Programma spettrogramma multitaper basato su computer per dati elettroencefalografici

Riepilogo

Questo protocollo fornisce un programma MATLAB compilato open source che genera spettrogrammi multitaper per dati elettroencefalografici.

Abstract

Le attuali risorse web forniscono strumenti limitati e facili da usare per calcolare gli spettrogrammi per visualizzare e quantificare i dati elettroencefalografici (EEG). Questo documento descrive un codice open source basato su Windows per la creazione di spettrogrammi multitaper EEG. Il programma compilato è accessibile agli utenti di Windows senza licenze software. Per gli utenti Macintosh, il programma è limitato a quelli con una licenza software MATLAB. Il programma è illustrato tramite spettrogrammi EEG che variano in funzione di stati di sonno e veglia, e alterazioni indotte da oppiacei in quegli stati. Gli EEG dei topi C57BL/6J sono stati registrati in modalità wireless per 4 h dopo l'iniezione intraperitoneale di salina (controllo del veicolo) e dosi antinocicettive di morfina, buprenorfina e fentanil. Gli spettrogrammi mostravano che la buprenorfina e la morfina causavano cambiamenti simili nella potenza dell'EEG a 1-3 Hz e 8-9 Hz. Gli spettrogrammi smascherati effetti differenziali oppiacei sulla frequenza e la potenza EEG. Questi metodi basati su computer sono generalizzabili in tutte le classi di farmaci e possono essere facilmente modificati per quantificare e visualizzare un'ampia gamma di segnali biologici ritmici.

Introduzione

I dati EEG possono essere analizzati in modo produttivo nel dominio di frequenza per caratterizzare i livelli di eccitazione comportamentale e neurofisiologica¹. Gli spettrogrammi multitaper trasformano la forma d'onda EEG in domini di tempo e frequenza, con conseguente visualizzazione della potenza del segnale dinamico a frequenze diverse nel tempo. Lo spettrogramma multitaper utilizza l'analisi di Fourier per produrre stime della densità spettrale. La stima della densità spettrale separa una forma d'onda nelle onde sinusoidali pure che comprendono il segnale ed è analoga alla diffrazione della luce bianca attraverso un prisma per vedere l'intero spettro dei colori². Lo spettrogramma multitaper dell'EEG rappresenta l'attività combinata di più reti di neuroni con modelli di scarica che oscillano a diverse frequenze². A causa del suo spostamento temporale invariante, la trasformazione di Fourier è considerata la migliore trasformazione tra i domini di tempo e di frequenza³. L'analisi di Fourier ha anche una serie di limitazioni. I segnali EEG non sono stazionari. Pertanto, piccole modifiche potrebbero non essere percepite nei metodi di Fourier e l'analisi può variare a seconda delle dimensioni del set di dati. Tuttavia, il windowing viene utilizzato quando si applica una trasformazione di Fourier a un segnale non stazionario. Ciò presuppone che lo spettro del segnale cambi solo marginalmente per brevi periodi di tempo. Un metodo alternativo per l'analisi spettrale è la trasformazione wavelet che può essere più appropriata per rilevare la malattia cerebrale³.

Dal punto di vista funzionale, le diverse oscillazioni che comprendono un segnale EEG sono di livello inferiore, fenotipi dei tratti caratteristici dei fenotipi di stato di livello superiore come il sonno e la veglia², o la perdita di veglia causata da anestetici generali^4,5,6. Per quanto riguarda gli stati di sonno e veglia, lo spettrogramma dimostra chiaramente che i ritmi generati endogenamente del sonno sono continui e dinamici⁷. Le descrizioni quantitative degli stati di sonno e veglia hanno tradizionalmente coinvolto un processo di binning che assegna una classificazione di sonno o veglia a ciascuna epoca specificamente definita (ad esempio, 10 s) della registrazione EEG. Questi contenitori di stato vengono quindi tracciati in funzione del tempo. I grafici dei dati dei corsi temporali, spesso indicati come ipnogrammi, sono usati per differenziare il sonno normale dal sonno che viene interrotto dalla malattia, dalla somministrazione di farmaci, dai cambiamenti nei ritmi circadiani, dal lavoro a turni, ecc. Una limitazione dei grafici di ipnogramma è che travisano i segnali EEG esprimendo gli stati di eccitazione come forme d'onda quadra. Il plottaggio di ipnogrammi comporta una discretizzazione degli stati di eccitazione² e non consente una visualizzazione finemente granulosa delle fasi intermedie o di transizione. Inoltre, le epoche di punteggio 10 s producono una discretizzazione del tempo imponendo un limite inferiore sulla scala temporale. Il risultato della discretizzazione dello stato e del tempo è la perdita di informazioni neurofisiologiche per quanto riguarda l'interazione dinamica tra gli stati di coscienza² e la interruzione indotta dalla droga di questi stati⁴. Ad esempio, diversi agenti anestetici agiscono su diversi obiettivi molecolari e reti neurali. Manipolazione farmacologica di queste reti neurali produce in modo affidabile spettrogrammi unici per il farmaco, dose, e percorso di somministrazione^{4 .}

