Programa multitaper spectrograma baseado em computador para dados eletroencefalográficos

Resumo

Este protocolo fornece um programa MATLAB compilado de código aberto que gera espectrogramas multitaper para dados eletroencefalográficos.

Resumo

Os recursos atuais da web fornecem ferramentas limitadas e amigáveis ao usuário para calcular espectrogramas para visualizar e quantificar dados eletroencefalográficos (EEG). Este artigo descreve um código de código aberto baseado no Windows para a criação de espectrogramas multitaper do EEG. O programa compilado é acessível aos usuários do Windows sem licenciamento de software. Para os usuários do Macintosh, o programa é limitado àqueles com uma licença de software MATLAB. O programa é ilustrado através de espectrogramas de EEG que variam em função dos estados de sono e vigília, e alterações induzidas por opiáceos nesses estados. Os EEGs de camundongos C57BL/6J foram registrados sem fio por 4 h após injeção intraperitoneal de soro fisiológico (controle de veículo) e doses antinociceptivas de morfina, buprenorfina e fentanil. Os espectrogramas mostraram que a buprenorfina e a morfina causaram mudanças semelhantes na potência do EEG em 1-3 Hz e 8-9 Hz. Spectrograms após a administração do fentanil revelaram faixas de potência médias máximas em 3 Hz e 7 Hz. Os espectrogramas desmascarados efeitos diferenciais de opiáceos na frequência e potência do EEG. Estes métodos baseados em computador são generalizáveis em todas as classes de drogas e podem ser facilmente modificados para quantificar e exibir uma ampla gama de sinais biológicos rítmicos.

Introdução

Os dados do EEG podem ser analisados produtivamente no domínio da frequência para caracterizar os níveis de excitação comportamental e neurofisiológica^1. Os espectrogramas multitaper transformam a forma de onda EEG em domínios de tempo e frequência, resultando na visualização do poder de sinal dinâmico em diferentes frequências ao longo do tempo. O espectrograma multitaper utiliza a análise Fourier para produzir estimativas de densidade espectral. Estimação densidade espectral separa uma forma de onda para as ondas sinusoidal puro que compreende o sinal e é análogo à difração da luz branca através de um prisma para ver todo o espectro de cores². O espectrograma multitaper do EEG representa a atividade combinada de múltiplas redes de neurônios com padrões de descarga que oscilam em diferentes frequências^2. Devido à sua invariant mudança de tempo, a transformação fourier é considerada a melhor transformação entre o tempo e os domínios de frequência^3. A análise de Fourier também tem uma série de limitações. Os sinais de EEG não são estacionários. Portanto, pequenas alterações podem não ser percebidas nos métodos Fourier e a análise pode mudar dependendo do tamanho do conjunto de dados. No entanto, janelas é usado ao aplicar uma transformação Fourier para um sinal não estacionário. Isto supõe que o espectro do sinal muda somente marginal durante curtos períodos de tempo. Um método alternativo para a análise espectral é a transformação da onda que pode ser mais apropriada para detectar a doença³do cérebro.

Do ponto de vista funcional, as diferentes oscilações que compreendem um sinal de EEG são fenótipos de nível inferior, fenótipos de traços característicos de fenótipos estaduais de nível superior, como sono e vigília^2,ou a perda de vigília causada pela anestesia geral^4,5,6. Em relação aos estados de sono e vigília, o espectroilustrado ilustra claramente que os ritmos de sono gerados endógenamente são contínuos e dinâmicos^7. Descrições quantitativas de estados de sono e vigília tradicionalmente envolveram um processo de binning que atribui uma classificação de sono ou vigília a cada época especificamente definida (por exemplo, 10 s) de gravação de EEG. Estes escaninhos do estado são traçados então em função do tempo. Parcelas de dados do curso do tempo, muitas vezes referidas como hipnogramas, são usadas para diferenciar o sono normal do sono que é interrompido por doença, administração de medicamentos, mudanças nos ritmos circadianos, trabalho por turnos, etc. Uma limitação de parcelas de hipnograma é que eles deturpam sinais de EEG, expressando estados de excitação como formas de onda quadradas. Hipnograma plotagem envolve uma discretização de excitar estados² e não permite uma exibição finamente granulada de estágios intermediários ou de transição. Além disso, 10 s que marcam épocas produzem uma discretização do tempo impondo um limite mais baixo na escala de tempo. O resultado da discretização do estado e do tempo é a perda de informações neurofisiológicas sobre a interação dinâmica entre estados de consciência² e ruptura induzida por drogas desses estados^4. Por exemplo, diferentes agentes anestésicos atuam em diferentes alvos moleculares e redes neurais. Manipulação farmacológica dessas redes neurais produz espectrogramas de forma confiável exclusivo para a droga, dose e rota da administração⁴.

