Индукция инфаркта миокарда и ишемически-реперфузионного повреждения миокарда у мышей

Резюме

Здесь мы описываем простой и воспроизводимый метод, который может индуцировать инфаркт миокарда или ишемически-реперфузионное повреждение миокарда у мышей путем прецизионного перевязки левой передней нисходящей коронарной артерии с помощью микроманипуляций.

Аннотация

Острый инфаркт миокарда является распространенным сердечно-сосудистым заболеванием с высокой смертностью. Реперфузионное повреждение миокарда может противодействовать благотворному эффекту сердечного оттока и индуцировать вторичное повреждение миокарда. Простая и воспроизводимая модель инфаркта миокарда и ишемически-реперфузионного повреждения миокарда является хорошим инструментом для исследователей. Описан настраиваемый метод создания модели инфаркта миокарда (ИМ) и МИРИ путем прецизионного перевязки левой передней нисходящей коронарной артерии (ЛДП) с помощью микроманипуляций. Точное и воспроизводимое расположение лигатуры LAD помогает получить стабильные результаты при травме сердца. Изменения сегмента ST могут помочь определить точность модели. Для оценки повреждения миокарда используется сывороточный уровень сердечного тропонина Т (cTnT), для оценки систолической функции миокарда используется ультразвуковое исследование сердца, а для измерения размера инфаркта используется окрашивание Evans-Blue/трифенилтетразолия хлоридом. В целом, этот протокол сокращает продолжительность процедуры, обеспечивает контролируемый размер инфаркта и улучшает выживаемость мышей.

Введение

Острый инфаркт миокарда (ОИМ) является распространенным сердечно-сосудистым заболеванием во всем мире и сопровождается высокой^{смертностью1}. Достижения в области технологий делают раннюю и эффективную реваскуляризацию доступной для пациентов с ОИМ. После этих процедур у некоторых пациентов может возникнуть ишемически-реперфузионное повреждение миокарда (MIRI)². Таким образом, большое значение имеет понимание механизмов действия и способов улучшения ИМ/МИРИ. Мыши широко используются в качестве моделей из-за их низкой стоимости, быстрого времени размножения и легкости внесения^{генетических изменений}. Ученые разработали различные методы моделирования MIRI и MI у животных 4,5,6,7,8,9. Эта стратегия способствует проведению исследований, но различные критерии и методы, используемые исследовательскими группами, усложняют интерпретацию результатов исследовательскими группами.

У мышей инфаркт миокарда индуцировался изопротеренолом¹⁰, криотравмой ^{11,12 или} прижиганием¹³. Инфаркт миокарда может быть легко индуцирован изопротеренолом, но патофизиологический процесс отличается от такового при клиническом инфаркте миокарда. Криотравма-индуцированный инфаркт миокарда имеет плохую консистенцию, вызывает чрезмерное повреждение миокарда вокруг левой передней нисходящей коронарной артерии (LAD) и может легко индуцировать аритмию. Инфаркт миокарда, индуцированный прижиганием, значительно отличается от естественного процесса инфаркта миокарда, и воспалительная реакция в области ожога более интенсивна; Кроме того, хирургический доступ имеет технические трудности. Кроме того, некоторые^{лаборатории разрабатывают} модель инфаркта миокарда у минипигов с использованием баллонной блокады или эмболизации или метода тромбоза с помощью интервенционной техники. Все эти методы могут вызвать окклюзию коронарных артерий напрямую, но необходимость в коронарных ангиографических аппаратах и, прежде всего, слишком тонкие коронарные артерии мыши делают эти операции нецелесообразными. Для MIRI различия между разными моделями были довольно скромными, например, использование респираторов/микроманипуляций или нет ^5,6.

Здесь описан простой и надежный метод, который может индуцировать ИМ и модель MIRI, адаптированная из ранее опубликованных методов 4,5,6,7,8,9,15. Этот метод позволяет моделировать патофизиологические процессы путем прямой блокады LAD посредством лигирования. Более того, снимая лигирование, эта модель также может имитировать реперфузионное повреждение. В этом протоколе для визуализации LAD используется препарирующий микроскоп. После этого исследователь может легко идентифицировать LAD. Впоследствии точное лигирование LAD приводит к воспроизводимой и предсказуемой окклюзии крови и ишемии желудочков. Кроме того, изменения электрокардиографии (ЭКГ) могут быть использованы для подтверждения ишемии и реперфузии в дополнение к изменениям цвета LAD, наблюдаемым под микроскопом. Эта стратегия приводит к сокращению продолжительности процедуры, снижению риска хирургических осложнений и меньшему количеству экспериментальных мышей. Также описаны методы теста на тропонин-Т, УЗИ сердца и окрашивания трифенилтетразолия хлорида (ТТС). В целом, этот протокол полезен для изучения механизма ИМ/МИР, а также для разработки лекарственных препаратов.

