Triagem Cromossômica de Embriões Humanos Pré-implantacionais Utilizando Meio de Cultura Usado: Coleta de Amostras e Análise de Ploidia Cromossômica

Resumo

O presente estudo relata um protocolo de triagem cromossômica de embriões humanos que utiliza meio de cultura usado, o que evita a biópsia embrionária e permite a identificação de ploidia cromossômica usando NGS. O presente artigo apresenta o procedimento detalhado, incluindo a preparação do meio de cultura, amplificação do genoma completo (WGA), preparação da biblioteca de sequenciamento de próxima geração (NGS) e análise dos dados.

Resumo

Na fertilização clínica in vitro (FIV), o método predominante para PGT-A requer biópsia de algumas células do trofectoderma (TE). Esta é a linhagem que forma a placenta. Esse método, no entanto, requer habilidades especializadas, é invasivo e sofre de falsos positivos e negativos porque os números cromossômicos no ET e a massa celular interna (MCI), que se desenvolve no feto, nem sempre são os mesmos. O NICS, uma tecnologia que requer o sequenciamento do DNA liberado no meio de cultura tanto do TE quanto do ICM, pode oferecer uma saída para esses problemas, mas já demonstrou ter eficácia limitada. O presente estudo relata o protocolo completo do NICS, que inclui métodos de amostragem em meio de cultura, amplificação do genoma completo (WGA) e preparação de bibliotecas, e análise de dados NGS por software de análise. Considerando os diferentes tempos de criopreservação em diferentes laboratórios de embriões, os embriologistas possuem dois métodos de coleta de meio de cultura embrionário que podem ser selecionados de acordo com as condições reais do laboratório de FIV.

Introdução

As tecnologias de reprodução assistida (TARA) têm sido cada vez mais utilizadas para o tratamento da infertilidade. No entanto, a taxa de sucesso da TARV, como a FIV, tem sido limitada, e a taxa de perda gestacional é significativamente maior do que a da população normal¹. A principal causa desses problemas são as anormalidades cromossômicas, comumente existentes em embriões humanos pré-implantacionais². A PGT-A é um método eficaz de triagem de embriões para equilíbrio cromossômico antes da implantação ^3,4. Alguns estudos comprovaram que a PGT-A pode reduzir a taxa de aborto e melhorar a taxa de gravidez 5,6,7,8. No entanto, a PGT-A requer conhecimentos técnicos complexos que exigem treinamento e experiência específicos. O procedimento de biópsia invasiva de embriões também poderia potencialmente causar danos aos embriões⁹. Estudos têm demonstrado que a biópsia de blastômeros pode dificultar o desenvolvimento subsequente, e o número de TEs biopsiados pode afetar as taxas de implante¹⁰. Embora a questão da biossegurança a longo prazo da biópsia embrionária ainda não tenha sido completamente avaliada em humanos, estudos em animais têm mostrado suas influências negativas no desenvolvimento embrionário^11,12,13.

Relatos anteriores indicaram que traços de materiais de DNA foram secretados para o meio de cultura durante o desenvolvimento embrionário, e esforços têm sido feitos para realizar triagem cromossômica abrangente (CCS) usando meio de cultura embrionário usado 14,15,16,17,18. No entanto, as taxas de detecção e a acurácia dos testes não atenderam aos requisitos para uso clínico extensivo. O presente estudo relatou uma melhora no ensaio NICS para aumentar as taxas de detecção, bem como a acurácia do teste NICS¹⁹. Nos últimos anos, o líquido blastocelêmico (BF) tem sido estudado como uma amostra analítica de PGT-A minimamente invasiva. No entanto, a proporção de sucesso na amplificação do genoma amplo e no DNA detectável em amostras de fluido de blastocisto varia de 34,8% a 82%^20,21,22. O volume de AM relatado em vários estudos varia de 0,3 nL a 1 μL. Tendo em vista a baixa quantidade de DNA no FS, é possível aumentar a quantidade de DNA livre de células misturando fluido de blastocisto e meio de cultura para melhorar a taxa de sucesso e a consistência da detecção. Kuznyetsov et al.²³ e Li et ^al.24 trataram a zona pelúcida com laser e liberaram líquido blastocisto no meio de cultura para melhorar a quantidade total de DNA embrionário, e a taxa de amplificação das amostras combinadas meio/FS após WGA foi de 100% e 97,5%, respectivamente. Jiao et ^al.25 também obtiveram 100% de sucesso na amplificação utilizando o mesmo método.

