Dicas e truques cirúrgicos para realizar o transplante de pâncreas suíno

Resumo

O artigo em vídeo resume a técnica de pancreatectomia e alotransplante de pâncreas em um modelo de sobrevida de 3 dias suíno com uma descrição passo a passo do método e ênfase nas dicas e truques cirúrgicos para lidar com a precária e delicada anatomia visceral suína.

Resumo

Apesar dos resultados promissores do transplante de pâncreas no diabetes mellitus tipo 1 e na síndrome metabólica, a maior preocupação em torno dessa técnica de ponta continua sendo a escassez de órgãos considerados aptos para transplante. A alta resistência intravascular, o delicado arcabouço capilar intraparenquimatoso e a complexa anatomia lobular ao redor da vasculatura mesentérica tornam esse órgão mais suscetível a lesões e menos tolerante a traumas triviais em comparação com órgãos como fígado e rim. A dissecção cirúrgica meticulosa e o manuseio criterioso dos tecidos formam a pedra angular de todo o exercício do transplante de pâncreas. Devido à semelhança morfológica entre a anatomia do pâncreas suíno com os vasos mesentéricos circundantes e os órgãos quando comparada à anatomia humana, a demonstração da técnica no modelo suíno poderia ajudar a extrapolar com mais precisão para um ambiente humano. O presente artigo tem como objetivo delinear as dicas e truques cirúrgicos essenciais que precisam ser seguidos, a fim de garantir uma maior taxa de sucesso do transplante deste órgão altamente suscetível em um modelo suíno de sobrevida de 3 dias.

Introdução

Nas últimas décadas, houve um progresso significativo nas estratégias de manejo perioperatório e nas técnicas cirúrgicas, levando à evolução do transplante de pâncreas para uma das estratégias mais promissoras para o tratamento do diabetes mellitus com doença renal terminal (geralmente em conjunto com o transplante renal)¹ . Entretanto, complicações como pancreatite do enxerto, lesão de isquemia-reperfusão e trombose vascular continuam sendo os maiores desafios a serem superados para garantir resultados bem-sucedidos, mais ainda nos enxertos de critérios estendidos mais^lesados2. Além disso, os enxertos de pâncreas são os mais comumente descartados na captação e apresentam as menores taxas de utilização (9%) para qualquer órgão³. Portanto, a máquina de perfusão visa fornecer um ambiente homeostático ótimo para o enxerto de pâncreas com o objetivo de aumentar a taxa de utilização do enxerto, semelhante ao que tem sido alcançado nos transplantes de fígado, rim e pulmão⁴. A anatomia pancreática porcina é complexa em termos de sua arquitetura lobular (composta por três lobos), suas extensões ao redor do eixo mesenterico-portal, suas variações vasculares mesentéricas (em 40%-50%) e seus delicados canais vasculares ao longo da alça C do^duodeno5. Esses atributos anatômicos contribuem para uma dissecção desafiadora tanto na recuperação do enxerto pancreato-duodenal quanto na pancreatectomia receptora para induzir um estado iatrogênico de diabetes apancreático, ou seja, estado de diabetes mellitus induzido cirurgicamente com glicemia de jejum acima de 8 mmol/L. Com base nessas características, a pancreatectomia suína com transplante fornece a replicação mais próxima possível da técnica que poderia ser realizada em humanos como um tratamento definitivo contra o estágio terminal diabetes mellitus. O presente artigo tem como objetivo abordar os seguintes aspectos: (i) delineamento dos cuidados perioperatórios com suínos durante pancreatectomia receptora e implante de enxerto de pâncreas; (ii) detalhes técnicos passo a passo da pancreatectomia do receptor e implante do enxerto pancreato-duodenal e (iii) dicas e truques da operação pancreática do doador e do receptor em modelos porcinos para minimizar a lesão do enxerto e do receptor.

Protocolo

O protocolo recebeu aprovação ética do Comitê de Cuidados com Animais, instituto geral de pesquisa de Toronto. Os animais receberam cuidados humanizados em conformidade com a Sociedade Nacional de Pesquisa Médica e Guia para o cuidado de animais de laboratório, National Institute of Health (NIH), Ontário, Canadá. Para este estudo, foram utilizados suínos machos Yorkshire, com 15 semanas de idade, pesando entre 40 e 50 kg.