протокол

Исследования на животных были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Хуачжунского университета науки и технологий (Ухань, Китай).

ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве моделей используются самцы мышей C57BL/6J (8-10 недель). Мыши имеют свободный доступ к пище и воде и размножаются в определенных условиях, свободных от патогенов. В помещении поддерживается контролируемая температура (22 °C ± 2 °C) и влажность (45%-65%). Мыши подвергаются воздействию 12-часовой светлой/темной среды в учреждении по уходу за животными Медицинской школы Тунцзи (Ухань, Китай) в соответствии с рекомендациями, установленными этим учреждением. Используйте стерильные микрохирургические инструменты и хирургические принадлежности. На протяжении всей процедуры необходимо носить хирургические перчатки и маски. Экспериментальный рабочий процесс показан на рисунке 1A.

1. Предоперационная подготовка

1. Используйте прямоугольный операционный стол (ОТ) с предварительно нагретой грелкой (37 °C) на протяжении всей хирургической процедуры (Рисунок 1B). Перед началом процедуры продезинфицируйте доску ультрафиолетом и 70% спиртом.
2. Тщательно взвесьте всех мышей, чтобы рассчитать необходимую дозу обезболивающих препаратов. Затем обезболивают мышей кетамином (80 мг/кг) и ксилазином (10 мг/кг) путем внутрибрюшинной инъекции. Обеспечьте надлежащую глубину анестезии за счет отсутствия рефлекса отведения к защемлению пальцев ног и морганию рефлексов.
3. Положите мышь лежа на ОТ с марлей под голову, чтобы избежать перегрева глаз. Нанесите офтальмологическую мазь на глаза, чтобы предотвратить их пересыхание.
4. Сбрейте шерсть на левой пограничной груди электробритвой. Нанесите крем для удаления шерсти на предварительно выбритую грудную клетку и равномерно помассируйте стерильным ватным тампоном в течение ~1 мин. Лишнюю выпавшую шерсть протрите марлей.
5. Используйте повидон-йод с последующим 70% спиртом для очистки участка. Накройте грудную клетку марлей.
6. Используйте шов 4-0 под верхними резцами и закрепите его в точке фиксации (близко к краю ОТ над носом), чтобы рот оставался слегка открытым и облегчал канюлю.
7. Потяните хвост, чтобы тело оставалось прямым, и закрепите хвост к ОТ с помощью скотча. Закрепите четыре конечности и затяните их на других опорных точках. Главное, не перенапрягайте передние конечности; В противном случае может возникнуть дыхательная недостаточность.
8. Используйте изогнутые щипцы и щипцы, чтобы открыть челюсть и приподнять язык. Используйте осветитель, чтобы четко визуализировать горло и голосовую щель.
9. Осторожно введите канюлю 22G с затупленной и усеченной иглой в трахею через рот на ~1 см вниз по горлу. Одной рукой придерживайте язык, слегка приведите его вверх тупыми щипцами, а другой рукой осторожно введите трубку в трахею. Будьте осторожны, чтобы не ввести трубку в пищевод.
10. Аккуратно извлеките иглу. Проверьте интубацию, поместив трубку в воду, чтобы образовались пузырьки, прежде чем подключаться к аппарату искусственной вентиляции легких.
11. Подключите эндотрахеальную трубку к аппарату искусственной вентиляции легких, настроенному на 120 мкм в минуту и дыхательному объему 250 мкл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Настройка аппарата ИВЛ регулируется в зависимости от массы тела (как правило, более высокая масса тела требует большего дыхательного объема).
12. Проверьте интубацию, проверив двустороннее симметричное расширение грудной клетки. Затем соединение фиксируется к ОТ скотчем, чтобы избежать падения трубки.
13. Поместите электроды ЭКГ на лапы и подключите их к регистратору ЭКГ. Контролируйте электрофизиологию сердца на протяжении всей процедуры.