O presente estudo relata um protocolo detalhado que inclui a preparação de amostras de mídia gasta, preparação de NGS e análise de dados. Ao remover cuidadosamente as células do cumulus dos ovócitos, o presente estudo realizou injeção intracitoplasmática de espermatozoides únicos (ICSI) e cultura de blastocisto. O meio gasto do dia 4 ao dia 5/dia 6 foi coletado para a preparação da biblioteca WGA e NGS. Usando a tecnologia NICS, o presente estudo simplificou as etapas de preparação da biblioteca WGA e NGS em aproximadamente 3 h e obteve resultados de ECC de forma não invasiva em aproximadamente 9 h.

Protocolo

A permissão ética foi obtida do Comitê de Ética do Terceiro Hospital da Universidade de Pequim.

1. Preparo

NOTA: Os materiais e equipamentos necessários estão listados na Tabela de Materiais.

1. Reagentes
   1. Pré-aquecer e equilibrar (balanceado) 20-30 μL de meio gameta/meio de fertilização e meio de cultura de clivagem/blastocisto (coberto com óleo mineral) e hialuronidase (em um tubo bem tampado) a 37 °C, 5% CO 2 e 5% O₂ em uma incubadora Tri-gás durante a noite antes do uso.
   2. Pré-aqueça a hialuronidase a 37 °C numa superfície de trabalho num exaustor.
   3. Preparar tampão de vitrificação e reagentes de coleta de amostras de acordo com as instruções do fabricante.
2. Ferramentas
   1. Prepare pipetas de coleta e transferência de amostras (diâmetro interno de ~200 a 250 μm), pipetas de desnudamento/stripper (diâmetro interno de ≥150 μm, ~130-140 μm e ~120 μm) e pipetas para lavagem (diâmetro interno de ~150 μm) puxando pipetas de vidro Pasteur para gerar pontas finas abertas polidas a fogo.
      NOTA: As pipetas utilizadas para coleta/transferência de amostras, desnudamento e lavagem podem ser adquiridas diretamente. As agulhas de retenção e as agulhas de injeção também podem ser compradas diretamente.

