Induzione di infarto miocardico e danno da ischemia-riperfusione miocardica nei topi

Riepilogo

Qui descriviamo un metodo semplice e riproducibile che può indurre infarto miocardico o danno da ischemia-riperfusione miocardica nei topi mediante legatura di precisione dell'arteria coronaria discendente anteriore sinistra attraverso la micromanipolazione.

Abstract

L'infarto miocardico acuto è una malattia cardiovascolare comune con elevata mortalità. Il danno da riperfusione miocardica può contrastare gli effetti benefici del reflusso cardiaco e indurre un danno miocardico secondario. Un modello semplice e riproducibile di infarto miocardico e danno da ischemia-riperfusione miocardica è un buon strumento per i ricercatori. Qui, viene descritto un metodo personalizzabile per creare un modello di infarto del miocardio (MI) e MIRI mediante legatura di precisione dell'arteria coronaria discendente anteriore sinistra (LAD) attraverso la micromanipolazione. Il posizionamento accurato e riproducibile della legatura del LAD aiuta a ottenere risultati coerenti per le lesioni cardiache. Le modifiche del segmento ST possono aiutare a identificare l'accuratezza del modello. Il livello sierico di troponina T cardiaca (cTnT) viene utilizzato per valutare la lesione miocardica, l'ecografia cardiaca viene impiegata per valutare la funzione sistolica miocardica e la colorazione con cloruro di Evans-Blue/trifeniltetrazolio viene utilizzata per misurare le dimensioni dell'infarto. In generale, questo protocollo riduce la durata della procedura, garantisce dimensioni dell'infarto controllabili e migliora la sopravvivenza del topo.

Introduzione

L'infarto miocardico acuto (IMA) è una malattia cardiovascolare comune in tutto il mondo e comporta un'elevata mortalità¹. I progressi nelle tecnologie rendono disponibile una rivascolarizzazione precoce ed efficace per i pazienti con IMA. Dopo questi trattamenti, in alcuni pazienti, può verificarsi un danno da ischemia-riperfusione miocardica (MIRI)². Pertanto, è di grande importanza comprendere i meccanismi delle azioni e come migliorare l'MI/MIRI. I topi sono ampiamente utilizzati come modelli a causa del loro basso costo, dei tempi di riproduzione rapidi e della facilità di apportare alterazioni genetiche³. Gli studiosi hanno sviluppato diversi metodi per modellare MIRI e MI negli animali 4,5,6,7,8,9. Questa strategia promuove la ricerca, ma i diversi criteri e metodi utilizzati complicano l'interpretazione dei risultati tra i gruppi di ricerca.

Nei topi, l'infarto miocardico è stato indotto dall'isoproterenolo 10, dalla criolesione^11,12 o dalla cauterizzazione¹³. L'infarto miocardico può essere indotto prontamente dall'isoproterenolo, ma il processo fisiopatologico è diverso da quello dell'infarto miocardico clinico. L'infarto miocardico indotto da criolesione ha una scarsa consistenza, provoca un eccessivo danno miocardico intorno all'arteria coronaria discendente anteriore sinistra (LAD) e può facilmente indurre aritmia. L'infarto miocardico indotto dalla cauterizzazione è molto diverso dal processo naturale dell'infarto del miocardio e la reazione infiammatoria nell'area in fiamme è più intensa; Inoltre, l'approccio chirurgico presenta difficoltà tecniche. Inoltre, ci sono alcuni laboratori¹⁴ che stanno sviluppando un modello di infarto miocardico in minipig utilizzando il blocco del palloncino o l'embolizzazione o il metodo della trombosi attraverso tecniche interventistiche. Tutte queste metodiche possono causare direttamente l'occlusione delle arterie coronarie, ma la necessità di dispositivi per angiografia coronarica e, soprattutto, le arterie coronarie di topo troppo sottili rende queste operazioni poco pratiche. Per MIRI, le differenze tra i diversi modelli erano piuttosto modeste, come l'uso di respiratori/micromanipolazione o meno ^5,6.