Il presente protocollo è stato sviluppato per facilitare la ricerca riguardante i meccanismi con cui gli oppioidi alterano il sonno⁸, respirando⁹, nociception¹⁰, e neurochimica del cervello¹¹. Questo protocollo descrive i passaggi necessari per creare uno spettrogramma multitapered per le analisi EEG che può essere completato utilizzando software proprietario o un sistema che non dispone di licenze MATLAB. I topi C57BL/6J (B6) sono stati utilizzati per convalidare la capacità di questo metodo basato su computer di creare nuovi spettrogrammi EEG durante normali stati indisturbati di sonno e veglia e dopo la somministrazione sistemica degli oppiacei. L'affidabilità e la validità delle analisi sono state confermate da raffronti sistematici delle differenze tra gli spettrogrammi EEG dopo che i topi B6 hanno ricevuto iniezioni intraperitoneali di salina (controllo del veicolo) e dosi antinocicettive di morfina, buprenorfina e fentanil.

Gli studi quantitativi sulle dinamiche eEG del topo neoatale hanno rilevanza traslazionale fornendo un modello per gli studi che mirano a ottenere una migliore comprensione dell'EEG¹²umano neoatale. Quantificare le dinamiche EEG non è solo descrittivo e può contribuire ad approcci di apprendimento automatico in grado di prevedere l'eccitazione in parte basati sui dati EEG¹³. L'obiettivo della presente relazione è quello di promuovere la scienza traslazionale fornendo un codice ampiamente accessibile e facile da usare per il calcolo di spettrogrammi multitaper che caratterizzano i cambiamenti indotti dalla droga nell'EEG del mouse.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono i topi hanno aderito alla Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio^(8a edizione, National Academies Press, Washington DC, 2011) e sono state esaminate e approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università del Tennessee.

