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Resumo

Este protocolo apresenta um fluxo de trabalho experimental completo para estudar interações RNA-proteína usando pinças ópticas. Várias possíveis configurações experimentais são delineadas, incluindo a combinação de pinças ópticas com microscopia confocal.

Resumo

O RNA adota diversas dobras estruturais, essenciais para suas funções e, assim, podem impactar diversos processos na célula. Além disso, a estrutura e a função de um RNA podem ser moduladas por vários fatores trans-acionados, como proteínas, metabólitos ou outras RNAs. As moléculas de RNA de mudança de quadro, por exemplo, são RNAs regulatórias localizadas em regiões de codificação, que direcionam ribossomos de tradução em um quadro de leitura aberto alternativo e, assim, agem como interruptores genéticos. Eles também podem adotar diferentes dobras após a ligação a proteínas ou outros fatores trans. Para dissecar o papel das proteínas vinculantes ao RNA na tradução e como elas modulam a estrutura e a estabilidade do RNA, é crucial estudar as características interpulsão e mecânica desses complexos de proteína RNA simultaneamente. Este trabalho ilustra como empregar pinças ópticas acopladas a uma molécula única para explorar a paisagem conformacional e termodinâmica dos complexos de proteína RNA em alta resolução. Como exemplo, elabora-se a interação do elemento ribossômico programado SARS-CoV-2 com o fator trans-ação de isoforme curto da proteína antiviral de dedo de zinco. Além disso, ribossomos rotulados por fluorescência foram monitorados utilizando-se a unidade confocal, o que, em última análise, permitiria o estudo do alongamento da tradução. O ensaio de fluorescência acoplado de OT pode ser amplamente aplicado para explorar diversos complexos de proteína RNA ou fatores trans-atuantes que regulam a tradução e poderia facilitar estudos de regulação genética baseada em RNA.

Introdução

A transferência de informações genéticas do DNA para as proteínas através dos mRNAs é um processo bioquímico complexo, que é precisamente regulado em todos os níveis através de interações macromoleculares dentro das células. Para a regulação translacional, as interações RNA-proteína conferem um papel crítico para reagir rapidamente a vários estímulos e sinais1,2. Algumas interações RNA-proteína afetam a estabilidade do mRNA e, assim, alteram o tempo em que um RNA é tratilicamente ativo. Outras interações RNA-proteína estão associadas a mecanismos de recodificação, como leitura stop-codon, bypass ou mudança de quadro ribossômico programada (PRF)3,4,5,6,7. Recentemente, uma série de proteínas de ligação de RNA (RBPs) foram demonstradas para interagir com elementos estimulantes de mRNA e a máquina de tradução para ditar quando e quanta reco codificação ocorrerá nas células7,8,9,10,11. Assim, dissecar o papel das proteínas vinculantes ao RNA na tradução e como elas modulam a estrutura e a estabilidade do RNA, é fundamental estudar os princípios de interação e propriedades mecânicas desses complexos de proteína RNA em detalhes.

Décadas de trabalho estabeleceram as bases para estudar o processo de tradução multi-passo e multicomponente, que conta com a comunicação intrincada entre o RNA e componentes proteicos da máquina de tradução para alcançar velocidade e precisão12,13,14. Um próximo passo crucial na compreensão de eventos regulatórios complexos é determinar as forças, escalas de tempo e determinantes estruturais durante a tradução em alta precisão12,15,16,17. O estudo da dinâmica conformacional do RNA e especialmente como fatores auxiliares trans-acionam na estrutura do RNA durante a tradução foram ainda mais iluminados pelo surgimento de ferramentas de molécula única, incluindo pinças ópticas ou guias de ondas de modo zero16,17,18,19,20,21,22,23,24 25,26.