Qui viene descritto un metodo semplice e affidabile in grado di indurre l'infarto miocardico e il modello MIRI, adattato dai metodi 4,5,6,7,8,9,15 precedentemente pubblicati. Questo metodo può simulare i processi fisiopatologici mediante il blocco diretto del LAD attraverso la legatura. Inoltre, alleviando la legatura, questo modello può anche simulare il danno da riperfusione. In questo protocollo, viene utilizzato un microscopio da dissezione per la visualizzazione LAD. Quindi, il ricercatore può identificare prontamente il LAD. Successivamente, un'accurata legatura del LAD porta a un'occlusione del sangue e a un'ischemia ventricolare riproducibili e prevedibili. Inoltre, le alterazioni dell'elettrocardiogramma (ECG) possono essere utilizzate per confermare l'ischemia e la riperfusione, oltre ai cambiamenti di colore del LAD osservati al microscopio. Questa strategia porta a una durata della procedura più breve, a un minor rischio di complicanze chirurgiche e a un minor numero di topi sperimentali necessari. Vengono inoltre descritti i metodi per il test della troponina-T, l'ecografia cardiaca e la colorazione del cloruro di trifeniltetrazolio (TTC). Nel complesso, questo protocollo è utile per gli studi sul meccanismo MI/MIR, nonché per la scoperta di farmaci.

Protocollo

Gli studi sugli animali sono stati approvati dal Comitato per la cura e l'utilizzo degli animali dell'Università di Scienza e Tecnologia di Huazhong (Wuhan, Cina).

NOTA: I topi maschi C57BL/6J (8-10 settimane) sono usati come modelli. I topi hanno libero accesso al cibo e all'acqua e vengono allevati in specifiche condizioni prive di agenti patogeni. L'ambiente viene mantenuto a temperatura controllata (22 °C ± 2 °C) e umidità (45%-65%). I topi sono esposti a un ambiente chiaro/buio di 12 ore presso la struttura per la cura degli animali della Tongji Medical School (Wuhan, Cina) secondo le linee guida stabilite da questa istituzione. Utilizzare strumenti microchirurgici sterili e forniture chirurgiche. Guanti chirurgici e maschere sono necessari durante tutta la procedura. Il flusso di lavoro sperimentale è illustrato nella Figura 1A.

1. Preparazione preoperatoria

1. Utilizzare un tavolo operatorio rettangolare (OT) con un termoforo preriscaldato (37 °C) durante la procedura chirurgica (Figura 1B). Disinfettare la scheda con luce ultravioletta e alcol al 70% prima di iniziare la procedura.
2. Pesare accuratamente tutti i topi per calcolare la dose di farmaci anestetici necessari. Quindi, anestetizzare i topi con ketamina (80 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) tramite iniezione intraperitoneale. Garantire un'adeguata profondità di anestesia grazie all'assenza di un riflesso di astinenza al pizzicamento delle dita dei piedi e dei riflessi di ammiccamento.
3. Posizionare il topo supino sull'OT con una garza sotto la testa per evitare il surriscaldamento degli occhi. Applicare un unguento oftalmico sugli occhi per evitare che si secchino.
4. Radere il pelo sul petto precordiale sinistro con un rasoio elettrico. Utilizzare una crema per la rimozione del pelo sul torace pre-rasato e massaggiare uniformemente con un batuffolo di cotone sterile per ~1 min. Pulisci il pelo sciolto in eccesso con una garza.
5. Usa lo iodio povidone, seguito da alcol al 70% per pulire l'area. Copri il torace con una garza.
6. Utilizzare una sutura 4-0 sotto gli incisivi superiori e fissarla al punto di ancoraggio (vicino al bordo dell'OT sopra il naso) per mantenere la bocca leggermente aperta e facilitare l'incannulamento.
7. Tira la coda per mantenere il corpo dritto e fissa la coda all'OT usando del nastro adesivo. Fissare i quattro flettenti e serrarli sugli altri punti di ancoraggio. È importante sottolineare che non allungare eccessivamente gli arti anteriori; in caso contrario, può verificarsi una compromissione respiratoria.
8. Usa pinze curve e pinze per aprire la mascella e sollevare la lingua. Usa un illuminatore per visualizzare chiaramente la gola e la glottide.
9. Inserire delicatamente una cannula da 22 G con un ago smussato e troncato nella trachea attraverso la bocca ~ 1 cm in gola. Usa una mano per tenere la lingua, muovila leggermente verso l'alto con una pinza smussata e, contemporaneamente, usa l'altra mano per inserire delicatamente il tubo nella trachea. Fare attenzione a non inserire il tubo nell'esofago.
10. Rimuovere l'ago delicatamente. Controllare l'intubazione inserendo il tubo nell'acqua per verificare la formazione di bolle prima di collegarlo al ventilatore.
11. Collegare il tubo endotracheale a un ventilatore impostato su 120/min e volume corrente regolato a 250 μL.
    NOTA: L'impostazione del ventilatore viene regolata in base al peso corporeo (in generale, un peso corporeo più elevato richiede un volume corrente più elevato).
12. Verificare l'intubazione controllando l'espansione simmetrica bilaterale del torace. Quindi, la connessione viene fissata all'OT con del nastro adesivo per evitare che il tubo cada.
13. Posizionare gli elettrodi ECG sulle zampe e collegarli al registratore ECG. Monitorare l'elettrofisiologia cardiaca durante tutta la procedura.