OBS: Todo o protocolo do estudo está dividido nas seguintes etapas principais: (i) Recuperação de órgãos e preparo da mesa de apoio; (ii) Pancreatectomia total do receptor e (iii) Implante do enxerto. Toda a cirurgia do doador e do receptor é feita em 1 dia.

1. Captação de órgãos de doadores e preparo da mesa de apoio

NOTA: O método de recuperação de órgãos foi descrito em um protocolo separado⁶. No entanto, o protocolo, em resumo, é descrito aqui juntamente com alguns pontos adicionais específicos para a técnica cirúrgica (dicas cirúrgicas relevantes para a operação do doador).

1. Em resumo, anestesiar o porco doador e fixar a via aérea e o cateter venoso central (descritos abaixo no corte de pancreatectomia do receptor). Incisar e expor as vísceras. Realizar dissecção e mobilização aortocava até a bifurcação em vasos ilíacos.
2. Manuseio intestinal: O intestino delgado suíno é longo e tortuoso, e o intestino grosso é principalmente distendido. Certifique-se de reposicionar as alças intestinais em sua posição anatômica após cada passo da operação do doador para garantir a perfusão adequada e evitar a possibilidade de torção mesentérica.
3. Dissecção hilar: Ligar e dividir os ramos arteriais e o ducto biliar para expor a veia porta. Dissecar o hilo (ligamento hepatoduodenal) o mais alto/distal possível para evitar o risco de lesão dos pequenos canais vasculares que perfundem o aspecto superior da região pancreatoduodenal. Iniciar a esqueletização dos vasos em sequência da direita para a esquerda, até que a superfície anterior da veia porta fique desnuda.
4. Dissecção aortocava: Expor a parte supra-hepática infradiafragmática da aorta dividindo as cruras diafragmáticas. Evitar a dissecção da veia cava inferior ao redor do bosque pancreato-duodenal. Use as artérias renais de ambos os lados como o limite superior marcado de dissecção.
5. Exponha o pâncreas abrindo o saco menor. Ligar e dividir as artérias renais. Canular a aorta infrarrenal e conectar-se com a solução da Universidade de Wisconsin (UW) para flushing.
6. Ligate a aorta supra-hepática e pinça. Lave com 1,5 L-2 L de solução de UW para garantir uma lavagem adequada do intestino e pâncreas (evidente pela aparência visual de palidez). Durante a lavagem in situ do órgão, reposicione o intestino delgado e o intestino grosso em sequência para a linha média, garantindo que não haja torção mesentérica. Esta etapa garante uma lavagem uniforme do intestino e pâncreas com a solução UW (University of Wisconsin) e é importante lembrar.
7. Incisar a veia porta e a veia cava infra-hepática simultaneamente após o início do flush para liberar o efluente venoso. Cubra o abdômen com gelo para garantir a perfusão fria. Dissecar o órgão (enxerto pancreatoduodenal com partes do retroperitônio, psoas, baço e adrenal) em massa.
8. Dissecção a frio: Iniciar a mobilização do enxerto no sentido lateral para medial, desde a cauda do pâncreas até a junção entre a cabeça e o corpo, por dissecção acentuada da fáscia entre o pâncreas e o intestino grosso. Ao realizar essa etapa, segure o pâncreas por sua cobertura retroperitoneal com pinça e peça ao assistente para dar contratração no intestino grosso em direção ao pé.
9. Pinçamento mesentérico: Depois de dividir o tecido fino ao redor do corpo do pâncreas, alça duodenojejunal e intestino grosso, peça ao assistente para contornar o pedículo mesentérico e puxar a alça do intestino grosso caudalmente. Isso garantirá o delineamento do mesentério e a colocação segura da pinça para dividir os grandes vasos mesentéricos em sequência sem lesar o parênquima pancreático.
10. Dissecção extraperitoneal completa do enxerto: Após a divisão dos vasos mesentéricos, iniciar a recuperação do enxerto por dissecção medial para lateral no sentido anti-horário, dividindo os tecidos extrapancreáticos, incluindo a fáscia pararrenal, glândula adrenal, manguito de VCI, músculo psoas e crus diafragmático. Assegurar um plano adequado afastado da aorta para evitar lesar as artérias mesentérica superior e celíaca.
11. Realize a preparação da mesa traseira no gelo. Armazenar o órgão em uma caixa de gelo (tempo de isquemia fria de 5 h).

