 및 해석 다른 SMF 실험 사이 크게 달라질 수 있습니다 고 수 따라서 설명 하지 여기에. RrgA와 Fn의 상호 작용에 관해서는 다음 프로토콜 SMF 데이터의 분석에 대 한 첫 번째 단계를 수 있습니다.
    1. 오픈 배치의 강제 검색 아이콘을 선택 하 여 측정 된 힘 곡선 파일을 열고 다음과 같이 힘 거리 곡선 처리:
    2. (재) 보정 V-편향 감도 조정 및 봄 일정 아이콘을 선택 하 여 직접 비례 힘 (F)에 외팔보 편향 (V)를 변환 합니다.
      참고: 외팔보 교정 실험 전에 실시 됐다, 값 힘 스캔 파일에 저장 되 고 V-편향의 교정 하는 동안 자동으로 사용 됩니다. 교정 실험 후 실시, 소프트웨어 측정된 된 값으로 변경할 수 있습니다 기본 값을 사용 합니다.
    3. 기본 빼기아이콘을 선택 하 여 제로 포스 레벨을 설정 하려면 표면까지 힘 곡선의 영역에서 철회 채널의 기준선을 뺍니다.
      참고: 일부 경우에는 철회 없을 수 있습니다 동일한 상수 힘 값 그리고 곡선 선형 기울기, 오프셋 + 기울기를 선택 하 여 제거 될 수 있는 표시 될 수 있습니다.
    4. 어디 끝 지점 결정 문의 아이콘을 선택 하 여 샘플에 접촉 되 면 포인트를 정의 합니다.
    5. Tip 샘플 분리 아이콘을 선택 하 여 팁 샘플 분리를 높이 신호를 변환 합니다. 접점 위치를 빼기 뿐만 아니라이 절차는 AFM 팁 및 기판 표면 사이의 거리를 계산 하는 절곡 캔틸레버를 뺍니다.
      참고: 확장 가능한 웜 같은 체인 모델 및 상호 작용 길이 결정 같은 폴리머 탄성 모델 피팅 외팔보 절곡에 대 한 해결 팁 샘플 분리 필요 합니다. 힘 힘 z 피 속도의 기울기에서 로드 하는 속도 확인 하려면 수정 되지 않은 힘 곡선을 사용 한다.
    6. 일반적인 상호 작용을 밖으로 정렬 및 선택 하 여 선택한 봉우리에 확장 가능한 웜 같은 체인 모델을 적용할 70 nm (뻗어 못 스페이서의 길이)36 위 파열 길이에서 발생 하는 힘 봉우리의 힘 거리 추적 화면에서 폴리머 체인 모델에 맞게 아이콘 하 고 확장 웜 같은 체인 모델을선택 했다. 철회 힘 곡선에 봉우리가이 모델 장착 하 고 파열 힘 및 길이, 함께 획득 폴리머 탄성 매개 변수.
    7. 힘 및 길이 분포를 보여주는 히스토그램으로 데이터를 표시 합니다. 적어도 100 바인딩 해제 이벤트를 사용 하 여 히스토그램에 대 한.

결과

프로토콜 설명 여기 를 통해 단백질의 화학식 동원 정지에 결과 임의의 방향 (그림 1) 액세스할 수 있는 그들의 1 차 아민. 그림 2 (왼쪽)와 silanized 유리 표면의 AFM 이미지를 보여줍니다 그리고 질소의 부드러운 스트림 아래 샘플의 탈수 후 (오른쪽) Fn 움직일 수 없이 기록. Silane 폴리머 레이어 Fn와 기능성된 표면에만 작은 표면 파형 높이 약 2-5 nm (그림 2, 오른쪽), 동안, 약 10 nm 높은 Fn 분자는 명백한 (그림 2, 왼쪽). 클로즈업, Fn의 dimeric 구조를 인식할 수 있습니다. Fn 분자 말뚝 표면 코팅 위에 4-5 nm의 높이와 길이의 소형 것 같다 ~ 120 nm (삽입 참조).