2. Protocolo 1: Coleta de amostras

1. Pré-tratamento do complexo oócito-corona-cumulus (CCOC) antes da digestão com hialuronidase
   1. Conseguir a estimulação ovariana com preparações de hormônio folículo estimulante (FSH) e gonadotrofina menopausal humana (hMG). Quando o folículo condutor estiver >18 mm, use 10.000 UI de gonadotrofina coriônica (hCG) para maturação final do ovócito.
   2. Realizar a recuperação do ovócito 36 h após o disparo do gatilho. Captar e transferir ovócitos para placas de cultura de tecidos com 2,5 mL de m-HTF pré-aquecido coberto por óleo mineral.
   3. Transferir rapidamente os CCOCs para o poço central de uma placa de cultura de órgãos contendo 1 mL de meio de fertilização usando uma pipeta de transferência e, em seguida, incubar com os ovócitos a 37 °C em uma estufa de 5% CO 2 e 5% O 2 por_2-4 h.
2. Digerir OCCCs com hialuronidase adicionando 1 mL de hialuronidase pré-aquecida a 37 °C (80 UI/mL) ao poço central de uma placa de cultura de órgãos contendo OCCC (etapa 2.1.3). Manter a concentração final de hialuronidase a 40 UI/ml e misturar bem.
   1. Incubar os CCOC numa plataforma térmica a 37 °C durante 2 minutos. Observe as mudanças ao microscópio a cada 30 s até restarem apenas 1-2 camadas de células da granulosa.
3. Denudação de células da granulosa
   1. Transfira rapidamente os OCCCs digeridos na placa de cultura para manuseio de ovócitos e cubra com óleo mineral em cada poço.
   2. Observe as células da granulosa separadas ao microscópio. Aspirar suavemente e liberar os ovócitos 5 vezes para remover as células residuais da granulosa ao redor dos ovócitos.
   3. Repita o passo anterior nos 3 poços restantes para remover completamente as células da granulosa.
      NOTA: As etapas acima (2.1-2.3) podem ser realizadas de acordo com a operação de rotina de cada laboratório.
4. Avaliação do ovócito
   1. Avaliar a completude da remoção de células da granulosa utilizando um microscópio. Se as células não puderam ser completamente removidas, então a retenção de 5 ou menos células da granulosa é aceitável neste momento.
      NOTA: Se as células do cumulus ainda estiverem aderidas ao ovócito, o remanescente pode ser removido mais tarde no dia 3 antes que o embrião seja transferido do meio de cultura em estágio de clivagem para o meio de cultura em estágio de blastocisto.
5. Após a realização da injeção intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI)²⁶, transferir os ovócitos para microgotículas de meio de cultura embrionário de clivagem de 20-30 μL (um ovócito corresponde a uma microgota) usando pipetas de transferência e incubar em estufa a 37 °C, 5% CO 2 e 5% O₂.
   1. Registre o dia da ICSI como dia 0. Verifique os embriões e a pontuação de acordo com o workshop de consenso de Istambul sobre avaliação embrionária do dia 1 para fertilização (aproximadamente 18 h), dia 2 (aproximadamente 45 h) e dia 3 (aproximadamente 68 h) para clivagem embrionária²⁷.
6. Lavagem de embriões
   1. Preparar 20-30 μL de microgotículas de meio de cultura de blastocisto para cada embrião coberto com óleo mineral em placas de cultura de tecidos no dia 2 em estufa a 37 °C, 5% CO 2 e 5% O₂.
   2. Prepare mais três microgotículas cobertas com óleo mineral e rotule as novas placas de cultura de tecidos para lavagem nº 1-3.