A pinça óptica (OT) representa uma técnica de molécula única altamente precisa, que tem sido aplicada para estudar muitos tipos de processos dinâmicos dependentes de RNA, incluindo transcrição, e tradução26,27,28,29,30,31,32. O uso de pinças ópticas permitiu a sondagem de interações moleculares, estruturas de ácido nucleico e propriedades termodinâmicas, cinéticas e energéticas desses processos em detalhes16,17,22,33,34,35,36,37,38,39 . O ensaio óptico da pinça é baseado na armadilha de objetos microscópicos com um raio laser focado. Em um experimento típico de OT, a molécula de interesse é amarrada entre duas contas transparentes (geralmente poliestireno) (Figura 1A)27. Essas contas são então capturadas por armadilhas ópticas, que se comportam como molas. Assim, a força aplicada na molécula pode ser calculada com base no deslocamento da conta do centro do raio laser focal focado (centro da armadilha). Recentemente, pinças ópticas foram combinadas com microscopia confocal (Figura 1B), permitindo medidas de fluorescência ou transferência de energia de ressonância Förster (FRET)40,41,42. Isso abre um novo campo de possíveis experimentos permitindo medição simultânea e, portanto, correlação precisa de dados de espectroscopia de força e fluorescência.

Aqui, demonstramos experimentos usando as pinças ópticas combinadas com microscopia confocal para estudar interações proteína-RNA regulando a mudança de quadro translacional. Entre o objetivo e o condensador, uma célula de fluxo com cinco canais permite a aplicação contínua da amostra com fluxo laminar. Através dos canais microfluidos, vários componentes podem ser injetados diretamente, o que diminui o tempo prático, além de permitir muito pouco consumo amostral ao longo do experimento.

Em primeiro lugar, uma diretriz básica para auxiliar o desenho de experimentos OT é proposta e vantagens, bem como armadilhas de várias configurações são discutidas. Em seguida, são descritas amostras e fluxos de trabalho experimentais e um protocolo para a análise dos dados. Para representar um exemplo, descrevemos os resultados obtidos a partir de experimentos de alongamento de RNA para estudar o elemento RNA de mudança de quadro SARS-CoV-2 (Figura 2A) com o fator trans-ação o isoforme curto da proteína antiviral de dedo de zinco (ZAP), que altera a tradução do RNA viral de um quadro de leitura alternativo43. Além disso, demonstra-se que ribossósicos rotulados por fluorescência podem ser empregados neste ensaio confocal OT, o que seria útil para monitorar a processividade e a velocidade da máquina de tradução. O método aqui apresentado pode ser usado para testar rapidamente o efeito de diferentes buffers, ligantes ou outros componentes celulares para estudar vários aspectos da tradução. Finalmente, são discutidas armadilhas experimentais comuns e como solucioná-las. Abaixo, alguns pontos cruciais no design experimental são delineados.

Projeto de construção
Em princípio, existem duas abordagens comuns para criar um RNA compatível com OT. A primeira abordagem emprega uma molécula de RNA longa que é hibridizada com alças de DNA complementares, produzindo assim um construto composto por duas regiões híbridas de RNA/DNA flanqueando uma sequência de RNA de uma única linha no meio (Figura 2B). Essa abordagem é empregada na maioria dos experimentos de RNA OT33,44,45.

A segunda abordagem aproveita as alças dsDNA com saliências curtas (em torno de 20 nt) 15,17. Essas saliências são então hibridizadas com a molécula de RNA. Embora mais complicado no design, o uso de alças dsDNA supera algumas das limitações do sistema DNA/RNA-híbrido. Em princípio, mesmo alças muito longas (>10kb) podem ser implementadas, o que é mais conveniente para medições confocal. Além disso, a molécula de RNA pode ser ligada às alças de DNA para aumentar a estabilidade das amarras.

Estratégia de rotulagem final
A construção deve ser amarrada a contas através de uma forte interação molecular. Embora existam abordagens disponíveis para a ligação covalente de alças a contas46, interações fortes, mas não covalentes, como streptavidin-biotina e digoxigenina-anticorpo são comumente usadas em experimentos OT15,33,35,45. No protocolo descrito, a construção é rotulada com biotina ou digoxigenina, e as contas são revestidas com streptavidina ou anticorpos contra digoxigenina, respectivamente (Figura 1A). Esta abordagem seria adequada para a aplicação de forças de até aproximadamente 60 pN (por tether)47. Além disso, o uso de diferentes estratégias de rotulagem de 5' e 3' permitem determinar a orientação da corda formada entre as contas17.