조사는 최근 자세히 설명 우리의 그룹13, Fn와 RrgA의 상호 작용 힘에 RrgA 실리콘 질 화물 AFM 팁과 유리 기판 (그림 3a)에 인간의 Fn에 결합 했다. 그림 3 샘플 분리 곡선 Fn 1 µ m s-1의 당기 속도에서 기록 된 RrgA의 상호 작용의 대표적인 팁을 보여 줍니다. 사용 된 표면 화학 상호 작용을 낮은 배경 및 체인 (eWLC) 모델 (빨간 곡선) 같은 확장 가능한 벌레를 사용 하 여 장착 했다 (그림 3a), 잘 모양된 (또는 2) 상호 작용 이벤트에. AFM 팁과 기판, 스트레칭 못 링커 (> 70 nm), 일반적인 표면 상호 작용까지 극복 후 보여줍니다 적합 (파열 힘 및-길이 그림 4참조)의 결과 플롯 ~ 19% 힘 곡선의 파열을 보여주었다 말은 파열 된 이벤트 RrgA-Fn의 상호 작용에 대 한 강제 ~ 약 100의 팁-샘플 거리에서 52 pN nm. 반면, 부적당 한 표면 화학 (여기, 염 분 그림 3b버퍼링 트리 스와 냉각 하는 생략) 여러 단백질 바인딩 (추적 2와 3) 난다 상호 작용으로 인해 단일 상호 작용 이벤트에 대 한 명확한 평가 방해 것 이다 / 샘플 표면 및 AFM 캔틸레버 끝 사이의 단백질의 카 하 플 공유 링 높은 파열 힘 (추적 1) 단백질 (Fn) 도메인 (추적 4와 5)의 전개와 함께 가능 하 게이 리드.

figure-results-1517
그림 1: 표면 화학을 통해 개요. Ethoxy silane-말뚝-carboxyl의 가수분해 실록 crosslinks의 형성과 수산화 유리 표면에서의 결로 옵니다. Carboxyl 그룹 EDC의 반응 반응 o-acylisourea, 수성 해결책 (가수분해) 매우 짧은 반감기를 가진 아민 반응 중간 결과. 중간을 겪 습 및 대체 마지막으로 단백질에 1 차 아민과 아 미드 유대를 형성 하는 NHS 에스테 르의 형성에 의해 안정 이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

figure-results-2055
그림 2: 동원 정지의 한 유리 기판 통해 heterobifunctional ethoxy silane 말뚝에 fibronectin carboxyl 커플링 에이전트. 기능성된 유리의 AFM 이미지 (왼쪽)와 표면 및 (오른쪽) 없이 Fn. 숫자 (삽입) 기판 표면에 균질 분산 개별 Fn 분자를 나타냅니다. 분자는 말뚝 위에 4-5 nm의 높이 dimeric이 고 컴팩트한 구조 채택 코팅과의 길이 > 100 nm. 이 솔루션에서 Fn의 구조를 닮 고 다른 표면, 예를 들어, 운 모에 이전 AFM 데이터와 일치 (눈금 막대의 상 = 500 nm)37. AFM 아래 이미지는 AFM 이미지에 표시 된 라인을 따라 높이 프로필. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

figure-results-2733
그림 3: SMF 실험 및 대표 일러스트 힘 거리 곡선 RrgA-Fn 상호 작용의. (a) RrgA와 Fn covalently 연결을 통해 heterobifunctional ethoxy silane 못 했다 carboxyl 커플링 에이전트 실리콘 나이트 라 이드 AFM 외팔보 팁과 유리 표면, 각각. 대표 SMF 힘 거리 곡선 RrgA-Fn와 상호 작용 수 축력 속도에 1 µ m s-1 의 RrgA와 Fn의 설명된 동원 정지에 대 한 얻은 표시 됩니다. 빨간 곡선 파열 힘 및 길이에 적용 된 확장 가능한 웜 같은 체인 맞는 나타냅니다. 그림은 Becke, 그 외 여러분, ACSnano 201813에서 수정 되었습니다. (b) 대표 SMF 힘 거리 곡선 RrgA-Tris 버퍼와 냉각 없이 Fn 상호 작용에 대 한 얻은 염 분. 이 경우에, 트리 스의 1 차 아민은 결 석 활성 남아 있도록 NHS 에스테 르 남았다 불포화 실험 기간 동안. 이것은 다중 단백질 바인딩 (추적 2와 3) 하며 단백질 표면 사이의 높은 파열을 초래한 AFM 팁의 클램핑 (Fn-) 함께 도메인 전개 (추적 1, 4, 5; 다른 비늘을 참고). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

figure-results-3648
그림 4: 단일 RrgA-Fn 상호 작용의 힘 및 길이 분포. 힘 및 RrgA-Fn SMF 상호 작용 측정에서에서 얻은 해당 파열 길이 히스토그램 파열 (n = 1400) 1 µ m s-1의 상승 속도에. 히스토그램 공개 51.6 pN (가우스 적합, 검은 선)의 가능성이 가장 높은 파열 힘 fMP 와 축적의 파열 길이 약 100 nm. 그림은 Becke 외., ACSnano, 201813에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

