Indução de Infarto do Miocárdio e Lesão de Isquemia-Reperfusão Miocárdica em Camundongos

Resumo

Descrevemos um método simples e reprodutível que pode induzir infarto do miocárdio ou lesão de isquemia-reperfusão miocárdica em camundongos por ligadura precisa da artéria coronária descendente anterior esquerda através de micromanipulação.

Resumo

O infarto agudo do miocárdio é uma doença cardiovascular comum e com alta mortalidade. A lesão de reperfusão miocárdica pode neutralizar os efeitos benéficos do refluxo cardíaco e induzir lesão miocárdica secundária. Um modelo simples e reprodutível de infarto do miocárdio e lesão de isquemia-reperfusão miocárdica é uma boa ferramenta para os pesquisadores. Aqui, um método personalizável para criar um modelo de infarto do miocárdio (IM) e MIRI por ligadura de precisão da artéria coronária descendente anterior (DA) por meio de micromanipulação é descrito. O posicionamento preciso e reprodutível da ligadura da DA ajuda a obter resultados consistentes para lesão cardíaca. As alterações no segmento ST podem ajudar a identificar a precisão do modelo. O nível sérico de troponina T cardíaca (cTnT) é usado para avaliar a lesão miocárdica, o ultrassom cardíaco é empregado para avaliar a função sistólica miocárdica e a coloração de Evans-Blue/cloreto de trifenil tetrazólio é usada para medir o tamanho do infarto. Em geral, esse protocolo reduz a duração do procedimento, garante o tamanho controlável do infarto e melhora a sobrevida do camundongo.

Introdução

O infarto agudo do miocárdio (IAM) é uma doença cardiovascular comum em todo o mundo e acarreta alta^mortalidade1. O avanço das tecnologias torna a revascularização precoce e eficaz disponível para pacientes com IAM. Após esses tratamentos, em alguns pacientes, pode ocorrer lesão de isquemia-reperfusão miocárdica (MIRI)². Assim, é de grande importância compreender os mecanismos de ações e como melhorar o MI/MIRI. Camundongos são amplamente utilizados como modelos devido ao seu baixo custo, rápido tempo de reprodução e facilidade para realizar alterações^{genéticas 3}. Estudiosos têm desenvolvido diferentes métodos para modelar MIRI e IM em animais 4,5,6,7,8,9. Essa estratégia favorece a pesquisa, mas os diferentes critérios e métodos empregados dificultam a interpretação dos resultados entre as equipes de pesquisa.

Em camundongos, o IM foi induzido por isoproterenol¹⁰, criolesão ^{11,12 ou} cauterização¹³. O IM pode ser induzido prontamente pelo isoproterenol, mas o processo fisiopatológico é diferente daquele do IM clínico. O IM induzido por cauterização é bem diferente do processo natural do infarto do miocárdio, e a reação inflamatória na área queimada é mais intensa; Além disso, a abordagem cirúrgica apresenta dificuldades técnicas. Além disso, existem alguns^{laboratórios14} desenvolvendo modelo de IM em miniporcos utilizando o método de bloqueio por balão ou embolização ou trombose através de técnica intervencionista. Todos esses métodos podem causar oclusão da artéria coronária diretamente, mas a necessidade de dispositivos de angiografia coronariana e, acima de tudo, das artérias coronárias de camundongo muito finas torna essas operações pouco práticas. Para a MIRI, as diferenças entre os diferentes modelos foram bastante modestas, como usar ou não respiradores/micromanipulação ^5,6.

Aqui é descrito um método simples e confiável que pode induzir IM e o modelo MIRI, adaptado de métodos previamente publicados4,5,6,7,8,9,15. Este método pode simular processos fisiopatológicos pelo bloqueio direto da DA através da ligadura. Além disso, ao aliviar a ligadura, esse modelo também pode simular lesão de reperfusão. Neste protocolo, um microscópio dissecante é utilizado para visualização da DAD. Em seguida, o pesquisador pode identificar prontamente a LAD. Posteriormente, a ligadura precisa da DAE leva à oclusão sanguínea reprodutível e previsível e isquemia ventricular. Além disso, alterações eletrocardiográficas (ECG) podem ser usadas para confirmar isquemia e reperfusão, além das mudanças de cor da DA observadas ao microscópio. Essa estratégia leva a uma menor duração do procedimento, menor risco de complicações cirúrgicas e menos camundongos experimentais necessários. Os métodos para o teste de troponina-T, ultrassom cardíaco e coloração de cloreto de trifenil tetrazólio (TTC) também são descritos. Em geral, este protocolo é útil para estudos do mecanismo MI/MIR, bem como para a descoberta de drogas.