Rotulagem de proteínas para medidas de fluorescência
Para a imagem confocal, existem várias abordagens comumente utilizadas para rotulagem de fluorescência. Por exemplo, fluoroforos podem ser covalentemente ligados a resíduos de aminoácidos que são encontrados nativamente em proteínas ou introduzidos por mutagênese direcionada ao local através de um grupo orgânico reativo. Corantes de tiol ou amina-reativa podem ser usados para rotulagem de resíduos de cisteína e liseina, respectivamente. Existem vários métodos de proteção reversíveis para aumentar a especificidade da rotulagem48,49, porém as proteínas nativas normalmente seriam rotuladas em múltiplos resíduos. Embora o pequeno tamanho do fluorohore possa conferir uma vantagem, a rotulagem não específica pode interferir na atividade proteica e, portanto, a intensidade do sinal pode variar49. Além disso, dependendo da intensidade do sinal de eficiência de rotulagem pode diferir entre diferentes experimentos. Portanto, uma verificação de atividade deve ser realizada antes do experimento.

Caso a proteína de interesse contenha uma tag terminal N ou C, como uma tag His ou marca de estreptococos, a rotulagem específica dessas tags representa outra abordagem popular. Além disso, a rotulagem direcionada a tags reduz a chance do fluorohore interferir na atividade proteica e pode aumentar a solubilidade49. No entanto, a rotulagem específica de etiquetas geralmente produz proteínas rotuladas mono-fluorforo, o que pode ser desafiador de detectar. Outra forma de rotulagem específica pode ser realizada empregando anticorpos.

Configuração de microfluidos
A combinação de OT com um sistema de microfluidos permite uma transição rápida entre diferentes condições experimentais. Além disso, os sistemas atuais aproveitam a manutenção do fluxo laminar dentro da célula de fluxo, o que impede a mistura de líquidos de outros canais na direção perpendicular em relação à direção de fluxo. Portanto, o fluxo laminar é particularmente vantajoso para o design experimental. Atualmente, células de fluxo com até 5 canais são comumente empregadas (Figura 3).

Protocolo

1. Preparação da amostra

  1. Clone a sequência de interesse no vetor contendo os fragmentos de DNA lambda, que servem como sequências de alça (Figura 2)43,50.
  2. Primeiro gerar um modelo de DNA para transcrição in vitro subsequente via PCR (Figura 2B; reação 1). Nesta etapa do PCR, o promotor T7 é adicionado no final de 5' da molécula de DNA de sentido32,33,43,50. Defina a reação do PCR de acordo com a Tabela 1. Execute o PCR em alíquotas de 50 μL com ciclos apropriados no termociclador.
  3. Prepare as alças por duas reações de PCR separadas (Tabela 1, Figura 2B; reação 2 e 3). Primeiro, gere a alça de 5' por PCR. Em seguida, gere a alça de 3' e rotule-a simultaneamente com digoxigenina usando uma cartilha de 5' com etiqueta de digoxigenina, 32,33,43,50.
  4. Depois do PCR, purificar o DNA usando colunas de giro de sílica.
  5. Realize a reação de transcrição in vitro usando a polimerase T7 RNA (Tabela 2)32,33,43,50. Incubar a reação a 37 °C por 2-4 h, dependendo do comprimento do RNA. Em seguida, adicione DNase I à reação e incubar a 37 °C por 30 min para digerir o modelo de DNA. Purifique o RNA usando colunas de giro de sílica.
  6. Durante a reação de rotulagem da alça de 5''(Tabela 3), adicione biotina-16-dUTP na extremidade de 3' da alça por polimerase de DNA T438,50. Realize a reação à temperatura ambiente durante 1-2 h. Depois, purificar o DNA usando colunas de giro de sílica.
    NOTA: Uma vez que a alça de 5' deve ser rotulada no final de 3' (Figura 2B), a rotulagem não pode ser realizada durante o PCR.
  7. Misture os componentes mencionados acima - alça de 5' (3' rotulada com biotina), alça de 3' (5' rotulada com digoxigenina) e RNA - em uma relação molar de 1:1:1 no tampão de corte (80% de formamida, 400 mM NaCl, 40 mM HEPES, pH 7.5, 0,5 mM EDTA, pH 8), para obter o híbrido RNA/DNA desejado (Tabela 4). Aqueça a mistura de ressarcimento até 85 °C por 10 min e depois esfrie lentamente até 4 °C.
  8. Misture a amostra encolhida com 1/10 de volume de acetato de sódio de 3 M (pH 5), 3 volumes de etanol gelado e incubar a -80 °C por pelo menos 1 h ou a -20 °C durante a noite.
  9. Centrifugar as amostras a 15.000 × g por 30 min a 4 °C. Descarte o sobrenante e seque a pelota (geralmente não visível) sob vácuo.
  10. Finalmente, resuspend, a pelota em 50 μL de água sem RNase e fazer alíquotas. Armazene as alíquotas a -80 °C até usar. Para armazenamento a curto prazo, as amostras também podem ser armazenadas a -20 °C.