2. Pancreatectomia do receptor

1. Preparo pré-operatório
   1. Jejuar o animal por pelo menos 6 h antes do tempo de indução estipulado. Administrar uma injeção contendo midazolam (0,15 mg/kg), atropina (0,04 mg/kg) e cetamina (25 mg/kg) por via subcutânea (SC), 15 minutos antes de transportar o animal para a sala de cirurgia (SO). Administrar buprenorfina 0,3 mg injeção de liberação sustentada SC 15 min antes do transporte para a SO.
   2. Posicionamento: Colocar o animal em decúbito dorsal sobre a mesa cirúrgica e armar os membros torácicos para garantir uma posição estável durante a cirurgia.
   3. Via aérea e indução: Ventilar o animal com bolsa e máscara com isoflurano a 3%-5% e oxigênio a 2-3L por minuto, conectando a sonda do oxímetro de pulso e monitorando a frequência cardíaca e a saturação do_O2 .
   4. Após o relaxamento adequado, confirmado pelo relaxamento dos maxilares e saturação de oxigênio e frequência cardíaca estáveis, solicite ao assistente que mantenha a boca aberta com tração adequada nos maxilares superior e inferior relaxados do animal e visualize as pregas vocais utilizando o laringoscópio. Borrifar lidocaína a 2% para relaxar as cordas vocais para evitar espasmos induzidos pela intubação (as cordas vocais porcinas são altamente vasculares e frágeis!).
   5. Intubar com tubo endotraqueal de 7 mm e inflar o balonete com 3-5 mL de ar. Certifique-se da posição do tubo usando a sonda de CO 2 expirado (ETCO₂) e conecte-o ao ventilador, com 14-16 respirações por minuto para atingir um volume corrente de 10-15 mL/kg. Reduzir o isoflurano para 2,5% como dose de manutenção da anestesia inalatória.
   6. Linha intravenosa: Preparar assepticamente o sítio cirúrgico com betadina e colocar um campo estéril. Em seguida, identifique o ponto de referência para a colocação do cateter venoso central, que é o centroide do triângulo formado entre o processo mastoide, o processo acrômio e a cabeça da clavícula. Use uma agulha 16 G para puncionar a veia; após garantir o livre fluxo de sangue venoso, aparente pela cor e falta de pulsatilidade, introduzir um fio-guia utilizando a técnica de Seldinger.
   7. Dilatar o trato usando o dilatador fornecido. Substitua o fio-guia e o dilatador por um cateter 8,5 x 10 Fr e fixe no lugar suturando com uma agulha de corte de sutura de seda 0-0. Conectar a linha IV aos antibióticos intravenosos contendo cefazolina (1 gm) e metronidazol (500 mg), seguido de anestesia venosa com infusão de propofol na velocidade de 10 mL/h.
   8. Monitorização invasiva da pressão arterial: Após o preparo asséptico do sítio cirúrgico com betadina, colocar um pano estéril e fazer uma incisão paralela à traqueia a 2 cm da linha média. Dissecar as fibras do músculo esternomastoideo e da fáscia paratraqueal por dissecção romba com pinça de angulação direita de Lahey e pinça hemostática.
   9. Identificar a veia jugular lateral às fibras dos músculos da cinta e dissecar ao longo do músculo compartimentalizando-a da artéria carótida medialmente usando dissecção romba como descrito acima. Identificar a artéria por sua pulsação, textura (semelhante a um cordão) e plexo perivascular. Mobilize o vaso e funda-o usando duas gravatas de seda 2-0.
   10. Puncionar o vaso com um cateter angiocateter 16G com uma ponta chanfrada apontando para cima e retirar o estilete interno uma vez dentro do vaso. Deslize a bainha externa do cateter usando a técnica de Seldinger e conecte a saída ao sistema de medida da pressão arterial (PA). Antes de conectar o monitor invasivo de PA, calibre a leitura para zero para garantir o registro preciso e fixar o cateter no lugar usando os laços de seda.
   11. Monitoramento e aquecimento da temperatura: Coloque a sonda de registro de temperatura por via oral. Cubra o animal com o edredom de aquecimento Bair-hugger e garanta uma temperatura de 37-38 °C. Lubrifique os olhos com um gel lubrificante neutro para os olhos. Pintar e enfeitar o campo cirúrgico
2. Procedimento cirúrgico
   NOTA: A pele é preparada assepticamente para todos os procedimentos cirúrgicos usando esfoliantes de betadina seguidos da colocação de campos estéreis.