Protocolo

Os estudos em animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Utilização de Animais da Universidade de Ciência e Tecnologia de Huazhong (Wuhan, China).

NOTA: Camundongos C57BL/6J machos (8-10 semanas) são usados como modelos. Os camundongos têm livre acesso a comida e água e são criados em condições específicas livres de patógenos. A sala é mantida sob temperatura controlada (22 °C ± 2 °C) e umidade (45%-65%). Os ratos são expostos a um ambiente claro/escuro de 12 horas no Centro de Cuidados com Animais da Faculdade de Medicina de Tongji (Wuhan, China), de acordo com as diretrizes estabelecidas por esta instituição. Use instrumentos microcirúrgicos estéreis e suprimentos cirúrgicos. Luvas cirúrgicas e máscaras são obrigatórias durante todo o procedimento. O fluxo de trabalho experimental é mostrado na Figura 1A.

1. Preparo pré-operatório

1. Utilizar mesa cirúrgica retangular (ST) com bolsa térmica pré-aquecida (37 °C) durante todo o procedimento cirúrgico (Figura 1B). Desinfetar a prancha com luz ultravioleta e álcool 70% antes do início do procedimento.
2. Pesar todos os ratos com precisão para calcular a dose de drogas anestésicas necessárias. Em seguida, anestesiar os camundongos com cetamina (80 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) por injeção intraperitoneal. Garantir a profundidade adequada da anestesia pela ausência de um reflexo de retirada para os reflexos de pinçamento dos dedos dos pés e piscar.
3. Coloque o rato em decúbito dorsal no TO com gaze sob a cabeça para evitar o superaquecimento dos olhos. Aplique pomada oftálmica nos olhos para evitar que eles sequem.
4. Faça a barba no peito precordial esquerdo com uma navalha elétrica. Use um creme de remoção de pelos no tórax pré-raspado e massageie uniformemente com um cotonete estéril por ~1 min. Limpe o excesso de pelos soltos com gaze.
5. Use iodopovidona, seguido de álcool a 70% para limpar a área. Cubra o tórax com gaze.
6. Use uma sutura 4-0 sob os incisivos superiores e fixe-a no ponto de ancoragem (próximo à borda do ST sobre o nariz) para manter a boca levemente aberta e facilitar a canulação.
7. Puxe a cauda para manter o corpo reto e prenda a cauda ao TO usando fita adesiva. Fixe os quatro membros e aperte-os nos outros pontos de ancoragem. É importante ressaltar que não estique demais os membros dianteiros; caso contrário, pode ocorrer comprometimento respiratório.
8. Use pinças curvas e pinças para abrir a mandíbula e levantar a língua. Use um iluminador para visualizar claramente a garganta e a glote.
9. Insira uma cânula de 22 G suavemente com uma agulha embotada e truncada na traqueia através da boca ~1 cm abaixo da garganta. Use uma mão para segurar a língua, mova-a levemente para cima com pinça romba e, simultaneamente, use a outra mão para inserir suavemente o tubo na traqueia. Tenha cuidado para não inserir o tubo no esôfago.
10. Retire a agulha delicadamente. Verifique a intubação colocando o tubo na água para formar bolhas antes de se conectar ao ventilador.
11. Conecte o tubo endotraqueal a um ventilador regulado para 120/min e o volume corrente ajustado para 250 μL.
    NOTA: A configuração do ventilador é ajustada pelo peso corporal (em geral, um peso corporal mais alto requer um volume corrente mais alto).
12. Verificar a intubação verificando a expansibilidade torácica bilateral simétrica. Em seguida, a conexão é fixada ao TO com fita adesiva para evitar que o tubo caia.
13. Coloque eletrodos de ECG nas patas e conecte-os ao gravador de ECG. Monitorar a eletrofisiologia cardíaca durante todo o procedimento.

2. Toracotomia

1. Retire a gaze no tórax. Desinfetar novamente com álcool a 70% para as áreas de incisão usando três ciclos de esfoliação. Em seguida, cubra o rato com um pano cirúrgico estéril com um orifício sobre o campo cirúrgico para reduzir a contaminação do local cirúrgico.
2. Fazer uma incisão oblíqua na pele (0,8-1,0 cm) ao longo da linha hemiclavicular esquerda com bisturi estéril.
3. Realizar dissecção romba dos tecidos subcutâneos para expor as costelas por baixo. Tenha cuidado para não ferir vasos, costelas e pulmões. Pare o sangramento usando aplicadores de algodão estéreis.
4. Identificar e fazer uma incisão de cerca de 6-8 mm no terceiro espaço intercostal. Em seguida, realizar dissecção romba dos tecidos no espaço intercostal para abrir a cavidade torácica. Tenha cuidado para não lesionar a artéria torácica interna.
5. Use pinças para cobrir o espaço intercostal. Insira afastadores caseiros pré-esterilizados (Figura 1C) na caixa torácica e puxe para trás para espalhar a incisão até ~6 mm de largura. Fixe os afastadores ao TO com elásticos.
6. Remova os tecidos circundantes cuidadosamente para expor o coração completamente. Puxe o pericárdio suavemente com pinças curvas sem ferir o coração. Agora uma visão clara do coração está disponível.