2. Торакотомия

1. Снимите марлю с грудной клетки. Снова продезинфицируйте области разрезов 70% спиртом, используя три цикла скрабирования. Затем накройте мышь стерильной хирургической простыней с отверстием над операционным полем, чтобы уменьшить загрязнение места операции.
2. Сделайте стерильным скальпелем косой разрез кожи (0,8-1,0 см) по левой среднеключичной линии.
3. Проводят тупое рассечение подкожных тканей, чтобы обнажить ребра под ними. Будьте осторожны, чтобы не повредить сосуды, ребра и легкие. Остановите кровотечение с помощью стерильных ватных аппликаторов.
4. Определите и сделайте разрез около 6-8 мм в третьем межреберье. Затем проводят тупое рассечение тканей в межприбрежном пространстве для вскрытия грудной полости. Будьте осторожны, чтобы не травмировать внутреннюю грудную артерию.
5. Используйте щипцы, чтобы охватить межреберье. Вставьте предварительно стерилизованные самодельные ретракторы (рис. 1C) в грудную клетку и потяните назад, чтобы расширить разрез до ~6 мм в ширину. Прикрепите втягивающие устройства к ОТ с помощью резинок.
6. Осторожно удалите окружающие ткани, чтобы полностью обнажить сердце. Аккуратно оттяните перикард изогнутыми щипцами, не травмируя сердце. Теперь ясно видно сердце.

3. Лигирование LAD

ПРИМЕЧАНИЕ: LAD выглядит как тонкая красная линия, идущая перпендикулярно от верхушки и вниз через левый желудочек. LAD ярко-красного цвета, поэтому будьте осторожны, чтобы не перепутать его с веной. Обычно место перевязки находится на ~1-2 мм ниже левой ушной раковины. Эта позиция лигирования будет производить около 40%-50% ишемии в левом желудочке. Более высокое положение создаст более обширную зону инфаркта. Более дистальный участок создаст меньшую зону инфаркта.

1. Используйте препарирующий микроскоп и направляйте сфокусированный и подходящий свет для визуализации LAD. Осторожно надавите на участок под выбранным положением лигирования, чтобы временно увеличить LAD (≤5 с за раз). Перепроверьте LAD таким образом.
2. Используйте коническую иглу (3/8, 2,5 x 5), чтобы пропустить 8-0 шелковая лигатура под LAD под препарирующим микроскопом. Будьте осторожны с глубиной иглы: не слишком глубоко, чтобы войти в левый желудочек, и не слишком глубоко, чтобы не повредить LAD.
3. Завяжите лигатуру свободным двойным узлом. Диаметр петли около 2-3 мм.
4. Поместите трубку из ПЭ-10 диаметром 2-3 мм в петлю, параллельную артерии.
5. Осторожно затяните лигатурную петлю, пока она не окажется вокруг артерии и трубки. Затем закрепите петлю узелком. Следите за тем, чтобы не повредить стенку миокарда чрезмерным стягивающим давлением.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Лигирование не проводится для группы фиктивных операций.
6. Подтвердить прекращение кровотока в ЛДП: наблюдают более бледный цвет передней стенки ЛЖ после перевязки. Кроме того, значительное повышение сегмента ST в течение нескольких ударов сердца также указывает на окклюзию¹⁶. Если требуется постоянная перевязка (например, ИМ), снимите трубку PE-10 и завяжите LAD непосредственно узлом. Повторите оставшуюся процедуру, как описано в шаге 4.3 ниже.
7. Извлеките втягивающие устройства из разреза. Затем временно закройте рану бульдожьим зажимом. Продолжительность ишемии определяется в соответствии с планом эксперимента. Убедитесь, что мышь по-прежнему подключена к аппарату искусственной вентиляции легких.

4. Реперфузия

1. Когда период ишемии закончится, снимите бульдожий зажим и снова вставьте ретракторы, чтобы открыть разрез и обнажить сердце (особенно место перевязки).
2. Развяжите скользящий узел и снимите трубку PE-10. Подтвердите восстановление кровотока на этом этапе, наблюдая за изменением цвета обратно на розово-красный в течение 20 секунд. Одновременно внимательно следите за ЭКГ: потенциальное растворение подъема сегмента ST также указывает на реперфузию.
3. Оставьте 8-0 лигатура in situ для последующего окрашивания Evans-Blue и TTC. В остальных случаях снимают шов на этом этапе.
4. Снимите ретракторы и закройте разрез, зашив третье и четвертое ребра нейлоновым швом 4-0. Будьте осторожны, чтобы не повредить легкое. Вытолкните воздух, который может попасть в грудную полость, осторожно надавливая на грудную клетку и завязывая шовные узлы.
5. Закройте мышечные слои непрерывными швами. Закройте кожу нейлоновым швом 4-0; Допустимы непрерывные швы и прерывистые швы.