O protocolo atual foi desenvolvido para facilitar a pesquisa a respeito dos mecanismos por que os opioids alteram o sono^8,respirando^9,nociception^10,e neurochemistry¹¹do cérebro. Este protocolo descreve as etapas necessárias para criar um espectrograma multifitado para análises de EEG que podem ser concluídas usando software proprietário ou um sistema que não tenha licenciamento MATLAB. Os camundongos C57BL/6J (B6) foram usados para validar a capacidade deste método baseado em computador de criar novos espectrogramas de EEG durante estados normais e imperturbáveis de sono e vigília e após a administração sistêmica de opiáceos. A confiabilidade e validade das análises foram confirmadas por comparações sistemáticas das diferenças entre os espectrogramas de EEG após camundongos B6 receberam injeções intraperneal de soro fisiológico (controle do veículo) e doses antinociceptivas de morfina, buprenorfina e fentanil.

Estudos quantitativos da dinâmica neonatal do EEG de camundongos têm relevância translacional, fornecendo um modelo para estudos com o objetivo de alcançar uma melhor compreensão do EEG humano neonatal¹². A quantificação da dinâmica do EEG não é meramente descritiva e pode contribuir para abordagens de aprendizado de máquina que podem prever a excitação com base em parte nos dados do EEG¹³. O objetivo do presente relatório é promover a ciência translacional, fornecendo um código amplamente acessível e amigável para a computação de espectrogramas multitaper que caracterizam alterações induzidas por drogas no EEG do mouse.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo camundongos aderiram ao Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório^(8ª edição, National Academies Press, Washington DC, 2011) e foram revisados e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade do Tennessee.

1. Implantação de eletrodos de gravação e coleta inicial de dados

1. Compre ratos e mantenha-os em um quarto umidade-e temperatura-controlado com acesso do libitum do anúncio ao alimento e à água. Permita que os ratos se adaptem ao seu novo ambiente por uma semana antes da implantação cirúrgica de eletrodos de gravação. O procedimento de implantação foi descrito em detalhes^1,14.
2. Esterilizar todos os equipamentos cirúrgicos.
3. Camundongos anestesios com isoflurano em 2,5%−3% entregues em 100% de oxigênio.
4. Após a perda do reflexo de endireitamento, retire o mouse da câmara de indução de anestesia e transfira-o para um quadro estereotipado.
5. Aplique uma pomada oftalmocômica em ambos os olhos.
6. Reduza o isoflurane para 1,7%, continuamente entregue através de uma máscara.
7. Faça uma incisão do couro cabeludo midline para expor o crânio.
8. Perfurar duas craniotomias acima do córtex esquerdo e direito (cada um em coordenadas estereoeéticas anterior = 1,0 e lateral = 3,0 em relação ao bregma^15).
9. Insira os eletrodos de EEG em cada craniotomia e seja seguro com acrílico dental.
10. Implante eletrodos bipolares no músculo trapézio dorsal para gravar o eletromiograma (EMG).
    Nota: Os quatro eletrodos são levados a um telemetro sem fio implantado subcutâneamente acima do quadrante do corpo inferior direito. Essas técnicas cirúrgicas podem ser vistas aqui (https://www.datasci.com/services/dsi-surgical-services/surgical-videos).
11. Após a cirurgia, administrar carprofeno analgésico e coloque o mouse em uma gaiola de recuperação quente. Observe o rato até que seja ambulatório. Casa implantou ratos individualmente.
12. Após a recuperação completa da cirurgia, lidar com ratos diariamente e avaliar a qualidade das gravações EEG e EMG.
13. Configure o sistema de aquisição de dados para registrar todos os sinais ± 1.000 mV.
14. Obter gravações de EEG e EMG para a duração necessária.
15. Pontuar cada 10 s bin das gravações digitais EEG e EMG como vigília, movimento rápido dos olhos (REM) sono, ou não-REM (NREM) dormir usando software de pontuação do sono.
    Nota: Entre as cepas do mouse há diferenças genótipo e estado-específicas no poder EEG expressas como uma porcentagem da potência total¹⁶. Em camundongos B6, os estados de vigília são caracterizados por um 75-100 mV, EEG de frequência mista, e por sinais EMG mostrando tônus muscular proeminente com grandes aumentos na amplitude durante o movimento. Os critérios para pontuar o sono NREM incluem uma redução na amplitude do EMG em relação à amplitude de vigília da EMG. O EEG de sono NREM tem uma frequência mais lenta e maior amplitude (100-150 mV) em comparação com a vigília. O sono REM é caracterizado por atonia muscular e um sinal de EEG que é semelhante ao EEG de vigília.
16. Instrua dois indivíduos a marcar o mesmo registro de forma independente. Pelo menos um indivíduo deve ser cegado à condição do tratamento. Os valores de concordância entre os dois marcadores de sono devem ser superiores a 90%.