2. Configuração do instrumento

NOTA: O protocolo a seguir é otimizado para o instrumento de pinça óptica comercial C-Trap da empresa LUMICKS. Portanto, ajustes nas etapas apresentadas podem ser necessários ao utilizar outros instrumentos ópticos de pinça. Se não for utilizado, o sistema de microfluidos da máquina é mantido em alvejante (solução de hipoclorito de sódio) e deve ser lavado antes do uso.

  1. Descarte o alvejante e encha as seringas com 1 mL de água sem RNase.
  2. Adicione 50 μL de 0,5 M de tiossulfito de sódio a pelo menos 1 mL da água sem RNase e lave completamente o sistema (1 barra, pelo menos 0,5 mL) para eliminar o restante do alvejante no sistema.
  3. Descarte a solução de tiossulfato de sódio das seringas. Substitua as seringas por as frescas e lave o sistema por pelo menos 0,5 mL de água sem RNase.
    NOTA: Tenha cuidado, que o sistema de microfluidos nunca seque para evitar bolhas de ar no sistema.
  4. Coloque 2 gotas de óleo de imersão (índice de refração de 1,33) ou aproximadamente 70 μL de água em cima do objetivo.
  5. Coloque a célula de fluxo dentro da estrutura de retenção em sua posição.
  6. Coloque 2 gotas de óleo de imersão (índice de refração de 1,51) em cima da célula de fluxo.
  7. Ligue o dispositivo laser na máquina de pinças. Uma vez que esteja em execução, ligue o laser de trapping na interface de software em 100%.
  8. Utilizando câmeras de diagnóstico (Z-finder), ajuste o eixo Z para o meio da câmara entre a segunda e a terceira reflexões (interfaces) onde os anéis de refração são os maiores, girando o micro parafuso.
    NOTA: Cada vez que o objetivo é movido mais perto da câmara de medição e o plano focal do objetivo cruza a interface entre duas fases, um reflexo pode ser reconhecido no modo Z-finder. Há 4 interfaces possíveis: (i) óleo de água/imersão e vidro inferior (ii) vidro inferior e tampão dentro do tampão da câmara (iii) dentro da câmara e vidro superior (iv) vidro superior e óleo de imersão para condensador.
  9. Ajuste a posição do condensador (ajuste o laser de trapping para aproximadamente 50%) para que o condensador toque o óleo de imersão em cima da câmara de medição.
  10. Ajuste o foco movendo-se lentamente para baixo/para cima com o condensador, de modo que aproximadamente 10 faixas de luz são mostradas no modo lua (câmeras de diagnóstico).