토론

AFM의 도입 기반을 SMF, 그것을 직접 내 고 intermolecular 개별 단백질, 핵 산 및 다른 생체3,,45의 널리 사용된 기법으로 진화. 성공적인 SMF 실험에 대 한 전략을 결합 하는 적절 한 표면 필수입니다. 천연 및 합성 폴리머에 intramolecular 힘을, 중합체는 기판 표면 및 AFM 팁36,,3839,40,41직접 결합 될 수 있습니다. 그러나 분자 채권 등 간 분자 상호 작용의 수사를 위해, 그것입니다 이종 bifunctional 못 링커 등 polypeptide 사슬, 유연한 링커 분자 AFM 팁을 상호 파트너를 연결 하 고 수 있도록 바인딩 파트너의 올바른 방향에 대 한 단거리 표면 힘을 극복 하 고 변성 그리고 단백질21,,2223의 전개를 피하기 위해 기판 표면 24,25,26,,2742. 우리 따라서 이종 bifunctional 못 스페이서를 사용 하 여 그들의 접근 주 아민 통해 단백질의 화학식 동원 정지에 대 한 간단 하 고 곧장 앞으로 프로토콜을 설명 합니다.

우리가 그것의 적용을 보여주는 상호 작용의 수사 adhesin 미 균 에서 RrgA와 세포 외 기질 단백질 Fn, 사이 힘 최근에 자세히 설명 다른 곳13.

표면 화학 잘 설립 하 고 분석 하 고 유사한 접근 여러 SMF 실험19,,4243,44,45에서 성공적으로 사용 되었습니다. 표면에 폴리머 실 란 커플링 사용 하는 silylether는 가수분해. 가수분해의 정도 silanization 과정에서 통제 될 수 있다 형성된 된 실록 산 결합의 금액에 따라 달라 집니다. 높은 상호 작용 힘 (≥ 1000 pN)는 SMF 측정 하는 동안 예상 하는 경우는 silanization 수행 통해 -기상 증 착30 낮아집니다의 지속적인 층의 형성 귀착되는 해야 합니다. 많은 실험 (예를 들어, 많은 단백질-단백질 상호 작용), 상호 작용 힘 몇 백 pN 및 설명된 절차는 실록 형성 수성 단계에서 증 착에 의해 실시 및 언바운드의 범위에는 유기 실 에탄올 (단계 1.1.7) 열 (단계 1.1.8) 치료 다음 씻어 신중 하 게, 충분 하다.

또 다른 중요 한 단계 나머지 EDC를 세척 하 고 보 건국 분자 표면 (1.2.3 단계)에서 남은 단백질에 carboxyl 그룹의 활성화로 이어질 것입니다. 이 기능을 변경할 수 있습니다 동일한 표면에 단백질의 가교에서 어느 결과 또는 몇 반대 표면에 다른 단백질에 단백질을 활성화 하는 covalently. 이 단백질 표면 사이의 도메인 전개 동반 가능성이 높은 파열 힘 귀착되는 AFM 팁의 클램핑 이어질 수 있습니다 ( 그림 3b, 추적 1, 4 및 5 참조 Fn 도메인의 전개)46. 못 스페이서의 활성 NHS 에스테 르는 불포화 경우 같은 문제가 발생할 수 있습니다. 따라서, Tris 버퍼 식 염 수를 가진 외피는 좋습니다 (단계 1.2.6), 트리 스의 1 차 아민 냉각 나머지 아미노 반응 그룹으로.