2. Instalações e Equipamentos

1. Amplificar e digitalizar sinais EEG e EMG não filtrados usando instrumentação e software de aquisição de dados.
   Nota: A caixa de ferramentas de análise espectral Chronux desenvolvida no Laboratório Mitra no Laboratório cold spring harbor é usada para expressar sinais de EEG como potência em relação aos domínios de tempo e frequência.

3. Computação espectrograma

1. Se um usuário do Windows, use o programa compilado.
2. Se um usuário macintosh, executar o arquivo de código bruto.
3. Obtenha dados EEG brutos e não processados no formato de arquivo EDF ou CSV e coloque-os no mesmo local do arquivo compilado do programa.
   1. Cite os arquivos de dados usando as seguintes restrições: os nomes devem consistir apenas de letras, números, sublinhados ou traços.
   2. Nomeie os arquivos de dados usando as seguintes restrições: os nomes dos arquivos não devem conter períodos, commas, espaços ou quaisquer outros símbolos.
4. Baixe o compilado Programa Multitaper Spectrogram(https://drive.google.com/).
5. Lance o programa de espectrograma e siga as solicitações pop-up. Escolha o tipo de arquivo: *. CSV ou *. Fed.
   Nota: Mais detalhes de instalação do programa estão localizados no arquivo readme.txt.
6. Digite todo o nome do arquivo EEG (por exemplo, 419eeg.edf ou 419.eeg.csv).
7. Selecione parâmetros para o cálculo do espectrograma: Padrão ou novo. Esta etapa requer o maior tempo de processamento, pois o espectrograma está sendo computado. A função de janelas matemáticas (taper) fornece estimativas estatisticamente independentes do espectro subjacente. Quanto maior a duração da gravação, maior será necessário esta etapa. Em uma plataforma de PC rodando o Windows 10, isso exigiu um máximo de cerca de 3 a 4 min para uma gravação de 4 h.
   1. Use os seguintes parâmetros de espectrograma padrão:
      Frequência de amostragem = 500 Hz. Isso representa o número de amostras por segundo.
      fpass = 0,3 Hz e 30 Hz. Fpass define as frequências de entrada e controla a gama de frequências fornecidas na saída.
      Estofamento = 2. O estofamento trabalha para interpolar finamente a saída sem afetar o cálculo do resultado em nenhuma maneira. Isso pode auxiliar na visualização e na identificação precisa de linhas espectrais. O campo é qualquer inteiro de -1 e para cima.
      Produto de largura de banda de tempo (NW) = 15. O produto da duração temporal do sinal e da largura espectral.
      Número de tapers = 29. Ao escolher o número de tapers, é essencial usar 2NW-1. Não há limite para o número de atos utilizados. Os mais tapers utilizados resultarão na inclusão de tapers com baixa concentração na largura de banda de frequência especificada.
      Média experimental = 1. Este parâmetro rege se a média de ensaios ou canais é realizada ou não. Se este parâmetro for definido para 0, não há uma média de canal e a função produzirá resultados independentes para cada ensaio ou canal passado como dados de entrada. No entanto, se a média de avaliação for definida para 1, a saída dos resultados para o usuário será calculada em média em relação a avaliações ou canais.
      Hora de calcular FFT ~30 s. Usado para seguir a evolução do espectro calculando o espectro sobre muitas janelas pequenas.
      Passo tamanho da janela para computação FFT = 5. A quantidade que a janela de tempo deslizante avança depois que cada cálculo do espectro é executado.
      Nota: Os parâmetros de espectrograma padrão indicados na etapa 3.7.1 podem ser alterados conforme necessário.
8. Digite títulos para o espectrograma e EEG.
9. Salve o espectrograma resultante e O EEG.
   1. Salvar números clicando arquivo | Salve na janela da figura.
      Nota: Os números fornecerão aos usuários do programa resumos que podem ser desenvolvidos em números de qualidade de publicação.

4. Solução de problemas

1. Baixe os dados de EEG de sono de mouse da amostra para a computação de espectrograma de amostra.
2. Executar o programa com os dados da amostra para garantir que o usuário está usando corretamente o programa. Encontre os números desses dados da amostra no apêndice para garantir que os números criados a partir dos dados da amostra sejam precisos.
   Nota: Todos os equipamentos e materiais utilizados foram fornecidos na Tabela de Materiais.