   1. Incisão e exposição: Faça uma incisão mediana do xifesterno até a sínfise púbica usando o modo de corte puro do eletrocautério de Bovie. Certifique-se de manter lateral à uretra na parte inferior da incisão além do falo para evitar lesões. Coloque o afastador de parede abdominal auto-retentivo tomando cuidado para não lesar o baço e o fígado, para otimizar a exposição do campo cirúrgico.
   2. Mobilização da cabeça do pâncreas: Com o assistente fornecendo contratração para o bosque pancreato-duodenal, comece dissecando ao longo do plano fascial avascular entre o parênquima pancreático (lobo duodenal) e a VCI infra-hepática.
   3. Mobilização do anel pancreático: O pâncreas suíno forma um anel ao redor do eixo mesenterico-portal (lóbulo conector). Dissecção ao longo da fáscia em qualquer aspecto da veia porta (VP) para garantir a mobilização completa do lobo de conexão do PV sobrejacente. A maneira mais segura é iniciar a dissecção ao longo de cada lado da veia porta e separar os tecidos circunferencialmente no sentido horário ou anti-horário.
   4. Mobilização da cauda pancreática: Em seguida, identifique a junção entre os tecidos pancreático e pararrenal (visto como uma linha branca) e comece a dissecar a cauda da veia esplênica subjacente que fica próxima ao parênquima. Ligate e dividir as pequenas tributárias venosas ao parênquima, tomando cuidado para não lesar a veia esplênica usando laços de seda 3/0.
   5. Mobilização do corpo pancreático: Dissecar ao longo da fina camada de tecido que separa o parênquima do intestino grosso e do estômago, tomando o cuidado de preservar a fina arcada vascular ao longo da região infrapilórica.
   6. Mobilização pancreatoduodenal: Em seguida, separar o parênquima da alça C do duodeno por dissecção acentuada no bosque pancreato-duodenal por tração contrária, tomando o cuidado de preservar a fina arcada vascular ao longo da alça C do duodeno.
   7. Divisão do ducto pancreático: Identificar o ducto pancreático, ligar com laços de seda 2-0 e dividir mantendo em torno de 3-5 mm coto do ducto na alça C duodenal, afastando-se da arcada vascular duodenal (em íntima relação com o ducto).
   8. Remoção do espécime: Completar a última parte da mobilização dissecando o parênquima a partir da junção entre o lobo de conexão, duodeno e cólon em ambos os lados da veia porta. Extrair a massa do espécime (Figura 1) dividindo o lóbulo de conexão na face anterior do PV. A divisão do parênquima é necessária para extrair o espécime devido à sua localização circunferencial ao redor do PV.
   9. Assegurar a hemostasia ao longo das áreas de dissecção e inspecionar o duodeno em busca de qualquer lesão e congestão vascular (Figura 2).
3. Implante de enxerto pancreato-duodenal
   1. Preparo do enxerto: Preparar o enxerto PV e a extremidade proximal da aorta aparando as bordas para anastomose. Coloque o enxerto preparado na bolsa de órgãos com solução de UW em um banho de gelo. Faça biópsias com agulha grossa da cauda pancreática - armazene em formalina, congele rapidamente e extraia o RNA em um estágio posterior. Sutura do local da biópsia com Prolene 6-0 em forma de figura 8.
   2. Dissecção aortocava: Iniciar pela identificação do ureter direito e dissecar ao longo da fáscia separando o ureter do revestimento retroperitoneal sobre a veia cava inferior. Dissecção ao longo da borda lateral da aorta para expô-la do músculo psoas subjacente. Em seguida, dissecar ao longo do bosque interaortocavo para separar a aorta da VCI.
   3. Teste de pinça: Garantir a mobilização adequada da aorta e da VCI por meio de uma tentativa de colocação de pinças vasculares de Satinsky. Troque de posição com o primeiro assistente e prepare o campo cirúrgico retraindo as alças intestinais do lado esquerdo para expor os grandes vasos para anastomose. Colocar as pinças de ensaio na VCI e na aorta para reavaliar uma mobilização adequada de ambos os vasos para a anastomose.
   4. Anastomose venosa: Após a colocação da pinça vascular de mordida lateral na VCI, faça uma pequena abertura na parede anterior do vaso e estenda-a até um tamanho adequado (compatível com o vaso do enxerto) craniana e caudalmente usando a tesoura de Pott. Lave o lúmen com soro fisiológico heparinizado usando a bainha flexível de uma cânula IV.