2. Toracotomia

1. Rimuovere la garza sul torace. Disinfettare nuovamente con alcol al 70% per le aree di incisione utilizzando tre cicli di scrub. Quindi, coprire il topo con un telo chirurgico sterile con un foro sul campo operatorio per ridurre la contaminazione del sito chirurgico.
2. Praticare un'incisione cutanea obliqua (0,8-1,0 cm) lungo la linea medioclavicolare sinistra con un bisturi sterile.
3. Eseguire la dissezione smussata dei tessuti sottocutanei per esporre le costole sottostanti. Fare attenzione a non ferire vasi, costole e polmoni. Arrestare l'emorragia utilizzando applicatori sterili in cotone.
4. Individuare e praticare un'incisione di circa 6-8 mm nel terzo spazio intercostale. Quindi, eseguire una dissezione smussata dei tessuti nello spazio intercostiero per aprire la cavità toracica. Fare attenzione a non ferire l'arteria toracica interna.
5. Usa le pinze per coprire lo spazio intercostale. Inserire i divaricatori fatti in casa pre-sterilizzati (Figura 1C) nella gabbia toracica e tirare indietro per allargare l'incisione a ~6 mm di larghezza. Fissare i divaricatori all'OT con elastici.
6. Rimuovere con cautela i tessuti circostanti per esporre completamente il cuore. Staccare delicatamente il pericardio con una pinza curva senza ferire il cuore. Ora è disponibile una visione chiara del cuore.

3. Legatura LAD

NOTA: Il LAD appare come una sottile linea rossa che corre perpendicolarmente da vicino all'apice e giù attraverso il ventricolo sinistro. Il LAD è di colore rosso vivo, quindi fai attenzione a non scambiarlo per una vena. Di solito, il sito di legatura è ~1-2 mm sotto il padiglione auricolare sinistro. Questa posizione di legatura produrrà circa il 40%-50% dell'ischemia nel ventricolo sinistro. Una posizione più alta creerà una zona di infarto più estesa. Un sito più distale creerà una zona infartuale più piccola.