3. Ligadura do LAD

NOTA: A MAD aparece como uma linha vermelha fina que corre perpendicularmente perto do ápice e para baixo através do ventrículo esquerdo. O LAD é de cor vermelho-vivo, por isso tenha cuidado para não confundi-lo com uma veia. Geralmente, o local da ligadura está ~1-2 mm abaixo da aurícula esquerda. Essa posição de ligadura produzirá cerca de 40%-50% da isquemia no ventrículo esquerdo. Uma posição mais alta criará uma zona de infarto mais extensa. Um local mais distal criará uma zona de infarto menor.

1. Use um microscópio dissecante e direcione uma luz focalizada e apropriada para visualização da LAD. Pressione o local abaixo da posição de ligadura escolhida suavemente para ampliar temporariamente a DA (≤5 s por vez). Verifique novamente o LAD desta forma.
2. Use uma agulha cônica (3/8, 2,5 x 5) para passar um 8-0 ligadura de seda sob o LAD sob um microscópio dissecante. Tenha cuidado com a profundidade da agulha: não muito profunda para entrar no ventrículo esquerdo e não muito rasa para evitar danificar a LAD.
3. Amarre a ligadura com um nó duplo solto. O diâmetro do laço é de cerca de 2-3 mm.
4. Coloque um tubo PE-10 de 2-3 mm em uma alça paralela à artéria.
5. Aperte a alça de ligadura suavemente até que fique ao redor da artéria e da tubulação. Em seguida, prenda o laço com um slipknot. Tome cuidado para não danificar a parede miocárdica com pressão de aperto excessiva.
   NOTA: A ligadura não é realizada para o grupo de operação simulada.
6. Confirmar cessação do fluxo sanguíneo na DAE: observar coloração mais pálida na parede anterior do VE após a ligadura. Além disso, elevação significativa do segmento ST em poucos batimentos cardíacos também indica oclusão¹⁶. Se for necessária a ligadura permanente (por exemplo, MI), remova a tubulação PE-10 e amarre a LAD diretamente com um nó. Retome o procedimento restante conforme mencionado na etapa 4.3 abaixo.
7. Retire os afastadores da incisão. Em seguida, feche a ferida temporariamente com uma braçadeira de buldogue. A duração da isquemia está de acordo com o desenho experimental. Certifique-se de que o rato continua ligado ao ventilador.

4. Reperfusão

1. Quando o período de isquemia terminar, remova a pinça do buldogue e insira os afastadores novamente para abrir a incisão e expor o coração (especialmente o local da ligadura).
2. Desamarre o slipknot e remova a tubulação PE-10. Confirme a restauração do fluxo sanguíneo nesta etapa, observando a mudança de cor de volta para rosa-vermelho dentro de 20 s. Simultaneamente, observe atentamente o ECG: uma possível dissolução do supradesnivelamento do segmento ST também sugere reperfusão.
3. Deixe o 8-0 ligadura in situ para posterior coloração Evans-Blue e TTC. Em outros casos, remova a sutura nesta etapa.
4. Retirar os afastadores e fechar a incisão suturando a terceira e quarta costelas com fio de náilon 4-0. Tenha cuidado para não ferir o pulmão. Empurre para fora o ar que pode estar preso na cavidade torácica pressionando o tórax suavemente enquanto amarra os nós de sutura.
5. Fechar as camadas musculares com suturas contínuas. Fechar a pele com fio de náilon 4-0; suturas contínuas e suturas interrompidas são aceitáveis.

5. Cuidados pós-operatórios

1. Observe o rato cuidadosamente para sinais de recuperação da anestesia, por exemplo, movimento da cauda ou bigodes. Depois disso, o rato geralmente retoma um padrão respiratório normal com uma taxa de respiração de cerca de 150 bpm. Extubar o rato removendo o tubo lentamente.
2. Monitore o mouse por mais 3-5 minutos para garantir que o desconforto respiratório esteja ausente.
3. Administrar 100 μL de buprenorfina (0,1 mg/mL, s.c.) após o camundongo começar a respirar. Para as próximas 24 h, forneça uma dose adicional a cada 4-6 h. Fornecer ibuprofeno como alívio adicional da dor em água potável como uma solução de 0,2 mg/mL por 2 dias antes e ≤7 dias após a cirurgia.
4. Mantenha os camundongos aquecidos e reduza o risco de mortalidade usando mantas de isolamento térmico, pois os camundongos são propensos à hipotermia após a anestesia.