3. Medição da amostra

  1. Incubar contas revestidas de anti-digoxigenina (AD) com os construtos de amostra (3 μL de 0,1% (w/v) suspensão de contas de AD + 4 μL de amostra) e com 1 μL de inibidores de RNase e 8 μL do tampão de ensaio (300 mM KCl, 5 mM MgCl2, 20 mM HEPES, pH 7.6, 0,05% Tween 20, 5 mM DTT) na RT por 10-20 min. Após a incubação, diluir a amostra em 500 μL de tampão de ensaio.
    NOTA: Recomenda-se adicionar catadores de oxigênio, particularmente durante as medições de fluorescência ao buffer, a fim de evitar danos oxidativos. Aqui foi utilizado sistema de catalase de oxigênio contendo glicose (8,3 mg/mL), glicose oxidase (40 U/mL) e catalase (185 U/mL).
  2. Misture 0,8 μL de 1% (w/v) contas revestidas de streptavidin (SA) com 1 mL de tampão de ensaio.
  3. Descarte a água das seringas e encha as seringas com as respectivas suspensões/soluções. Lave por pelo menos 2 min em aproximadamente 1 bar, e depois comece a pegar contas.
    NOTA: Dependendo da configuração experimental, podem ser utilizados diferentes arranjos de canais (Figura 3). Normalmente, um canal de fluxo é preenchido com contas anti-digoxigenina carregando a molécula de RNA. Um segundo canal está cheio com as contas revestidas de streptavidin. O canal buffer é usado para formar as amarras. Um quarto canal pode ser empregado para carregar a proteína de ligação RNA (Figura 3C), ou, alternativamente, o RBP pode ser adicionado diretamente no canal tampão (Figura 3B).
  4. Para capturar as contas, mova as armadilhas ópticas umas das outras. Primeiro vá para o canal de AD e pegue uma conta em armadilha 1. Em seguida, mova o palco para o canal SA e pegue uma única conta SA por armadilha 2.
    NOTA: Tente ficar na interface dos canais tampão e contas para evitar perder a conta já capturada, ou para evitar pegar várias contas pela mesma armadilha.
  5. Uma vez que as contas do tamanho certo sejam capturadas, mova-se para o canal tampão e pare o fluxo laminar. Em seguida, execute a calibração da força para verificar a rigidez da armadilha. Os respectivos valores de rigidez não devem diferir no eixo x/y em mais de 10-15%.
    NOTA: Ajuste a potência do laser ou a divisão do laser entre as armadilhas de acordo com o tamanho das contas. A calibração da força não precisa ser feita para cada par de contas, desde que os modelos de contas coinceram (pontuação de similaridade > 0,9). No entanto, deve ser realizado regularmente, ou pelo menos toda vez que as condições de ensaio são alteradas.
  6. Comece a pescar por uma corda movendo as contas perto uma da outra, esperando por alguns segundos, e depois movendo-as de volta, repita até formar uma corda. Uma formação de corda resulta em um aumento de força medida ao puxar as duas contas para longe uma da outra.
    NOTA: Para evitar a formação de múltiplas amarras, as contas não devem ser movidas muito perto. Ao pegar uma corda entre as duas contas, a qualidade da corda pode ser verificada encontrando o planalto de alongamento excessivo. O planalto deve ficar entre 50 a 60 pN para uma única corda.
  7. Ao obter uma corda, inicie a medição. Dependendo do fenômeno estudado devem ser escolhidas diferentes configurações de medição (Figura 1B-D).
    NOTA: Geralmente, no início do experimento, um experimento de rampa de força é realizado para verificar a qualidade da corda e sondar o comportamento. Depois, pode-se também iniciar os experimentos de força constante ou de posição constante para estudar ainda mais as transições do Estado. Uma vez que um número suficiente de medições tenha sido realizado em uma amostra de RNA para determinar seu comportamento, fatores rotulados podem ser adicionados ao sistema para realizar medições confocal.
  8. Para realizar medições de fluorescência, ligue os lasers confocal e a unidade do contador de fótons no instrumento pinça óptica.
  9. Ligue o laser de excitação do comprimento de onda desejado na interface de software e defina a potência do laser para 5% ou mais, dependendo do fluoróforo.
    NOTA: Embora não medindo a configuração de potência do laser de excitação para 0% para evitar fotodamagem excessiva para a amostra.
  10. Comece a fotografar a amostra usando funções de imagem do software.
    NOTA: Para obter imagens bem focadas, o plano focal do microscópio confocal e armadilhas ópticas devem ser alinhados. Para isso, pode-se empregar a autofluorescência das contas de poliestireno no canal laser azul. O plano focal das armadilhas ópticas é movido para cima ou para baixo no eixo z até que a imagem das contas atinja seu diâmetro mais alto. Nesta posição, o sinal de fluorescência da molécula amarrada entre as contas pode ser medido.
  11. Para usar a função kymograph, especifique a posição x-y do eixo kymograph para permitir a detecção da corda entre as contas.
  12. Ao longo da medição, a composição do buffer pode ser facilmente alterada movendo as contas para diferentes canais ou alterando o buffer fornecido no sistema de microfluidos.