   3. Transfira os embriões do dia 3 para as microgotículas de lavagem. Aspirar suavemente e liberar os embriões 3 vezes em cada gota usando pipetas de desnudamento.
      NOTA: Este procedimento também pode ajudar a remover as células granulares residuais ligadas ao embrião.
   4. Observar e avaliar os embriões ao microscópio no 3º dia antes da troca do meio de cultura em estágio de clivagem para o meio de cultura de blastocisto para escore morfológico. Se as células do cumulus ainda estivessem aderidas ao embrião, pipetar apropriadamente para cima e para baixo em outra gota de meio de cultura de blastocisto pré-aquecido e equilibrado coberta com óleo mineral com uma pipeta stripper até que as células do cumulus fossem completamente removidas.
      NOTA: Todas as células do cumulus anexadas tiveram que ser removidas completamente no dia 3 antes que o embrião fosse transferido da placa do meio de cultura em estágio de clivagem para a placa do meio de cultura em estágio de blastocisto. Quaisquer células cumulus remanescentes interferirão na análise final e darão resultados falsos negativos.
7. Duas opções de coleta de meio de cultura
   NOTA: O centro de fertilização in vitro pode escolher um dos dois métodos para coleta de mídia de cultura com base nos recursos, demandas e preferências do centro.
   1. Opção 1: Lavagem e cultura de embriões
      NOTA: Esta opção é para laboratórios de fertilização in vitro que realizam vitrificação na manhã do dia 5.
      1. Transferir o embrião para microgotículas pré-aquecidas (37 °C) de meio de cultura e lavar suavemente cada embrião em série em 3 microgotículas por pipetagem no dia 4 à tarde.
      2. Transferir cada embrião para uma única microgota pré-aquecida (37 °C) de meio de cultura para coleta de amostras. O volume de uma única gota de meio de cultura não pode exceder 25 μL.
      3. Realizar cultura de embriões de blastocisto no dia 5/dia 6 a 37 °C, 5% CO 2 e 5% O₂.
   2. Opção 2: Lavagem e cultura de embriões
      NOTA: Esta opção é para laboratórios de fertilização in vitro que realizam vitrificação no dia 5 à tarde ou dia 6.
      1. Transferir o embrião para microgotículas pré-aquecidas (37 °C) de 10-15 μL de meio de cultura e lavar suavemente cada embrião em série em 3 microgotículas por pipetagem no dia 5.
      2. Transferir cada embrião para uma única microgota pré-aquecida (37 °C) de meio de cultura para coleta de amostras. O volume de uma única gota de meio de cultura não pode exceder 15 μL.
      3. Realizar cultura embrionária de blastocisto no dia 5/dia 6 a 37 °C e 5% CO₂.
8. Coleta de amostras
   1. Ajuste suavemente o MCI a uma distância considerável do ponto alvo do feixe de laser, que se concentra na junção celular do trofectoderma para gerar um pequeno orifício no trofectoderma para liberar o fluido da cavidade do blastocoel. Em seguida, os embriões são movidos para solução de congelamento para criopreservação de acordo com o processo convencional.
   2. Transferir o meio de cultura de cada embrião cultivado para um tubo de PCR livre de RNase/DNase contendo 5 μL de tampão de lise celular.
   3. Coletar a mesma quantidade de meio de cultura sem ser utilizado para cultura de embriões como controle negativo. Congelar imediatamente todas as amostras coletadas em nitrogênio líquido e, em seguida, armazenar a -80 °C após serem coletadas até serem submetidas ao ensaio NICS.
9. Realizar vitrificação conforme descrito no protocolo.