1. Impianto di registrazione degli elettrodi e raccolta dei dati iniziali

1. Acquista i topi e conservali in una stanza a umidità e temperatura con accesso ad libitum ad cibo e acqua. Lasciare che i topi si adattino al loro nuovo ambiente per una settimana prima dell'impianto chirurgico degli elettrodi di registrazione. La procedura di impianto è stata descritta in dettaglio^1,14.
2. Sterilizzare tutte le apparecchiature chirurgiche.
3. Anestesizza i topi con isoflurano al 2,5%,3% erogati in ossigeno al 100%.
4. In seguito alla perdita del riflesso di raddifica, rimuovere il mouse dalla camera di induzione dell'anestesia e trasferirlo in un telaio stereotassico.
5. Applicare un unguento oftalmico su entrambi gli occhi.
6. Ridurre l'isoflurane all'1,7%, in modo continuo tramite una maschera.
7. Fare un'incisione del cuoio capelluto midline per esporre il cranio.
8. Forare due craniotomie sopra la corteccia sinistra e destra (ciascuna alle coordinate stereotassiche anteriori : 1,0 e laterale 3,0 rispetto al bregma¹⁵).
9. Inserire gli elettrodi EEG in ogni craniotomia e fissarli con acrilico dentale.
10. Impianto elettrodi bipolari nel muscolo trapezio dorsale per la registrazione dell'elettromiogramma (EMG).
    NOT: I quattro elettrodi sono portati a un telemetro wireless impiantato sottocutaneamente sopra il quadrante del corpo in basso a destra. Queste tecniche chirurgiche possono essere visualizzate qui (https://www.datasci.com/services/dsi-surgical-services/surgical-videos).
11. Dopo l'intervento chirurgico, somministrare carprofene analgesico e posizionare il topo in una gabbia di recupero calda. Osservare il mouse fino a quando non è ambulatoriale. Topo impiantato in casa singolarmente.
12. Al recupero completo dall'intervento chirurgico, maneggiare i topi ogni giorno e valutare la qualità delle registrazioni EEG ed EMG.
13. Configurare il sistema di acquisizione dei dati per registrare tutti i segnali 1.000 mV.
14. Ottenere le registrazioni EEG ed EMG per la durata necessaria.
15. Punteggia ogni 10 s bin delle registrazioni digitali EEG ed EMG come veglia, sonno rapido movimento degli occhi (REM), o non-REM (NREM) sonno utilizzando il software di punteggio del sonno.
    NOT: Tra i ceppi di topo ci sono differenze genotipi e state-specifiche nella potenza EEG espresse come percentuale della potenza totale¹⁶. Nei topi B6, gli stati di veglia sono caratterizzati da un EEG a 75-100 mV e da EEG a frequenza mista e da segnali EMG che mostrano un tono muscolare prominente con grandi aumenti di ampiezza durante il movimento. I criteri per segnare il sonno NREM includono una riduzione dell'ampiezza EMG rispetto all'ampiezza EMG della veglia. L'EEG del sonno NREM ha una frequenza più lenta e una maggiore ampiezza (100-150 mV) rispetto alla veglia. Il sonno REM è caratterizzato da atonia muscolare e da un segnale EEG simile all'EEG della veglia.
16. Istruire due individui a segnare in modo indipendente lo stesso record. Almeno un individuo deve essere accecato alla condizione del trattamento. I valori di concordanza tra i due dormitori devono essere superiori al 90%.

2. Strutture e attrezzature

1. Amplifica e digitalizza segnali EEG ed EMG non filtrati utilizzando strumentazione di acquisizione dati e software.
   NOT: Il Chronux Spectral Analysis Toolbox sviluppato nel Laboratorio Mitra del Cold Spring Harbor Laboratory viene utilizzato per esprimere i segnali EEG come potenza in relazione ai domini di tempo e frequenza.