   5. Com a dupla agulha Prolene 6-0, faça suturas de canto na VCI (de dentro para fora) e na veia porta do enxerto (de dentro para fora). Fixar a sutura do canto caudal e passar uma das agulhas ao longo da parede posterior do enxerto e da veia receptora de forma contínua. Fixar a parede anterior de forma semelhante (externa-contínua) e fixar o nó no centro da parede anterior após lavar a luz da anastomose com solução salina heparinizada.
   6. Despinçamento da veia: Coloque uma pinça vascular do Bulldog na veia porta do enxerto, longe da anastomose, e solte lentamente a pinça de mordida lateral da VCI receptora. Verifique se há enchimento venoso e qualquer sangramento maior da anastomose.
   7. Anastomose arterial: Coloque a pinça de mordida lateral na aorta tomando cuidado para não lesionar os ramos lombares ao longo da parede posteromedial do vaso. Instruir o anestesista a injetar heparina (100 U/kg PV) e metilprednisolona (500 mg) através do cateter venoso central.
   8. Faça uma abertura na parede anterior do vaso e estenda-a craniana e caudalmente tomando o cuidado de não dissecar ao longo da parede do vaso. Lavar a luz com solução salina heparinizada e, com agulha dupla Prolene 6-0, suturar a extremidade proximal da aorta do enxerto à abertura aórtica receptora de forma contínua pela técnica de Paraquedas. Lavar o lúmen com soro fisiológico heparinizado antes de amarrar o nó final na parede anterior do vaso.
   9. Reperfusão: Cuide dos dois aspectos a seguir ao executar esta etapa. Primeiro, as alterações hemodinâmicas em que ocorre queda drástica da PA média. Monitorar minuto a minuto a PA invasiva e realizar titulação da dose do vasopressor (infusão de noradrenalina) e da pré-carga volêmica para manter a PA média alvo entre 45-50 mmHg.
   10. Segundo, manter a hemostasia. Após a retirada da pinça do buldogue da veia, avaliar se há sangramento maior do parênquima, região para-aórtica e área periportal; Em seguida, solte o pinçamento aórtico e verifique se há sangramento do local da anastomose arterial. Fixar os pontos de sangramento com ligaduras e sutura hemostática. Peça ao anestesista para injetar um frasco de ácido tranexâmico através do cateter venoso central.
       NOTA: Uma regra importante é minimizar o manuseio agressivo do pâncreas durante esta fase de reperfusão (para evitar edema e hematoma do enxerto).
   11. Anastomose intestinal: Após garantir que não haja torção mesentérica, isole uma alça de jejuno, a 40-50 cm de distância da junção duodenoveneunal, e aproxime-a do enxerto. Anastomosar o duodeno do enxerto ao jejuno receptor de forma contínua látero-lateral com fio de Polidioxanona 4-0, tomando o cuidado de garantir um diâmetro luminal adequado de 1,5-2 cm.
   12. Hemostasia e biópsia pós-reperfusão: Garantir a hemostasia ao redor do enxerto e nos locais de anastomose. Fazer três biópsias com agulha grossa da cauda pancreática1 h após o armazenamento de reperfusão em formalina, congelar rapidamente e extrair o RNA em um estágio posterior. Sutura do local da biópsia com Prolene 6-0 em forma de figura 8.
   13. Fechamento da parede abdominal: Após avaliação da retenção de esfregões e obtenção de hemostasia, sutura contínua do músculo reto abdominal com agulha de Polidioxanona 0, tomando cuidado na linha média inferior para manter-se afastado da uretra. Fechar a pele usando fio de seda 0 de forma contínua.
       OBS: O ideal é que sejam recomendadas suturas monofilamentares (Nylon); No entanto, como este é um modelo de sobrevivência de 3 dias, a seda é aceitável nesses modelos experimentais.
   14. Amarrar o cateter venoso central: Crie um túnel subcutâneo no pescoço e fixe o cateter venoso central enterrando-o sob o túnel e suturando a pele sobrejacente com uma agulha cortante de seda 0-0.
   15. Remoção do cateter arterial: Após garantir uma PA média estável (40-50 mmHg) e uma tendência de melhora dos níveis de pH e lactato na gasometria, remova o cateter arterial e ligue o vaso para garantir a hemostasia no pescoço. Fechar a pele sobrejacente com fio de seda 0 de forma contínua.
   16. Posicione o animal e extubação: Sob todas as precauções necessárias, gire o esterno do animal em uma carreta de transporte. Observar a saturação do Ø₂ e a reversão da anestesia (movimentação de membros, esforços respiratórios espontâneos, SpO 2 >95% de_{desconto no Ø 2} e suporte ventilatório) e extubar o animal. Transporte até o curral e posicionamento do animal esternal e monitoramento do estado hemodinâmico até a estabilidade.