3. Protocolo 2: Construção de bibliotecas

1. Lise do meio de cultura
   1. Diluir 1 μL de controle positivo (10 ng de gDNA humano) com 199 μL de meio de cultura fresco. Misture bem e centrifugar o tubo brevemente (200 x g por 5 s).
   2. Transferir 10 μL do meio de cultura de blastocisto dia 5 dias 6, controle positivo diluído e meio de cultura fresco para novos tubos de PCR de 0,2 mL.
   3. Adicionar 1 μL de MT Enzyme Mix a cada tubo de PCR e misturar cuidadosamente por pipetagem e centrifugação imediatamente por 2-3 s a 200 x g.
   4. Coloque o(s) tubo(s) de PCR da etapa 3.1.3 em uma estação de preparação de amostra NICS pré-aquecida e execute o programa de lise da seguinte forma: 10 min a 75 °C; 4 min a 95 °C; manter a 22 °C.
      NOTA: A estação de preparação de amostras é comparável a uma máquina de PCR padrão.
      1. Clique no ícone Lysis para entrar na tela de configuração.
      2. Selecione Tubo para o modo de controle; entrada de 10 μL para o volume da amostra; selecione Ativado para controle Hotlid e insira 105 °C para a temperatura. Selecione Não para Pausar no primeiro seg. Clique em OK para continuar.
      3. Aguarde até que Remain time mostre --:-- :--, que indica o final do programa e, em seguida, clique em Parar para encerrar o programa.
   5. Pare o programa após a conclusão do processo. Prossiga para a próxima etapa imediatamente.
2. Preparação Pré-Biblioteca
   1. Descongele o buffer pré-lib para RT. Misture completamente pipetando e centrifugando imediatamente por 2-3 s a 200 x g.
   2. Prepare uma mistura mestra para a reação pré-biblioteca da seguinte forma: adicione 2 μL de Pre-Lib Enzyme Mix a 60 μL de Pre-Lib Buffer, misture a reação completamente e centrifugue brevemente.
   3. Adicionar 60 μL de mistura de reacção pré-biblioteca em cada amostra de meio pré-tratado do passo anterior. Misture bem por pipetagem e centrifugação imediatamente por 2-3 s a 200 x g.
   4. Coloque o(s) tubo(s) de PCR da etapa 3.2.3 na Estação de Preparação de Amostra e execute o programa de pré-biblioteca da seguinte maneira: 95 °C por 2 min; 12 ciclos de 15 °C por 40 s, 22 °C por 40 s, 33 °C por 30 s, 65 °C por 30 s, 72 °C por 40 s, 95 °C por 10 s e 63 °C por 10 s; e manter a 4 °C.
      1. Clique no ícone Pre_Lib para entrar na tela de configuração.
      2. Selecione Tubo para o modo de controle; entrada de 70 μL para o volume da amostra; selecione Ativado para controle da tampa quente e insira 105 °C para a temperatura. Selecione Não para Pausar no primeiro seg. Clique em OK para continuar.
      3. Aguarde até que Remain time mostre --:-- :--, que indica o final do programa, e clique em Parar para encerrar o programa.
   5. Pare o programa quando o processo estiver concluído. Prossiga para a próxima etapa imediatamente.
3. Preparação da Biblioteca
   1. Misture bem pipetando e centrifugando imediatamente por 2-3 s a 200 x g.
   2. Prepare uma mistura mestra para a reação da biblioteca da seguinte forma: adicione 1,6 μL de mistura enzimática de biblioteca a 60 μL de tampão de biblioteca, misture a reação completamente e centrifuja brevemente.
   3. Adicionar 60 μL de mistura de reação de biblioteca e 2 μL de Primer de código de barras a cada produto de pré-biblioteca a partir da etapa 3.2.3. Misture bem a reação e centrifugue brevemente.
   4. Colocar o(s) tubo(s) de PCR do passo 3.2.3 no termociclador e executar o programa de preparação da biblioteca da seguinte forma: 94 °C durante 30 s; 17 ciclos de 94 °C por 25 s, 62 °C por 30 s e 72 °C por 45 s); e depois segure a 4 °C.
      1. Clique no ícone Lib_Prep para entrar na tela de configuração.