3. Calcolo spettrogramma

1. Se un utente di Windows, utilizzare il programma compilato.
2. Se un utente Macintosh, eseguire il file di codice non elaborato.
3. Ottenere dati EEG non elaborati e non elaborati in formato EDF o CSV e inserirli nella stessa posizione del file di programma compilato.
   1. Assegnare un nome ai file di dati utilizzando i vincoli seguenti: i nomi devono essere costituiti solo da lettere, numeri, caratteri di sottolineatura o trattini.
   2. Assegnare un nome ai file di dati utilizzando i seguenti vincoli: i nomi dei file non devono contenere punti, virgole, spazi o altri simboli.
4. Scaricare il programma Spectrogramma Multitaper compilato (https://drive.google.com/).
5. Avviare il programma spettrogramma e seguire le istruzioni pop-up. Scegliere il tipo di file: . CSV o . Fes.
   NOT: Ulteriori dettagli di installazione del programma si trovano nel file readme.txt.
6. Digitare l'intero nome del file EEG (ad esempio, 419eeg.edf o 419.eeg.csv).
7. Selezionare i parametri per il calcolo dello spettrogramma: Predefinito o Nuovo. Questo passaggio richiede il tempo di elaborazione più lungo durante il calcolo dello spettrogramma. La funzione di windowing matematica (taper) fornisce stime statisticamente indipendenti dello spettro sottostante. Più lunga è la durata della registrazione, più lungo sarà il passaggio. Su una piattaforma PC che esegue Windows 10 questo ha richiesto un massimo di circa 3/4 min per una registrazione di 4 h.
   1. Utilizzare i seguenti parametri di spettrogramma predefiniti:
      Frequenza di campionamento: 500 Hz. Rappresenta il numero di campioni al secondo.
      fpass - 0,3 Hz e 30 Hz. Fpass definisce le frequenze di ingresso e controlla la gamma di frequenze fornite nell'uscita.
      Imbottitura n. 2. La spaziatura interna funziona per interpolare finemente l'output senza influire sul calcolo del risultato in alcun modo. Questo può aiutare con la visualizzazione e l'identificazione precisa delle linee spettrali. Il campo è qualsiasi numero intero compreso tra -1 e l'alto.
      Prodotto a larghezza di banda temporale (NW) : 15. Il prodotto della durata temporale del segnale e della larghezza spettrale.
      Numero di coni di 29 dollari. Quando si sceglie il numero di coni, è essenziale utilizzare 2NW-1. Non vi è alcun limite al numero di coni usati. Più coni utilizzati si tradurrà nell'inclusione di coni coni con scarsa concentrazione nella larghezza di banda di frequenza specificata.
      Media di prova: 1. Questo parametro determina se viene eseguita una prova o un canale di media. Se questo parametro è impostato su 0, non vi è alcuna media del canale e la funzione genererà risultati indipendenti per ogni prova o canale passato come dati di input. Tuttavia, se la media di prova è impostata su 1, l'output dei risultati per l'utente viene mediato su prove o canali.
      Tempo per calcolare FFT 30 s. Utilizzato per seguire l'evoluzione dello spettro calcolando lo spettro su molte piccole finestre.
      Dimensione della finestra per il calcolo FFT : 5. La quantità di avanzamento dell'intervallo di tempo scorrevole dopo l'esecuzione di ogni calcolo dello spettro.
      NOT: I parametri di spettrogramma predefiniti indicati nel passaggio 3.7.1 possono essere modificati in base alle esigenze.
8. Immettere i titoli per lo spettrogramma e l'EEG.
9. Salvare lo spettrogramma e l'EEG risultanti.
   1. Salvare le figure facendo clic su File . Salva nella finestra della figura.
      NOT: Le cifre forniranno agli utenti del programma riepiloghi che possono essere sviluppati in dati di qualità della pubblicazione.

4. Risoluzione dei problemi

1. Scaricare i dati EEG di sospensione del mouse di esempio per il calcolo dello spettrogramma di esempio.
2. Eseguire il programma con i dati di esempio per assicurarsi che l'utente utilizzi correttamente il programma. Individuare le cifre relative a questi dati di esempio nell'appendice per assicurarsi che le cifre create dai dati di esempio siano accurate.
   NOT: Tutte le attrezzature e i materiali utilizzati sono stati forniti nella Tabella dei Materiali.

Risultati

Le figure seguenti illustrano il tipo di nuove intuizioni sugli indici EEG dell'eccitabilità cerebrale fornite dagli spettrogrammi.

Figura 1A illustra le somiglianze e le differenze nell'EEG corticale durante la veglia, il sonno NREM e il sonno REM. Molti ricercatori utilizzano questo tipo di tracce, insieme alle registrazioni EMG (non mostrate), per quantificare sonno e veglia. La figura 1B utilizza un grafico di ipnogramma per trasmettere l'organizzazione temporale degli stati di sonno e veglia sulla base delle valutazioni delle registrazioni EEG ed EMG. Gli Stati sono stati segnati in epoche 10 s e queste epoche sono state tracciate come l'ipnogramma durante i 14.400 s che comprende la registrazione di 4 h. I grafici a immagini non illustrano il fatto che le transizioni tra gli stati sono continue e non lineari. A differenza di un grafico di ipnogramma, lo spettrogramma (Figura 1C) illustra cambiamenti altamente dinamici nella frequenza e potenza EEG in funzione del tempo. Lo spettrogramma evidenzia anche le somiglianze tra il segnale EEG corticale durante la veglia e durante il sonno REM. Le tre caselle sovrapposte allo spettrogramma (Figura 1C) indicano gli stati di veglia (WAKE), sonno NREM e REM nell'ipnogramma sopra riportato (Figura 1B) e sono fornite per facilitare la visualizzazione dei cambiamenti dettagliati nella frequenza e nell'alimentazione EEG. Lo spettrogramma per l'intera registrazione fornisce un apprezzamento sfumato dell'EEG come processo continuo.