1. Utilizzare un microscopio da dissezione e dirigere una luce focalizzata e appropriata per la visualizzazione LAD. Premere delicatamente il sito sotto la posizione di legatura scelta per ingrandire temporaneamente il LAD (≤5 s alla volta). Ricontrollare il LAD in questo modo.
2. Usa un ago affusolato (3/8, 2,5 x 5) per passare un 8-0 legatura di seta sotto il LAD al microscopio da dissezione. Attenzione alla profondità dell'ago: non troppo in profondità per entrare nel ventricolo sinistro e non troppo in profondità per evitare di danneggiare il LAD.
3. Legare la legatura con un doppio nodo sciolto. Il diametro dell'anello è di circa 2-3 mm.
4. Posizionare un tubo in PE-10 da 2-3 mm in un anello parallelo all'arteria.
5. Stringere delicatamente l'ansa di legatura fino a quando non si trova intorno all'arteria e al tubo. Quindi, fissa l'anello con un nodo scorsoio. Fare attenzione a non danneggiare la parete miocardica con un'eccessiva pressione di serraggio.
   NOTA: La legatura non viene eseguita per il gruppo di operazione fittizia.
6. Confermare la cessazione del flusso sanguigno nel LAD: osservare un colore più pallido nella parete anteriore del ventricolo sinistro dopo la legatura. Inoltre, un significativo sopraslivellamento del tratto ST entro pochi battiti cardiaci indica anche l'occlusione¹⁶. Se è necessaria una legatura permanente (ad es. MI), rimuovere il tubo in PE-10 e legare il LAD direttamente con un nodo. Riprendere la procedura rimanente come indicato al punto 4.3 di seguito.
7. Rimuovere i divaricatori dall'incisione. Quindi, chiudi temporaneamente la ferita con una pinza bulldog. La durata dell'ischemia è in accordo con il disegno sperimentale. Assicurarsi che il mouse continui a essere collegato al ventilatore.

4. Riperfusione

1. Al termine del periodo di ischemia, rimuovere la pinza bulldog e inserire nuovamente i divaricatori per aprire l'incisione ed esporre il cuore (in particolare il sito di legatura).
2. Sciogliere il nodo scorsoio e rimuovere il tubo in PE-10. Confermare il ripristino del flusso sanguigno in questa fase osservando il cambiamento di colore che torna al rosa-rosso entro 20 s. Allo stesso tempo, osserva attentamente l'ECG: una potenziale dissoluzione del sopraslivellamento del tratto ST suggerisce anche la riperfusione.
3. Lascia l'8-0 legatura in situ per la successiva colorazione Evans-Blue e TTC. In altri casi, rimuovere la sutura in questa fase.
4. Rimuovere i divaricatori e chiudere l'incisione suturando la terza e la quarta costola con una sutura di nylon 4-0. Fare attenzione a non ferire il polmone. Spingi fuori l'aria che potrebbe essere intrappolata nella cavità toracica premendo delicatamente il torace mentre lega i nodi di sutura.
5. Chiudere gli strati muscolari con suture continue. Chiudere la pelle con una sutura di nylon 4-0; Sono accettabili suture continue e suture interrotte.

5. Cure postoperatorie

1. Osservare attentamente il topo per segni di recupero dall'anestesia, ad esempio movimento della coda o dei baffi. Dopodiché, il topo di solito riprende un normale schema respiratorio con una frequenza respiratoria di circa 150 bpm. Estubare il mouse rimuovendo lentamente il tubo.
2. Monitorare il mouse per altri 3-5 minuti per assicurarsi che il distress respiratorio sia assente.
3. Somministrare 100 μL di buprenorfina (0,1 mg/mL, n.c.) dopo che il topo inizia a respirare. Per le successive 24 ore, somministrare una dose aggiuntiva ogni 4-6 ore. Fornire ibuprofene come ulteriore sollievo dal dolore nell'acqua potabile come soluzione 0,2 mg/mL per 2 giorni prima e ≤7 giorni dopo l'intervento chirurgico.
4. Mantieni i topi al caldo e riduci il rischio di mortalità utilizzando coperte termoisolanti poiché i topi sono inclini all'ipotermia dopo l'anestesia.