Figura 1: Fragmento de pancreatectomia ressecado em massa. Observar o anel de tecido pancreático ao redor da veia porta in vivo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Imagem do duodeno. A alça C do duodeno com uma arcada vascular preservada (cabeça de seta) comparada com a alça jejunal circundante e avaliada quanto à congestão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Resultados

Os parâmetros bioquímicos peri e pós-operatórios, até 3 dias, dos cinco modelos de sobrevida do transplante de pâncreas são resumidos a seguir (numerados como PTX 1 a 5 em cronologia). Dos cinco transplantes totais de pâncreas, todos se saíram bem durante o período de sobrevida de 3 dias, como evidenciado pelo bem-estar geral e pelos testes de lesão pancreática e função endócrina. Os resultados apresentados a seguir são representativos da experiência de um modelo de sobrevida de 3 dias de pancreatectomia...

Discussão

O protocolo atual tem sido realizado para demonstrar a técnica e a viabilidade da pancreatectomia e alotransplante de pâncreas em modelos suínos. Os animais foram observados por um período de 3 dias após o transplante para demonstrar a confiabilidade da técnica de pancreatectomia e do alotransplante. Todos os animais foram monitorados e amamentados por 3 dias após a cirurgia usando um protocolo padronizado de cuidados com os animais com antibióticos, fluidos, analgésicos, nutrição suplementar e imunossupressor...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Belzer UW Cold storage solution	Bridge to life Ltd (Columbia, SC, USA)	4055
Calcium gluconate (10%)	Fresenius Kabi Canada Ltd (Toronto, ON)	C360019
Composelect (blood collection bags)	Fresenius Kabi Canada Ltd (Toronto, ON)	PQ31555
Heparin (10000 IU/10 ml)	Fresenius Kabi Canada Ltd (Toronto, ON)	C504710
Lactated Ringer's	Baxter (Mississauga, ON, Canada)	JB2324
Percutaneous Sheath Introducer Set with Integral Hemostasis Valve/side Port for use with 7-7.5 Fr Catheters	Arrow International LLC	SI-09880
Sodium bicarbonate (8.4%)	Fresenius Kabi Canada Ltd (Toronto, ON)	C908950
Solu-Medrol	Pfizer Canada Inc.	52246-14-2
Surgical retreival and transplant instrument set