Figura 2 fornisce quattro spettrogrammi multittamper, ciascuno riassumendo 4 h di registrazioni EEG dopo la somministrazione intraperitoneale di salina, morfina, buprenorfina, e fentanil. Tutte e quattro le registrazioni sono dello stesso mouse e sono state iniziate 2 h dopo l'insorgenza della luce. Gli oppiacei, ma non salini, inibito NREM e REM sonno, e aumentato la quantità di veglia. Gli spettrogrammi visualizzano alcune nuove funzionalità. La rilevazione di nuove caratteristiche EEG suggerisce la potenziale applicazione per la differenziazione degli oppiacei in un ambiente di minacce chimiche. Dopo l'iniezione salina (Figura 2A) la maggior quantità di energia risiedeva nella gamma di 2-4 Hz, che indica il sonno NREM. Si noti che gli spettrogrammi EEG sono stati fondamentalmente alterati dalla somministrazione di oppiacei e che ogni oppiaceo ha causato cambiamenti spettrali unici.

La figura 3 dimostra che i cambiamenti EEG illustrati dagli spettrogrammi possono essere quantificati ed espressi come potenza spettrale dominante media di ciascuna mezzafrequenza (Figura 3A) e come potenza spettrale media all'interno di specifiche bande di frequenza EEG (Figura 3B). Le maggiori differenze rispetto alla salina sono state causate dalla buprenorfina e si sono verificate nel delta e nella gamma theta.

Figura 1: Registrazioni Corticale EEG utilizzate per creare ipnogrammi e spettrogrammi. (A) Le forme d'onda EEG registrate durante la veglia, il sonno NREM e il sonno REM durante una registrazione di base (nessuna iniezione). Ogni traccia mostra 90 s di registrazione. (B) L'ipnogramma utilizza l'altezza delle barre per trasmettere lo stato di coscienza (coordinato) contro 4 h di registrazione (abscissa). (C) Spettrogramma rastremato utilizzando una barra dei colori per trasmettere la potenza EEG in decibel (dB, coordinata destra) o densità di potenza spettrale a diverse frequenze EEG in Hertz (Hz, coordinata sinistra) in funzione del tempo di registrazione di 4 h (abscissa). Linee verticali nere sono state aggiunte allo spettrogramma per delineare un episodio ciascuno di veglia, sonno NREM, e sonno REM. (Parametri di spettrogramma: frequenza di campionamento di 500 Hz, fpass , 0,3 Hz e 30 Hz, imbottitura - 2, larghezza di banda del tempo : 15, numero di coni 29, media di prova : 1, durata del tempo per calcolare FFT 30 s, dimensione del passo della finestra per il calcolo FFT - 5). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Spettrogrammi che illustrano i cambiamenti nella potenza e nella frequenza EEG causati dalla somministrazione di oppiacei. Ogni spettrogramma traccia la frequenza EEG in Hertz (Hz, ordinata sinistra) e decibel (dB) della potenza EEG utilizzando una barra dei colori (coordinata destra) per 4 h (abscissa) dopo la somministrazione di (A) morfina,morfina(C) buprenorphine e (D) fentanil. (Parametri di spettrogramma: frequenza di campionamento di 500 Hz, fpass , 0,3 Hz e 30 Hz, imbottitura - 2, larghezza di banda del tempo : 15, numero di coni 29, media di prova : 1, tempo per calcolare FFT 30 s, dimensione del passo della finestra per il calcolo FFT 5). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Gli oppiacei hanno alterato in modo differenziale la potenza EEG media all'interno del delta e delle bande di frequenza EEG theta. (A) Riepiloga la potenza EEG media durante ogni registrazione di 4 h illustrata nella Figura 2. Ordina traccia la potenza Media EEG ad ogni mezza frequenza (abscissa). Relativo al controllo salina, ognuna delle altre tre funzioni mostra alterazioni specifiche degli oppiacei nella potenza EEG media. (B) Illustra la potenza Media EEG in quattro bande di frequenza EEG (delta, theta, alfa e beta) dopo la somministrazione di salina (S), buprenorfina (B), morfina (M) e fentanil (F). La codifica a colori è la stessa per le funzioni di alimentazione in A e le bande di potenza medie in B. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Il programma qui descritto è stato sviluppato per creare uno spettrogramma utilizzando i nove passaggi descritti nella sezione 3 del protocollo, Spectrogram Computation. Questi passaggi prevedono l'acquisizione del programma spettrogramma, la garanzia del formato di file corretto e la modifica dei parametri di calcolo per la generazione di spettrogrammi utente univoci. Gli utenti possono creare spettrogrammi su misura per una serie di domande concettuali e progetti sperimentali. Al fine di migliorare la facilità e l'efficienza di questo processo di sviluppo, è essenziale fornire i dati EEG grezzi nel formato di file corretto, denominato in base ai vincoli descritti in precedenza. Anche se sono stati forniti segnali di esempio per i dati EEG del mouse, il programma spettrogramma è facilmente applicabile ai dati EEG umani e non umani privi di limitazioni di elaborazione del segnale.