      2. Selecione Tubo para o modo de controle; entrada de 130 μL para o volume da amostra; selecione Ativado para controle Hotlid e insira 105 °C para a temperatura correspondente. Selecione Não para Pausar no primeiro seg. Clique em OK para continuar.
      3. Aguarde até que Remain time mostre --:-- :--, que indica o final do programa, e clique em Parar para encerrar o programa.
4. Purificação da Biblioteca
   1. Remova as magbeads do armazenamento a 2-8 °C durante pelo menos 20 minutos antes da etapa de purificação. Vórtice e misture os Magbeads por 20 s. Distribua contas suficientes para a etapa de purificação em um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e contas quentes para RT.
   2. Adicione 1x Magbeads em cada biblioteca. Misture pipetando para cima e para baixo ≥10 vezes e incube em TR por 5 min.
      Observação : por exemplo, adicione 100 μL de Magbeads a 100 μL de amostra de biblioteca.
   3. Após a incubação, centrifugar brevemente o tubo e colocar em um suporte magnético.
   4. Aguarde aproximadamente 5 min até que a solução fique clara. Ao manter o tubo no suporte magnético, aspirar cuidadosamente a solução e descartar.
   5. Adicionar 200 μL de etanol 80% recém-preparado ao tubo. Incubar em RT por 30 s e remover cuidadosamente o sobrenadante. Repita mais uma vez.
   6. Retire o etanol o mais completamente possível. Seque ao ar as contas no suporte magnético por aproximadamente 5-10 min no RT.
   7. Retire o tubo do suporte magnético, adicione 17,5 μL de tampão de eluição e vomite o tubo para ressuspender as contas. Centrifugar brevemente o tubo e incubar em TR por 5 min.
   8. Coloque o tubo no suporte magnético e aguarde até que a solução fique clara. Transfira cuidadosamente o sobrenadante de 15 μL para um novo tubo.
5. Quantificação da biblioteca
   1. Quantificar bibliotecas purificadas usando o fluorômetro de acordo com o guia do usuário dos kits de ensaio qubit dsDNA HS²⁸. O rendimento das bibliotecas varia de ~15 a 300 ng.
6. Agrupamento de bibliotecas
   1. Use 10 nanogramas de cada amostra de biblioteca para agrupamento.
7. Seqüenciamento
   1. Consulte o guia do usuário de sequenciamento (15027617 v01)²⁹.
   2. Sequências de bibliotecas purificadas de 50 pb em uma única extremidade na plataforma produziram aproximadamente 2 milhões de leituras para cada amostra, e uma profundidade de sequenciamento de 0,03 × foi recomendada.
8. Análise de dados
   1. Digite o nome e a senha dos usuários na página de login
   2. Depois de fazer login no sistema, clique em Análise e uma nova página aparecerá. Clique em Criar envio na guia NICS-A. Em seguida, escolha NGS para a plataforma, selecione corporação, escolha NICSInst para o reagente, insira as informações do projeto na caixa em ID do projeto, defina as preferências de análise e carregue os arquivos. Depois que todos os arquivos de sequenciamento forem carregados com êxito, clique em Enviar para iniciar a análise (Figura 3A).
   3. Clique em Exibir envios para mostrar a lista de projetos enviados. Quando a análise estiver concluída, o status de um projeto se tornará Concluído e um botão Mostrar aparecerá no campo de relatório. Clique no botão Mostrar para exibir a tabela de resumo da análise NICS (Figura 3B).
   4. Clique no botão Exportar relatório para salvar os relatórios (Figura 3C).
      Observação : três tipos de arquivos serão exportados para cada análise. Um arquivo gráfico que inclui todos os gráficos de variação do número de cópias (CNV) para cada cromossomo e genoma inteiro, que serão armazenados na pasta "gráfico"; uma planilha que contém os detalhes do QC de exemplo dessa execução de análise; um arquivo de documento que contém os relatórios NICS personalizados pelo usuário; e uma planilha que contém as informações de resumo de exemplo dessa execução de análise.