5. Послеоперационный уход

1. Внимательно наблюдайте за мышью на предмет признаков восстановления после анестезии, например, движения хвоста или усов. После этого мышь обычно возобновляет нормальное дыхание с частотой дыхания около 150 ударов в минуту. Экстубируйте мышь, медленно вынимая трубку.
2. Понаблюдайте за мышью в течение дополнительных 3-5 минут, чтобы убедиться в отсутствии дыхательной недостаточности.
3. Введите 100 мкл бупренорфина (0,1 мг/мл,.к.) после того, как мышь начнет дышать. В течение следующих 24 ч вводите дополнительную дозу каждые 4-6 ч. Назначайте ибупрофен в качестве дополнительного обезболивающего в питьевой воде в виде раствора 0,2 мг/мл в течение 2 дней до и ≤7 дней после операции.
4. Держите мышей в тепле и снижайте риск смертности, используя теплоизоляционные одеяла, так как мыши склонны к гипотермии после анестезии.

6. Валидация после процедуры

1. Тест на тропонин-Т
   1. Забор образцов крови из заглазничных сплетений и выделение сыворотки путем центрифугирования (3 000 × г, 10 мин, комнатная температура).
   2. Разбавьте 20 мкл сыворотки до 100 мкл физиологическим раствором для теста на тропонин-Т. Храните остальные образцы при температуре -80 °C.
   3. Определите Troponin T (cTnT) с помощью коммерческого набора в соответствии с инструкциями производителя.
2. УЗИ сердца
   ПРИМЕЧАНИЕ: УЗИ сердца используется для оценки сердечной функции и аномалий движения стенки на разных этапах до и после операции в соответствии с экспериментальным дизайном^17,18. Измеряются различные параметры, такие как толщина стенки желудочка, объем желудочков, диаметр полости желудочка, фракция выброса и фракция укорочения короткой оси.
   1. Обезболивайте мышей кетамином (80 мг/кг) и ксилазином (10 мг/кг) путем внутрибрюшинной инъекции.
   2. Побрейте грудь электробритвой. Используйте крем для удаления шерсти и равномерно помассируйте. Лишнюю выпавшую шерсть протрите марлей.
   3. Поместите мышь на ОТ и закрепите четыре конечности клейкой лентой.
   4. Поместите ультразвуковой датчик (30 МГц) на передний отдел сердца под углом ~ 30° к грудине. Зонд на этом снимке выровнен по длинной оси сердца. Установите ультразвук в B-режим; Левый желудочек, левое предсердие, митральный клапан и восходящая аорта могут быть четко идентифицированы. Используйте видеозахват для получения данных для последующего анализа.
   5. Поворачивая датчик на 90° по часовой стрелке, можно получить парастернальное изображение с короткой осью на уровне папиллярных мышц для четкого обнаружения левого и правого желудочков. Затем используйте B-режим и M-режим для оценки сердечной функции и морфометрии.
   6. Рассчитайте конечный диастолический диаметр левого желудочка (Dd), конечный систолический диаметр (Ds) и толщину межжелудочковой перегородки, указав соответствующее место на ультразвуковых изображениях.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Аппарат вручную рассчитывает конечный диастолический объем левого желудочка (LVEDV) и конечный систолический объем (LVESV). Кроме того, машина рассчитает значения дробного укорочения (FS) и фракции выброса (EF) по формулам FS = (Dd-Ds)/Dd × 100% и EF= (LVEDV-LVESV)/LVEDV × 100%. Выберите пять последовательных сердечных циклов и получите их средние значения.
3. Измерение размеров инфаркта миокарда
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для измерения размера инфаркта используется окрашивание Evans-Blue/TTC, поскольку оно позволяет оценить жизнеспособность тканей¹⁹. Рекомендуется окрашивать в течение 72 часов после реперфузии, потому что рубец уменьшится. Этот этап выполняется после усыпления животного пентобарбиталом натрия в дозе 200 мг/кг путем внутрибрюшинной инъекции.
   1. Снова обнажите сердце, выполнив предыдущие процедуры, описанные в шагах 2.2-2.5. Затем повторно наложите LAD в исходном месте, валидированном шовным материалом, упомянутым в шаге 4.3, в конце желаемой продолжительности реперфузии.
   2. Канюлируйте аорту, а затем перфузируйте сердце 0,3 мл 1% раствора Evans Blue. Миокард неишемизированной области окрашен в синий цвет. После перфузии быстро удалите сердце, разрезав аорту ножницами.
   3. Затем промойте сердце раствором KCl (30 мМ), чтобы остановить сердцебиение. Хранить при температуре -20 °C в течение ≥4 ч после удаления окружающей жировой ткани.
   4. Разрежьте сердце в поперечном направлении на пять ломтиков толщиной 1 мм с помощью острого скальпеля. Взвесьте ломтики, а затем инкубируйте их с 2% TTC в течение 40 минут при 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После инфаркта инфарктные участки выделяются белым цветом, в то время как жизнеспособные ткани в неинфарктных областях остаются красными.
   5. Зафиксируйте срезы 4% формальдегидом на ночь.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это действие усилит контраст между инфарктной областью и неинфарктной областью. Это также уменьшит ломтики.
   6. Сфотографируйте срезы на цифровую камеру. Затем рассчитайте зону риска (AAR), область инфаркта и неишемическую зону с помощью графического программного обеспечения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После двойного окрашивания Evans-Blue/TTC синяя область является «нормальной» областью. Остальные области (в том числе белый и красный) относятся к зонам «риска ишемии»: белая область — это область инфаркта миокарда (IA), а красная область — ишемическая (но не инфарктная) область. Принимая во внимание несоответствие размеров сердечных срезов, результаты корректируются на вес.
      