6. Convalida dopo la procedura

1. Test della troponina-T
   1. Raccogliere campioni di sangue dai plessi retroorbitari e isolare i sieri mediante centrifugazione (3.000 × g, 10 min, temperatura ambiente).
   2. Diluire 20 μL di siero a 100 μL con soluzione salina per il test della troponina-T. Conservare il resto dei campioni a -80 °C.
   3. Rilevare la troponina T (cTnT utilizzando un kit commerciale seguendo le istruzioni del produttore.
2. Ecografia cardiaca
   NOTA: L'ecografia cardiaca viene utilizzata per valutare la funzione cardiaca e le anomalie del movimento della parete in diverse fasi prima e dopo l'intervento chirurgico secondo il disegno sperimentale^17,18. Vengono misurati diversi parametri come lo spessore della parete ventricolare, il volume ventricolare, il diametro della cavità ventricolare, la frazione di eiezione e la frazione di accorciamento dell'asse corto.
   1. Anestetizzare i topi con ketamina (80 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) tramite iniezione intraperitoneale.
   2. Radere il petto con un rasoio elettrico. Utilizzare una crema per la rimozione del pelo e massaggiare uniformemente. Pulisci il pelo sciolto in eccesso con una garza.
   3. Posiziona il mouse sull'OT e fissa i quattro arti con del nastro adesivo.
   4. Posizionare la sonda ecografica (30 MHz) sulla regione anteriore del cuore a ~ 30° rispetto allo sterno. La sonda in questa vista è allineata con l'asse lungo del cuore. Impostare l'ecografia in B-Mode; Il ventricolo sinistro, l'atrio sinistro, la valvola mitrale e l'aorta ascendente possono essere identificati chiaramente. Utilizzare l'acquisizione video per ottenere dati per l'analisi successiva.
   5. Ruotando il trasduttore di 90° in senso orario, si ottiene una visione parasternale dell'asse corto a livello dei muscoli papillari per rilevare chiaramente i ventricoli sinistro e destro. Quindi utilizzare B-Mode e M-Mode per valutare la funzione cardiaca e la morfometria.
   6. Calcolare il diametro telediastolico del ventricolo sinistro (Dd), il diametro telesistolico (Ds) e lo spessore del setto interventricolare specificando la posizione corrispondente nelle immagini ecografiche.
      NOTA: La macchina calcolerà manualmente il volume telediastolico ventricolare sinistro (LVEDV) e il volume telesistolico (LVESV). Inoltre, la macchina calcolerebbe i valori per l'accorciamento frazionario (FS) e la frazione di eiezione (EF) utilizzando le formule FS = (Dd-Ds)/Dd × 100% e EF= (LVEDV-LVESV)/LVEDV × 100%. Scegli cinque cicli cardiaci consecutivi e ottieni i loro valori medi.
3. Misurazione delle dimensioni dell'infarto del miocardio
   NOTA: La colorazione Evans-Blue/TTC viene utilizzata per misurare le dimensioni dell'infarto perché può valutare la vitalità dei tessuti¹⁹. Si consiglia di colorare entro 72 ore dalla riperfusione perché la cicatrice si restringerà. Questa fase viene eseguita dopo l'eutanasia dell'animale con 200 mg/kg di pentobarbital sodico tramite iniezione intraperitoneale.
   1. Esporre nuovamente il cuore seguendo le procedure precedenti dai passaggi 2.2-2.5. Quindi, riposizionare il LAD nel sito iniziale convalidato dalla sutura menzionata al punto 4.3 al termine della durata di riperfusione desiderata.
   2. Incannulare l'aorta e poi perfondere il cuore con 0,3 ml di soluzione Evans Blue all'1%. Il miocardio della regione non ischemica è colorato di blu. Dopo la perfusione, rimuovere rapidamente il cuore tagliando l'aorta con le forbici.
   3. Quindi, lavare il cuore in una soluzione di KCl (30 mM) per fermare il battito cardiaco. Conservare a -20 °C per ≥4 h dopo aver rimosso il tessuto adiposo circostante.
   4. Tagliare il cuore in senso trasversale in cinque fette dello spessore di 1 mm utilizzando un bisturi affilato. Pesare le fette e poi incubarle con TTC al 2% per 40 minuti a 37 °C.
      NOTA: Dopo l'incubazione, le aree dell'infarto sono delimitate come bianche, mentre i tessuti vitali nelle aree non infartuali rimangono rossi.
   5. Fissare le fette con il 4% di formaldeide per una notte.
      NOTA: Questa azione migliorerà il contrasto tra l'area dell'infarto e l'area non infartuale. Ridurrà anche le fette.
   6. Fotografa le fette con una fotocamera digitale. Quindi, calcola l'area a rischio (AAR), l'area dell'infarto e la zona non ischemica utilizzando un software grafico.
      NOTA: Dopo la doppia colorazione Evans-Blue/TTC, l'area blu è l'area "normale". Le aree rimanenti (comprese il bianco e il rosso) sono le aree a "rischio di ischemia": l'area bianca è l'area dell'infarto del miocardio (IA) e l'area rossa è l'area ischemica (ma non infartuata). Tenendo conto dell'incoerenza delle dimensioni delle fette di cuore, i risultati vengono aggiustati in base al peso.
      