Resultados

Os seguintes números ilustram o tipo de novos insights sobre os índices de EEG de excitabilidade cerebral que são fornecidos por espectrogramas.

A Figura 1A ilustra semelhanças e diferenças no EEG cortical durante vigília, sono NREM e sono REM. Muitos investigadores usam esses tipos de traços, juntamente com gravações EMG (não mostrado), para quantificar o sono e vigília. A Figura 1B usa um lote de hipnograma para transmitir a organização temporal dos estados de sono e vigília com base em avaliações de gravações de EEG e EMG. Estados foram pontuados em 10 épocas e essas épocas foram traçadas como o hipnograma durante os 14.400 que compõem a gravação de 4 h. As parcelas de hipnograma não ilustram o fato de que as transições entre estados são contínuas e não lineares. Em contraste com uma trama de hipnograma, o espectrograma (Figura 1C) ilustra mudanças altamente dinâmicas na frequência e potência do EEG em função do tempo. O espectrograma também destaca as semelhanças entre o sinal eeg cortical durante a vigília e durante o sono REM. As três caixas sobrepostas ao espectrograma(Figura 1C)marcam estados identificados como vigília (WAKE), sono NREM e sono REM no hipnograma acima(Figura 1B)e são fornecidos para auxiliar na visualização das alterações detalhadas na frequência e energia do EEG. O espectrograma para toda a gravação fornece uma apreciação diferenciada do EEG como um processo contínuo.

A Figura 2 fornece quatro espectrogramas multitaper, cada um resumindo 4 h de gravações de EEG após a administração intraperitoneal de soro fisiológico, morfina, buprenorfina e fentanil. Todas as quatro gravações são do mesmo rato e foram iniciadas 2 h após o início da luz. Os opiáceos, mas não soline, inibiu o sono NREM e REM, e aumentaram a quantidade de vigília. Uma série de novas características são visualizadas pelos espectrogramas. A detecção de novas características do EEG sugere a potencial aplicação para diferenciação de opiáceos em um ambiente de ameaça química. Após a injeção sorofina (Figura 2A)a maior quantidade de energia residiu na faixa de 2-4 Hz, indicando sono NREM. Observe que os espectrogramas de EEG foram fundamentalmente alterados pela administração de opiáceos, e que cada opiáceo causou alterações espectrais únicas.

A Figura 3 demonstra que as alterações do EEG ilustradas pelos espectrogramas podem ser quantificadas e expressas como média dominam o poder espectral de cada meia frequência(Figura 3A)e como a potência espectral média dentro de faixas de frequência específicas do EEG(Figura 3B). As maiores diferenças de soro para salina foram causadas pela buprenorfina e ocorreram nas faixas delta e theta.

Figura 1: Gravações corticais de EEG usadas para criar hipnogramas e espectrogramas. (A) Formas de onda EEG registradas durante a vigília, sono NREM e sono REM durante uma gravação de linha de base (sem injeção). Cada vestígio mostra 90 s de gravação. (B) O hipnograma usa a altura das barras para transmitir o estado de consciência (ordenado) versus 4 h de gravação (abscisão). (C) Espectrograma afunilado usando uma barra de cores para transmitir energia EEG em decibéis (dB, ordinato direito) ou densidade de energia espectral em diferentes freqüências de EEG em Hertz (Hz, ordinado esquerdo) em função de 4 h tempo de gravação (abscisão). Linhas verticais pretas foram adicionadas ao espectrograma para delinear um episódio cada de vigília, sono NREM e sono REM. (Parâmetros de espectrograma: frequência de amostragem = 500 Hz, fpass = 0,3 Hz e 30 Hz, estofamento = 2, largura de banda de tempo = 15, número de tapers 29, média de ensaio = 1, duração do tempo para calcular FFT ~30 s, tamanho de etapa da janela para computação FFT = 5). Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figura 2: Espectrogramas ilustrando mudanças na potência e frequência do EEG causadas pela administração de opiáceos. Cada espectrograma traça frequência de EEG em Hertz (Hz, ordinato esquerdo) e decibéis (dB) de potência eeg usando uma barra de cores (direito ordenado) por 4 h (abscissa) após a administração de (A) salina, (B) morfina, (C) buprenorfina, e (D) fentanil. (Parâmetros de espectrograma: frequência de amostragem = 500 Hz, fpass = 0,3 Hz e 30 Hz, estofamento = 2, largura de banda de tempo = 15, número de tapers 29, média de ensaio = 1, tempo para calcular FFT ~30 s, tamanho de janela para computação FFT = 5). Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figura 3: Os opiáceos alteraram diferencialmente a potência média do EEG dentro das bandas de frequência delta e theta EEG. (A)Resume a potência média do EEG durante cada gravação de 4 h mostrada na Figura 2. O ordinato traça a potência média do EEG a cada meia frequência (abscisão). Em relação ao controle sorológico, cada uma das outras três funções mostra alterações específicas de opiáceos na potência média do EEG. (B) Ilustra a potência média do EEG em quatro bandas de frequência do EEG (delta, theta, alfa e beta) após a administração de soro fisiológico (S), buprenorfina (B), morfina (M) e fentanil (F). A codificação de cores é a mesma para funções de potência em A e faixas de potência médias em B. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Discussão