4. Análise de dados

  1. Pré-processamento de dados brutos
    1. Usando um script simples, desça os dados brutos o suficiente para (i) permitir o processamento de dados subsequente mais rápido, mas (ii) ainda contêm todas as informações críticas (Figura 4A). Normalmente, 100-5000 Hz é adequado para este fim.
      NOTA: A frequência de coleta de dados em experimentos ópticos de pinças é muitas vezes maior do que é necessária para a análise - nos experimentos apresentados, a frequência de coleta de dados é definida como 78 125 Hz por padrão. Uma vez que o espaço de armazenamento é limitado, é conveniente e economia de tempo reduzir a taxa de amostragem dos dados. Aqui, os dados brutos foram derrubados por um fator de 30.
    2. Em seguida, empregue um filtro de sinal para reduzir o ruído de medição de alta frequência do sinal (Figura 4A). Ajuste o grau do filtro e os parâmetros de frequência de corte de acordo para otimizar a saída de dados de diferentes experimentos (Figura 5).
      NOTA: Entre os filtros de sinal, o filtro Butterworth51 é um dos mais utilizados. Um script python escrito sob medida permitindo o pré-processamento de dados brutos é fornecido nos dados complementares. Os parâmetros de redução e filtragem de sinal (frequência de corte, grau de filtro) precisam ser otimizados para diferentes experimentos.
  2. Para análise de dados de rampa de força, use as seguintes etapas.
    1. Marque os passos manualmente, encontrando pontos correspondentes no enredo da trajetória da força ou usando scripts personalizados. Os passos desdobrados são caracterizados por uma queda brusca de força combinada com um aumento da distância na curva de distância de força (FD).
    2. Uma vez marcados os eventos desdobrado, encaixe diferentes regiões da curva FD usando modelos apropriados (Figura 4D).
      NOTA: Para a região antes do primeiro passo de desdobramento, a corda pode ser considerada "duplamente encalhada" e é comumente adequada usando um modelo extensível de corrente semelhante a worm (WLC)47,52,53. As partes após o primeiro evento de desdobramento são consideradas uma combinação de nucleotídeos de dupla fita (alças) e nucleotídeos de fio único (molécula de RNA desdobrada). Portanto, o encaixe de dados é mais complexo - geralmente uma combinação de 2 modelos WLC ou WLC e modelos de cadeia livremente articulada (FJC) são empregados36,39,52. O modelo WLC extensível tem dois parâmetros principais de ajuste, o comprimento do contorno (LC) e o comprimento da persistência (LP). O comprimento do contorno corresponde ao comprimento da molécula totalmente esticada e o comprimento da persistência define as propriedades de dobra da molécula de interesse. O modelo pode ser descrito com a seguinte equação (1). O WLC pode ser usado para modelar o comportamento tanto de regiões dobradas quanto desdobradas, embora para cada um deles um modelo separado com parâmetros diferentes tenha que ser empregado.
      (1) figure-protocol-14409
      onde x é extensão, LC é comprimento de contorno, F é força, LP é comprimento de persistência, kB é boltzmann constante, T é temperatura termodinâmica, e S é módulo de estiramento.
      O segundo modelo chamado cadeia livremente articulada (FJC) é comumente usado para descrever o comportamento de regiões únicas encalhadas desdobradas. Utiliza parâmetros semelhantes dos polímeros, mas trata cada unidade da "cadeia" como uma haste rígida, aqui correspondente aos nucleotídeos da região única encalhada desdobrada. A seguinte equação (2) descreve este modelo:
      (2) figure-protocol-15077
      NOTA: Nosso laboratório desenvolveu recentemente um algoritmo que permite o processamento em lote dos dados de rampa de força bruta chamado "Prático Tweezers Analysis TOol (BATATA)54". O algoritmo diminui e filtra os dados, então identifica possíveis etapas de desdobramento e finalmente executa a montagem de dados. O BATATA é construído em uma interface de usuário gráfico amigável (GUI) (https://github.com/REMI-HIRI/POTATO).
  3. Processar dados de força constante da seguinte forma:
    NOTA: As seguintes instruções podem ser aplicadas ana analogicamente em dados de posição constante.
    1. Para os dados de força constante, plote a distância ao longo do tempo (Figura 5). Um histograma mostrando a frequência (contagem) de diferentes conformações sobre a mudança relativa de posição é uma maneira útil de caracterizar vários estados dominantes e menores (Figura 7).
    2. Ajuste o histograma usando (múltiplas) funções gaussianas para estimar a porcentagem global de conformadores individuais a uma determinada força (Figura 7C). O gaussiano se encaixa, posição média, e o desvio padrão descreve a relação relacionada à força entre diferentes populações.
      NOTA: Um script python escrito sob medida que permite o pré-processamento e o encaixe bimodal básico de dados de força constante são fornecidos nos dados complementares. Os parâmetros (frequência de corte, grau de filtro, meios esperados, valores de desvio padrão e amplitudes) precisam ser otimizados para diferentes experimentos.
    3. Em seguida, empregue o modelo Hidden Markov para analisar melhor os estados, o que pode descobrir intermediários dobráveis adicionais (conformadores)55. Para obter mais informações sobre o modelo De markov de força constante e hidden, pode-se referir-se a 55,56,57,58.