      Assegnare:
      A1-A5 per l'area della zona dell'infarto/area della fetta di cuore;
      B1-B5 per l'area della zona non infartuale/area della fetta di cuore;
      W1-W5 per il peso della fetta di cuore.
      
      Allora:
      Peso totale del miocardio infartuato: W1 × A1 + W2 × A2 + W3 × A3 + W4 × A4 + W5 × A5;
      Peso totale del miocardio non infartuato: W1 × B1 + W2 × B2 + W3 × B3 + W4 × B4+ W5 × B5;
      Peso totale di AAR = (W1 + W2 +W3 + W4 + W5) - (W1 × A1 + W2 × A2 + W3 × A3 + W4 × A4 + W5 × A5)
      
      Finalmente:
      L'area di ischemia miocardica è calcolata come la percentuale di AAR nel ventricolo sinistro:
      
      L'area di infarto del miocardio è calcolata come la percentuale di IA nell'AAR:
      

Risultati

Il flusso di lavoro sperimentale è illustrato nella Figura 1A. Il ricercatore può programmare i nodi temporali in base al disegno sperimentale all'inizio dello studio. La durata della legatura LAD è in base allo scopo della ricerca. Per l'infarto miocardico, la ricerca può ignorare la fase di riperfusione. L'ecografia cardiaca è disponibile in diverse fasi dello studio perché non è invasiva, mentre la colorazione Evans-Blue/TTC può essere eseguita solo quando il topo viene sacrificat...

Discussione

Negli ultimi anni, la creazione di modelli per MI e MIRI nella ricerca clinica e scientifica si è sviluppata rapidamente^20,21. Tuttavia, ci sono ancora alcune questioni, come i meccanismi d'azione e come migliorare l'MI/MIRI, che devono essere risolte. Qui viene descritto un protocollo modificato per stabilire un modello murino di MI e MIRI. Diversi punti chiave devono essere considerati attentamente.

Il primo punto chiave è l'intuba...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9 % sodium chloride solution	Kelun Industry Group,China		-
4% paraformaldehyde fixing solution	Servicebio,China	G1101	-
4-0 silk suture	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products,China	C412	-
8-0 suture	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products,China	H801	-
Buprenorphine	IsoReag,China	IR-11190	-
Camera	Canon,Japan	EOS 80D	-
Depilatory cream	Veet,French		-
Elecsys Troponin T hs STAT	Roche,Germany		-
Electrochemical luminescence immunoanalyzer	Roche,Germany	Elecsys 2010	-
Evans blue	Sigma,America	E2129	-
Eye scissors	Shanghai Medical Instruments,China	JC2303	-
Haemostatic forceps	Shanghai Medical Instruments,China	J31020	-
High frequency in vivo imaging systems	Visualsonics,Canada	Vevo2100	-
Ibuprofen	PerFeMiKer,China	CLS-12921	-
Intravenous catheter	Introcan,Germany	4254090B	-
Ketamine	Sigma-Aldrich,America	K2753	-
Medical alcohol	Huichang ,China		-
Microneedle holders	Shanghai Medical Instruments,China	WA2040	-
Microscopic shears	Shanghai Medical Instruments,China	WA1040	-
Microsurgical forceps	Shanghai Medical Instruments,China	WA3020	-
Mouse electrocardiograph	Techman,China	BL-420F	-
Needle holders	Shanghai Medical Instruments,China	JC3202	-
operating floor	Chico,China	ZK-HJPT	-
PE-10 tube	Huamei,China		-
Pentobarbital	Merck,America	1030001	-
Rodent Ventilator	Shanghai Alcott Biotech,China	ALC-V8S-P	-
Stereo microscope	Aomei Industry,China	SZM0745-STL3-T3	-
Surgical thermostatic heating pad	Globalebio, China	GE0-20W	-
Triphenyltetrazolium chloride	Servicebio,China	G1017	-
Xylazine	Huamaike Biochemicals and Life Science Research Prouducts,China	323004	-