Silanized 유리에 Fn의 균일 분포를 리드 stepwise 프로토콜에 따라 표면 ( 그림 2참조), 단백질의 dimeric 형태를 떠나. 이 솔루션에서 Fn´s 구조를 닮 고 다른 샘플 표면37에 이전 AFM 데이터와 일치. 또한, AFM 팁에 RrgA의 적절 한 농도, 얻어진 다는 SMF 측정 (그림 3 및 그림 4) 동안 잘 정의 된 상호 작용 이벤트 ~ 20%의 대상 값을 생성. 또 다른 우아한 방법은 다양 한 단백질 농도 및 부 화 번 외 샘플 기판 및 캔틸레버 끝에 결합 하는 분자의 양을 제어 실-대리인 다른 보조 기능 그룹의 조합입니다. 못-폴리머에서 연장 하는 단백질 반응 그룹의 비율을 변경 하 여 고정된 단백질의 수는 제어15,16,,1718수 있습니다.

여기에 설명 된 프로토콜 또한 다른-NH2 포함 된 분자를 무력화 하거나 유리 및 실리콘 질 화물 외 다른 실리콘 산화물 표면에 몇 단백질 조정 사용할 수 있습니다. 단백질 디자인 따라 아민 반응 carboxyl 그룹으로 변경할 수 있습니다 통해 단백질 하 sulfhydryl 반응 그룹 (예를 들어, maleimide 또는 pyridyl 직교 이황화) 무료-SH 그룹. Fn,이 미리 정의 된 방향13,,1720결과.

요약 하자면,이 프로토콜 다른 요구 사항을 제공 하기 위해 조정 될 수 있다 고 단일 분자 힘 분광학 실험 외 다른 생물 응용 프로그램에 적합 합니다.

공개

저자는 공개 없다.

감사의 말

TB와 HG 유럽 연구 위원회 "Cellufuel, 고급 보조금 번호 294438"를 통해 재정 지원을 인정 한다. SS 금융 인정 HCS 인정 교육 및 Innovationsallianz Technofunktionale Proteine (TeFuProt)를 통해 연구에 대 한 연방 정부에서 재정 지원, 과학 교육에 대 한 바이에른 주 교육부에서 지원 통해 연구 초점 "Herstellung und biophysikalische Charakterisierung dreidimensionaler Gewebe-캔터". 우리는 기술 지원에 대 한 코니 Hasselberg-크리스토프와 마르티나 Hörig 감사

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Material
2-PropanolCarl Roth6752
1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimideSigma-Aldrich03450EDC
Acetic acidCarl Roth3738100 %; analytical purity
Doubly distilled water
EthanolCarl Roth9065≥ 99.8 %; analytical purity
Ethoxy silane polyethylene glycol acidNanocsPG2-CASL-5k5 kDa; COOH-PEG-Si(OC2H5)3
Hydrochloric acidCarl RothX89632 %
N-HydroxysuccinimidMerck804518NHS; for synthesis
Phosphate Buffered Saline - DulbeccoBiochromL1825PBS
Probe molecule e.g. Fibronectin, human plasmaSigma-AldrichF1056
Probe molecule e.g. RrgAProduced in laboratory
SodiumchloridCarl Roth9265NaCl
Tris(hydroxymethyl)-aminomethanCarl RothAE15≥ 99,3 %; TRIS; Buffer Grade
NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
Beakers
Glass cutter
Glass slidesCarl Roth0656
Inert gas desiccatorSicco
Inverted Microscope - Zeiss Axiovert 200Zeiss
JPK NanoWizard 1JPK Instruments
JPK NanoWizard SPM and DP softwareJPK Instruments
Laboratory ovenBinder
Magnetic stirrerIKA
Micro spatula
Microcentrifuge tubes
Microsoft ExcelMicrosoft
Parafilm MBrand701606
Petri dishes
pH-meterKnick
PipettesStarlab10-100 µl, 50-200 µl, 100-1000 µl
Precision balanceAcculab
Silicon nitride cantilever - MLCTBruker AXS S.A.SSpring constant ≤ 100 pN/nm
Sonication bathBandelin
Staining jar
Stereo microscope - Zeiss StemiZeiss
Stir bar
Kimtech science precision wipesKimberly-Clark
Twezzers
UV PenRayUVP, LLC90-0012-01Mercury spectrum with the primary energy at 254 nm
Vacuum desiccator
Vacuum pump
Vortex mixerVWR
Weighing paperCarl RothTP64

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