Resultados

Nesta seção, o foco é dado principalmente em medidas de interações RNA-proteína/ligand pelas pinças ópticas fluorescência. Para uma descrição dos experimentos gerais de pinça óptica RNA e resultados representativos correspondentes, consulte32. Para uma discussão mais detalhada das interações RNA/DNA-proteína, consulte também 1,2,26,59,60.

Discussão

Aqui, demonstramos o uso de pinças ópticas acopladas à fluorescência para estudar interações e comportamento dinâmico de moléculas de RNA com vários ligantes. Abaixo, são discutidas etapas críticas e limitações da presente técnica.

Passos críticos no protocolo
Como para muitos outros métodos, a qualidade da amostra é fundamental para obter dados confiáveis. Portanto, para obter as amostras de maior qualidade possível, vale a pena gastar tempo para otimiza...

Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Agradecemos a Anuja Kibe e ao Prof. Redmond Smyth por revisarem criticamente o manuscrito. Agradecemos a Tatyana Koch pela assistência técnica especializada. Agradecemos a Kristyna Pekarkova pela ajuda na gravação de vídeos experimentais. O trabalho em nosso laboratório é apoiado pela Associação Helmholtz e financiamento do Conselho Europeu de Pesquisa (ERC) Grant Nr. 948636 (para a NC).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Bacterial Strains
E. coli HB101lab collectionN/Acloning of the vectors
Chemicals and enzymes
Sodium chlorideSigma-Aldrich31424Buffers
Biotin-16-dUTPRoche11093070910Biotinylation
BSASigma-AldrichA4737Buffers
CatalaseLumicksN/AOxygen scavanger system
Dithiothreitol (DTT)Melford LabsD11000Buffers
DNAse I from bovine pancreasSigma-AldrichD4527in vitro transcription
dNTPsTh.Geyer11786181PCR
EDTASigma-AldrichE9884Buffers
FormamideSigma-Aldrich11814320001Buffers
GlucoseSigma-AldrichG8270-1KGOxygen scavanger system
Glucose-oxidaseLumicksN/AOxygen scavanger system
HEPESCarl RothHN78.3Buffers
Magnesium chlorideCarl Roth2189.1Buffers
Phusion DNA polymeraseNEBM0530LGibson assembly, cloning
Potassium chlorideMerck529552-1KGBuffers
PrimeSTAR GXL DNA PolymeraseTakara Bio ClontechR050APCR
Pyrophosphotase, thermostabile, inorganicNEBM0296Lin vitro transcription
RNase InhibitorMolox1000379515Buffers
rNTPSlife technologiesR0481in vitro transcription
Sodium thiosulophateSigma-AldrichS6672-500GBleach deactivation
Sytox GreenLumicksN/Aconfocal measurements
T4 DNA PolymeraseNEBM0203SBiotinylation