6. Validação após o procedimento

1. Teste da troponina T
   1. Coletar amostras de sangue dos plexos retroorbitários e isolar os soros por centrifugação (3.000 × g, 10 min, temperatura ambiente).
   2. Diluir 20 μL de soro para 100 μL com solução salina para o teste de troponina-T. Conservar o restante das amostras a -80 °C.
   3. Detectar a troponina T (cTnT usando um kit comercial seguindo as instruções do fabricante.
2. Ultrassom cardíaco
   OBS: O ultrassom cardíaco é utilizado para avaliar a função cardíaca e anormalidades da motilidade segmentar em diferentes estágios antes e após a cirurgia, de acordo com o desenho^{experimental17,18}. Diferentes parâmetros como espessura da parede ventricular, volume ventricular, diâmetro da cavidade ventricular, fração de ejeção e fração de encurtamento do eixo curto são medidos.
   1. Anestesiar os camundongos com cetamina (80 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) por injeção intraperitoneal.
   2. Faça a barba no peito com uma navalha elétrica. Use creme de depilação e massageie uniformemente. Limpe o excesso de pelos soltos com gaze.
   3. Coloque o mouse sobre o TO e prenda os quatro membros com fita adesiva.
   4. Coloque a sonda de ultrassom (30 MHz) na região anterior do coração a ~ 30° do esterno. A sonda nesta vista está alinhada com o longo eixo do coração. Ajuste o ultrassom no modo B; O ventrículo esquerdo, o átrio esquerdo, a valva mitral e a aorta ascendente podem ser claramente identificados. Use a captura de vídeo para obter dados para análise subsequente.
   5. Ao girar o transdutor 90° no sentido horário, obtém-se uma visão paraesternal de eixo curto ao nível dos músculos papilares para detectar claramente os ventrículos esquerdo e direito. Em seguida, use o modo B e o modo M para avaliar a função cardíaca e a morfometria.
   6. Calcular o diâmetro diastólico final do ventrículo esquerdo (Dd), o diâmetro sistólico final (Ds) e a espessura do septo interventricular especificando a localização correspondente nas imagens ultrassonográficas.
      NOTA: O aparelho calcularia manualmente o volume diastólico final do ventrículo esquerdo (VDFVE) e o volume sistólico final (VSFVE). Além disso, a máquina calcularia os valores de fração de encurtamento (FS) e fração de ejeção (FE) usando fórmulas FS = (Dd-Ds)/Dd × 100% e EF= (VEVD-VVESV)/CVVEDV × 100%. Escolha cinco ciclos cardíacos consecutivos e obtenha seus valores médios.
3. Medida do tamanho do infarto do miocárdio
   NOTA: A coloração Evans-Blue/TTC é utilizada para medir o tamanho do infarto, pois pode avaliar a viabilidade tecidual¹⁹. Recomenda-se manchar dentro de 72 h da reperfusão, pois a cicatriz diminuirá. Esta etapa é realizada após a eutanásia do animal com 200 mg/kg de pentobarbital sódico via injeção intraperitoneal.
   1. Expor o coração novamente seguindo os procedimentos anteriores dos passos 2.2-2.5. Em seguida, religa-se a DA no local inicial validado pela sutura citada no passo 4.3, ao final do tempo de reperfusão desejado.
   2. Cânular a aorta e, em seguida, perfundir o coração com 0,3 mL de solução de Azul de Evans a 1%. O miocárdio da região não isquêmica está corado de azul. Após a perfusão, remova o coração rapidamente cortando a aorta com tesoura.
   3. Em seguida, lave o coração em solução de KCl (30 mM) para impedir que o coração bata. Conservar a -20 °C durante ≥4 h após a remoção do tecido adiposo circundante.
   4. Corte o coração no sentido transversal em cinco fatias de espessura de 1 mm usando um bisturi afiado. Pesar as fatias e, em seguida, incubá-las com TTC a 2% durante 40 min a 37 °C.
      NOTA: Após a incubação, as áreas de infarto são demarcadas como brancas, enquanto os tecidos viáveis nas áreas não infartadas permanecem vermelhos.
   5. Fixe as fatias com formol a 4% durante a noite.
      NOTA: Esta ação irá aumentar o contraste entre a área de infarto e a área não infartada. Também vai encolher as fatias.
   6. Fotografe as fatias com uma câmera digital. Em seguida, calcule a área de risco (RAA), a área de infarto e a zona não isquêmica usando software gráfico.
      NOTA: Após a dupla coloração Evans-Blue/TTC, a área azul é a área "normal". As demais áreas (incluindo branco e vermelho) são as áreas de "risco de isquemia": a área branca é a área de infarto do miocárdio (AI) e a área vermelha é a área isquêmica (mas não infartada). Levando em conta a inconsistência de tamanhos de fatias de coração, os resultados são ajustados para o peso.
      