O programa descrito aqui foi desenvolvido para criar um espectrograma usando as nove etapas descritas na seção 3 do protocolo, computação do spectrogram. Essas etapas envolvem a aquisição do programa de espectrograma, a garantia do formato de arquivo correto e a alteração dos parâmetros computacionais para a geração de espectrogramas de usuário exclusivos. Os usuários podem criar espectrogramas que são adaptados a uma série de questões conceituais e projetos experimentais. A fim de aumentar a facilidade e eficiência deste processo de desenvolvimento, é essencial fornecer os dados brutos do EEG no formato de arquivo correto, nomeado de acordo com as restrições descritas acima. Embora os sinais de exemplo tenham sido fornecidos para dados de EEG do mouse, o programa de espectrograma é facilmente aplicável a dados de EEG humanos e não humanos que estão livres de limitações de processamento de sinal.

A abordagem recomendada para solução de problemas e modificação do método deve começar por analisar um pequeno conjunto de dados. As principais saídas do programa a considerar incluem parcelas do EEG filtrado, bem como o espectrograma. Um aspecto atraente do espectrograma cônico é que ele pode ser aplicado a uma grande variedade de sinais biológicos periódicos. A variedade varia de ritmos circadianos de longa duração (24 h)¹⁷ a ritmos muito rápidos, como taxas de descarga de 1.000 Hz de uma célula Renshaw¹⁸.

A formatação de dados é uma restrição deste protocolo de espectrograma. O formato de dados europeu (FED) é amplamente utilizado com dados do EEG. No entanto, existem muitas outras opções de formatação. Por esta razão, o arquivo de código bruto foi incluído (ver 3.2 acima) no caso de o usuário gostaria de alterar o formato de arquivo. No que diz respeito ao arquivo do programa bruto, outra limitação é a necessidade de experiência com a linguagem de programação de computador, a fim de alterar o formato de arquivo. Nem todos os investigadores têm acesso ao software proprietário e à gama completa de plug-ins. Este protocolo foi desenvolvido para contornar esse problema fornecendo um programa compilado que é executado em um dispositivo baseado em WINDOWS sem licenciamento de software. Isso é conseguido através do plugin RUNTIME, que está incluído no programa compilado e não requer qualquer registro de software pelo usuário.

Esta rotina de espectrograma EEG é um novo programa de código aberto e baseado em computador que permite aos usuários criar espectrogramas personalizados e multitaper a partir de uma ampla gama de dados. O usuário tem controle total sobre todos os aspectos computacionais da geração de espectrogramas. Sem processamento prévio de sinal e conhecimento de programação de computador, os espectrogramas podem ser difíceis de gerar. O protocolo descrito aqui facilitará a geração de espectrogramas. Consulte a seção de material suplementar para mais leituras de processamento de sinal e orientação de espectrograma multitaper.

Material suplementar
http://chronux.org
http://www-users.med.cornell.edu/~jdvicto/pdfs/pubo08.pdf
http://www.fieldtriptoolbox.org/tutorial/timefrequencyanalysis/
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4502759/#SD3-data

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dental acrylic	Lang Dental Manufacturing Co	Jet powder and liquid
EEG/EMG Amplifier	Data Science International	model MX2
macOS Mojave	Apple	v10.14.4
MATLAB	Mathworks	v9.4.0.813654	software for spectrogram comp.
Mouse anesthesia mask	David Kopf Instruments	model 907
Neuroscore	Data Science International	v3.3.9317-1	software for scoring sleep and wakefulness
Ponemah	Data Science International	v5.32	software for EEG/EMG Data Acquisition
Stereotaxic frame	David Kopf Instruments	model 962
Stereotaxic frame, mouse adapter	David Kopf Instruments	model 921
Windows 10	Microsoft	v10.0.17763.503
Wireless Telemeter	Data Science International	model HD-X02