Resultados

O presente estudo aplicou o método proposto em um paciente. A aprovação do IRB e o consentimento informado foram obtidos antes da aplicação da análise NICS. O presente estudo obteve 6 blastocistos de pacientes e realizou NICS em todos os 6 embriões no meio do dia 4 ao dia 5. Anormalidades cromossômicas causadas pela translocação balanceada dos pais foram detectadas em cinco cromossomos com o ensaio NICS; portanto, não puderam ser utilizados para transferência (Figura 4A-E...

Discussão

Modificações e solução de problemas

Se os resultados do NICS estiverem contaminados com materiais genéticos parentais, certifique-se de que todas as células cumulus-corona radiata sejam removidas e certifique-se de que a ICSI seja realizada para fertilização. Evitam-se processos inadequados de armazenamento de meios ou preparação de moldes, o que pode degradar o DNA. O espaço de trabalho foi cuidadosamente purificado com reagentes de descontaminação DNase e RNase....

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL EP tube, 0.2 mL PCR tube	Axygen	MCT-150-C, PCR-02-C	DNase/RNase free, Low Binding PCR tubes and 1.5 mL micro-centrifuge tubes are recommended.
10 µL, 200 µL, 1000 µL DNase /RNase Free Tips	Axygen	T-300-R-S, T-200-Y-R-S, T-1000-B-R-S	This can be replaced by other brand/For sample transfer
100 % ethanol	Sinopharm Chemical	10009218	This can be replaced by other brand/For DNA library purification
Barcode Primer1-48	Yikon Genomics	Reagent in NICSInst library preparation kit	For library amplificaton
BD Falcon Organ Culture Dish, Sterile	BD Bioscience	363037	This can be replaced by other brand/For embryo culture
BD Falcon Tissue culture Dishes (Easy Grip) , Sterile	BD Bioscience	353001	This can be replaced by other brand/For embryo culture
BD Falcon Tissue culture Dishes, Sterile	BD Bioscience	353002	This can be replaced by other brand/For embryo culture
Cell Lysis Buffer	Yikon Genomics	Reagent in NICSInst library preparation kit	For culture medium pre-treatment
Cell Lysis Enzyme	Yikon Genomics	Reagent in NICSInst library preparation kit	For culture medium pre-treatment
ChromGo software	Yikon Genomics		Data analysis
CMPure Magbeads	Yikon Genomics	Reagent in NICSInst library preparation kit	For library purification
Cryotop open systerm	KITAZATO BioPharma	81110	This can be replaced by other brand/For embryo vitrification
Distill water	Yikon Genomics	Reagent in NICSInst library preparation kit	To dissolve DNA
ES (Vitrification kit)	KITAZATO BioPharma	Reagent inVitrification kit	This can be replaced by other brand/For embryo vitrification
HOLDNIG	ORIGIO	MPH-MED-35	This can be replaced by other brand/For ICSI
Hyaluronidase solution, 80 U/mL	SAGE	ART4007-A	This can be replaced by other brand/Digest oocyte-corona-cumulus complex
ICSI	ORIGIO	MPH-35-35	This can be replaced by other brand/For ICSI
Illumina MiSeq® System	Illumina	SY-410-1001	For library sequencing
Incubator	Labotect	Inkubator C16	This can be replaced by other brand/For embryo culture
Library buffer	Yikon Genomics	Reagent in NICSInst library preparation kit	For library amplificaton
Library Enzyme Mix	Yikon Genomics	Reagent in NICSInst library preparation kit	For library amplificaton
Magnetic Stand	DynaMagTM-2	12321D	For library purification
Microscope	OLYMPUS	1X71	This can be replaced by other brand/For embryo observation
Mini-centrifuge	ESSENSCIEN	ELF6	For separation
MT Enzyme Mix	Yikon Genomics	Reagent in NICSInst library preparation kit	For culture medium pre-treatment
NICSInst library preparation kit	Yikon Genomics	KT1000800324	Whole genome amplification and library construction
NICSInst Sample Prep Station	Yikon Genomics	ME1001003	Amplificate DNA
Nunc IVF 4-Well Dish	Thermo Scientific	144444	This can be replaced by other brand/For embryo washing and blastocyst culture
Pasteur Pipette	Oirgio	MXL3-IND-135	This can be replaced by other brand/For embryo tansfer
Pasteur pipettes	ORIGIO	PP-9-1000	This can be replaced by other brand/For IVF laboratory
Pre-Lib Buffer	Yikon Genomics	Reagent in NICSInst library preparation kit	Pre-library preparation
Pre-Lib Enzyme	Yikon Genomics	Reagent in NICSInst library preparation kit	Pre-library preparation
Qubit® 3.0 Fluorometer	Thermo Scientific	Q33216	For library quantification
Quinn's Advantage Blastocyst Medium	SAGE	ART-1029	For embryo blastocyst stage culture
Quinn's Advantage Cleavage Medium	SAGE	ART-1026	This can be replaced by other brand/For embryo cleavage stage culture
Quinn's Advantage Fertilization Medium	SAGE	ART-1020	This can be replaced by other brand/For oocyte and sperm fertilization
Quinn's Advantage m-HTF Medium with HEPES	SAGE	ART-1023	This can be replaced by other brand/For embryo clutrure
Quinn's Advantage SPS Serum protein Substitute Kit	SAGE	ART-3010	This can be replaced by other brand/To denude the oocyte
Quinn's Advantage Tissue culture mineral oil	SAGE	ART-4008P	This can be replaced by other brand/To cover the culture medium
STRIPPER TIPS	ORIGIO	MXL3-IND-135	This can be replaced by other brand/For denudating granulosa cells
Vitrification Cryotop Open systerm	KIZTAZATO	81111	This can be replaced by other brand/For embryo vitrification
Vitrification kit	KITAZATO BioPharma	VT101	This can be replaced by other brand/For embryo vitrification
Vortexer	Qilinbeier	DNYS8	Sample mix
VS (Vitrification kit)	KITAZATO BioPharma	Reagent inVitrification kit	This can be replaced by other brand/For embryo vitrification
ZILOS-tk Laser System	Hamilton Thorne	CLASS 1 laser	This can be replaced by other brand/For artificial blastocoele collapse