      Atribuir:
      A1-A5 para Área da zona de infarto/Área do corte do coração;
      B1-B5 para Área da zona não infarta/ Área do corte do coração;
      W1-W5 para Peso da fatia do coração.
      
      Então:
      Peso total do miocárdio infartado: W1 × A1 + W2 × A2 + W3 × A3 + W4 × A4 + W5 × A5;
      Peso total do miocárdio não infartado: W1 × B1 + W2 × B2 + W3 × B3 + W4 × B4+ W5 × B5;
      Peso total do RAA = (W1 + W2 +W3 + W4 + W5) - (W1 × A1 + W2 × A2 + W3 × A3 + W4 × A4 + W5 × A5)
      
      Finalmente:
      A área de isquemia miocárdica é calculada como a porcentagem de RAA no ventrículo esquerdo:
      
      A área de infarto do miocárdio é calculada como a porcentagem de IA no RAA:
      

Resultados

O fluxo de trabalho experimental é mostrado na Figura 1A. O pesquisador pode programar os nós de tempo de acordo com o desenho experimental no início do estudo. A duração da ligadura da DAE está de acordo com o objetivo da pesquisa. Para o IM, a pesquisa pode ignorar a etapa de reperfusão. A ultrassonografia cardíaca está disponível em diferentes estágios do estudo porque não é invasiva, enquanto a coloração Evans-Blue/TTC pode ser realizada apenas quando o camundongo é sacri...

Discussão

Nos últimos anos, a criação de modelos para IM e MIRI em pesquisas clínicas e científicas tem se desenvolvido rapidamente^20,21. No entanto, ainda existem algumas questões, como os mecanismos de ações e como melhorar o MI/MIRI, que devem ser resolvidas. Aqui, um protocolo modificado para estabelecer um modelo murino de IM e MIRI é descrito. Vários pontos-chave devem ser considerados com cuidado.

O primeiro ponto-chave é a int...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9 % sodium chloride solution	Kelun Industry Group,China		-
4% paraformaldehyde fixing solution	Servicebio,China	G1101	-
4-0 silk suture	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products,China	C412	-
8-0 suture	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products,China	H801	-
Buprenorphine	IsoReag,China	IR-11190	-
Camera	Canon,Japan	EOS 80D	-
Depilatory cream	Veet,French		-
Elecsys Troponin T hs STAT	Roche,Germany		-
Electrochemical luminescence immunoanalyzer	Roche,Germany	Elecsys 2010	-
Evans blue	Sigma,America	E2129	-
Eye scissors	Shanghai Medical Instruments,China	JC2303	-
Haemostatic forceps	Shanghai Medical Instruments,China	J31020	-
High frequency in vivo imaging systems	Visualsonics,Canada	Vevo2100	-
Ibuprofen	PerFeMiKer,China	CLS-12921	-
Intravenous catheter	Introcan,Germany	4254090B	-
Ketamine	Sigma-Aldrich,America	K2753	-
Medical alcohol	Huichang ,China		-
Microneedle holders	Shanghai Medical Instruments,China	WA2040	-
Microscopic shears	Shanghai Medical Instruments,China	WA1040	-
Microsurgical forceps	Shanghai Medical Instruments,China	WA3020	-
Mouse electrocardiograph	Techman,China	BL-420F	-
Needle holders	Shanghai Medical Instruments,China	JC3202	-
operating floor	Chico,China	ZK-HJPT	-
PE-10 tube	Huamei,China		-
Pentobarbital	Merck,America	1030001	-
Rodent Ventilator	Shanghai Alcott Biotech,China	ALC-V8S-P	-
Stereo microscope	Aomei Industry,China	SZM0745-STL3-T3	-
Surgical thermostatic heating pad	Globalebio, China	GE0-20W	-
Triphenyltetrazolium chloride	Servicebio,China	G1017	-
Xylazine	Huamaike Biochemicals and Life Science Research Prouducts,China	323004	-