T5 exonucleaseNEBM0363SGibson assembly, cloning
T7 RNA polymeraseProduced in-houseN/Ain vitro transcription
Taq DNA polymeraseNEBM0267SPCR
Taq ligaseBiozymL6060LGibson assembly, cloning
TWEEN 20 BioXtraSigma-AldrichP7949Buffers
Kits
Monolith Protein Labeling Kit RED-NHS 2nd Generation (Amine Reactive)NanotemperMO-L011Used for ribosome labeling
Purefrex 2.0GeneFrontierPF201-0.25-EXRibosomes used for the labeling
Oligonucleotides
5' handle T7 forwardMicrosynthcustom order5’ - CTTAATACGACTCACTATAGGTC
CTTTCTGTGGACGCC - 3’, used to generate OT in vitro transcription template in PCR 1
3’ handle reverseMicrosynthcustom order5' -  GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC - 3', used to generate OT in vitro transcription template in PCR 1
5' handle forwardMicrosynthcustom order5' - TCCTTTCTGTGGACGCCGC - 3' , used to generate 5' handle in PCR 2
5’ handle reverseMicrosynthcustom order5’ - CATAAATACCTCTTTACTAATATA
TATACCTTCGTAAGCTAGCGT - 3’, used to generate 5' handle in PCR 2
3’ handle forwardMicrosynthcustom order5' - ATCCTGCAACCTGCTCTTCGCC
AG - 3', used to generate 3' handle in PCR 3
3’ handle reverse 5’labeled with digoxigeninMicrosynthcustom order5' -[Dig]-GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC - 3', used to generate 3' handle in PCR 3
DNA vectors
pMZ_OTproduced in-houseN/Afurther description in "Structural studies of Cardiovirus 2A protein reveal the molecular basis for RNA recognition and translational control"
Chris H. Hill, Sawsan Napthine, Lukas Pekarek, Anuja Kibe, Andrew E. Firth, Stephen C. Graham, Neva Caliskan, Ian Brierley
bioRxiv 2020.08.11.245035; doi: https://doi.org/10.1101/2020.08.11.245035
Software and Algorithms
Atomhttps://atom.io/packages/ide-pythonN/A
BluelakeLumicksN/A
Graphpadhttps://www.graphpad.com/N/A
InkScape 0.92.3https://inkscape.org/N/A
Matlabhttps://www.mathworks.com/products/matlab.htmlN/A
POTATOhttps://github.com/lpekarek/POTATO.gitN/A
RNAstructurehttps://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructure.htmlN/A
Spyderhttps://www.spyder-ide.org/N/A
Other
Streptavidin Coated Polystyrene Particles, 1.5-1.9 µm, 5 ml, 1.0% w/vSpherotechSVP-15-5
Anti-digoxigenin Coated Polystyrene Particles, 2.0-2.4 µm, 2 ml, 0.1% w/vSpherotechDIGP-20-2
SyringesVWRTERUMO SS+03L1
Devices
C-trapLumicksN/A optical tweezers coupled with confocal microscopy

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