L'approccio consigliato per la risoluzione dei problemi e la modifica del metodo consiste nell'eseguire l'analisi di un set di dati di piccole dimensioni. I principali risultati del programma da considerare includono i grafici dell'EEG filtrato e lo spettrogramma. Un aspetto interessante dello spettrogramma conico è che può essere applicato a un'ampia varietà di segnali biologici periodici. La varietà varia da ritmi circadiani di lunga durata (24 h)¹⁷ a ritmi molto veloci come i tassi di scarica di 1.000 Hz di una cellula Renshaw¹⁸.

La formattazione dei dati è un vincolo di questo protocollo di spettrogramma. Il formato dati europeo (EDF) è ampiamente utilizzato con i dati EEG. Tuttavia, ci sono molte altre opzioni di formattazione. Per questo motivo, il file di codice non elaborato è stato incluso (vedi 3.2 sopra) nel caso in cui l'utente desideri modificare il formato del file. Per quanto riguarda il file di programma raw, un'altra limitazione è la necessità di esperienza con il linguaggio di programmazione del computer al fine di modificare il formato del file. Non tutti i ricercatori hanno accesso al software proprietario e all'intera gamma di plug-in. Questo protocollo è stato sviluppato per aggirare questo problema fornendo un programma compilato che viene eseguito su un dispositivo basato su WINDOWS senza licenze software. Questo si ottiene attraverso il plugin RUNTIME che è incluso nel programma compilato e non richiede alcuna registrazione del software da parte dell'utente.

Questa routine spettrogramma EEG è un nuovo programma open source, basato su computer che consente agli utenti di creare spettrogrammi personalizzati e multitaper da una vasta gamma di dati. L'utente ha il controllo completo su tutti gli aspetti computazionali della generazione di spettrogrammi. Senza l'elaborazione preventiva del segnale e le conoscenze di programmazione del computer, gli spettrogrammi possono essere difficili da generare. Il protocollo qui descritto faciliterà la generazione di spettrogrammi. Consultare la sezione relativa al materiale supplementare per ulteriori letture di elaborazione del segnale e indicazioni per spettrogrammi multitaper.

Materiale supplementare
http://chronux.org
http://www-users.med.cornell.edu/~jdvicto/pdfs/pubo08.pdf
http://www.fieldtriptoolbox.org/tutorial/timefrequencyanalysis/
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4502759/#SD3-data

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dental acrylic	Lang Dental Manufacturing Co	Jet powder and liquid
EEG/EMG Amplifier	Data Science International	model MX2
macOS Mojave	Apple	v10.14.4
MATLAB	Mathworks	v9.4.0.813654	software for spectrogram comp.
Mouse anesthesia mask	David Kopf Instruments	model 907
Neuroscore	Data Science International	v3.3.9317-1	software for scoring sleep and wakefulness
Ponemah	Data Science International	v5.32	software for EEG/EMG Data Acquisition
Stereotaxic frame	David Kopf Instruments	model 962
Stereotaxic frame, mouse adapter	David Kopf Instruments	model 921
Windows 10	Microsoft	v10.0.17763.503
Wireless Telemeter	Data Science International	model HD-X02