      Назначать:
      A1-A5 для Площадь зоны инфаркта / Область сердечного среза;
      B1-B5 для Области неинфарктной зоны / Области сердечного среза;
      W1-W5 для веса сердечного среза.
      
      Тогда:
      Общая масса инфарктного миокарда: W1 × A1 + W2 × A2 + W3 × A3 + W4 × A4 + W5 × A5;
      Общая масса неинфарктного миокарда: W1 × B1 + W2 × B2 + W3 × B3 + W4 × B4+ W5 × B5;
      Общий вес AAR = (П1 + П2 +П3 + Ш4 + Ш5) - (П1 × А1 + П2 × А2 + Ш3 × А3 + П4 × А4 + П5 × А5)
      
      Наконец:
      Площадь ишемии миокарда рассчитывается как процент ААР в левом желудочке:
      
      Площадь инфаркта миокарда рассчитывается как процент ИА в ААР:
      

Результаты

Экспериментальный рабочий процесс показан на рисунке 1A. Исследователь может запланировать временные узлы в соответствии с планом эксперимента после начала исследования. Продолжительность лигирования LAD определяется в соответствии с целью исследования. Для инфаркта ?...

Обсуждение

В последние годы быстрыми темпами развивается создание моделей ИМ и МИРИ в клинических и научных исследованиях^20,21. Тем не менее, все еще остаются некоторые вопросы, такие как механизмы действий и способы улучшения ИМ/МИРИ, которые необходимо решить. Здес?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9 % sodium chloride solution	Kelun Industry Group,China		-
4% paraformaldehyde fixing solution	Servicebio,China	G1101	-
4-0 silk suture	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products,China	C412	-
8-0 suture	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products,China	H801	-
Buprenorphine	IsoReag,China	IR-11190	-
Camera	Canon,Japan	EOS 80D	-
Depilatory cream	Veet,French		-
Elecsys Troponin T hs STAT	Roche,Germany		-
Electrochemical luminescence immunoanalyzer	Roche,Germany	Elecsys 2010	-
Evans blue	Sigma,America	E2129	-
Eye scissors	Shanghai Medical Instruments,China	JC2303	-
Haemostatic forceps	Shanghai Medical Instruments,China	J31020	-
High frequency in vivo imaging systems	Visualsonics,Canada	Vevo2100	-
Ibuprofen	PerFeMiKer,China	CLS-12921	-
Intravenous catheter	Introcan,Germany	4254090B	-
Ketamine	Sigma-Aldrich,America	K2753	-
Medical alcohol	Huichang ,China		-
Microneedle holders	Shanghai Medical Instruments,China	WA2040	-
Microscopic shears	Shanghai Medical Instruments,China	WA1040	-
Microsurgical forceps	Shanghai Medical Instruments,China	WA3020	-
Mouse electrocardiograph	Techman,China	BL-420F	-
Needle holders	Shanghai Medical Instruments,China	JC3202	-
operating floor	Chico,China	ZK-HJPT	-
PE-10 tube	Huamei,China		-
Pentobarbital	Merck,America	1030001	-
Rodent Ventilator	Shanghai Alcott Biotech,China	ALC-V8S-P	-
Stereo microscope	Aomei Industry,China	SZM0745-STL3-T3	-
Surgical thermostatic heating pad	Globalebio, China	GE0-20W	-
Triphenyltetrazolium chloride	Servicebio,China	G1017	-
Xylazine	Huamaike Biochemicals and Life Science Research Prouducts,China	323004	-