Retalho axial da artéria epigástrica superficial inferior para estudo dos efeitos do pré-condicionamento isquêmico em modelo de ratos

Resumo

Este protocolo descreve a coleta, sutura e monitorização de retalhos fasciocutâneos em ratos que permitem boa visualização e manipulação do fluxo sanguíneo através dos vasos epigástricos superficiais inferiores por meio de pinçamento e ligadura dos vasos femorais. Isso é fundamental para estudos envolvendo pré-condicionamento isquêmico.

Resumo

Os retalhos fasciocutâneos (FCF) tornaram-se o padrão-ouro para reconstrução de defeitos complexos em cirurgia plástica e reconstrutiva. Esta técnica poupadora de músculo permite transferir tecidos vascularizados para cobrir qualquer grande defeito. FCF pode ser usado como retalhos pediculados ou como retalhos livres; no entanto, na literatura, as taxas de falha para FCF pediculado e FCF livre são superiores a 5%, deixando espaço para aprimoramento dessas técnicas e maior expansão do conhecimento nessa área. O pré-condicionamento isquêmico (PI) tem sido amplamente estudado, mas os mecanismos e a otimização do regime de PI ainda precisam ser determinados. Esse fenômeno é, de fato, pouco explorado na cirurgia plástica e reconstrutiva. Neste estudo, é apresentado um modelo cirúrgico para estudar o regime de PI em um modelo de retalho fáscio-cutâneo axial de ratos, descrevendo como avaliar de forma segura e confiável os efeitos da PI na sobrevida do retalho. Este artigo descreve o procedimento cirúrgico completo, incluindo sugestões para melhorar a confiabilidade desse modelo. O objetivo é fornecer aos pesquisadores um modelo reprodutível e confiável para testar vários regimes de pré-condicionamento isquêmico e avaliar seus efeitos na sobrevida do retalho.

Introdução

A cirurgia plástica e reconstrutiva está em constante evolução. O desenvolvimento dos retalhos muscular, fasciocutâneo e perfurante tem possibilitado reconstruções de melhor qualidade e redução da morbidade. Combinando esse conhecimento anatômico aprimorado com habilidades técnicas aprimoradas, os cirurgiões reconstrutivos podem realizar transferências de retalhos livres quando os defeitos não estão próximos de nenhuma solução local. Entretanto, embora a cirurgia de retalho perfurante seja atualmente a técnica mais avançada em cirurgia reconstrutiva, a literatura relata uma taxa de falha de 5% nas transferências de retalhos livres ^1,2,3 e de até 20% para a reconstrução de retalho pediculado 4,5,6. A falha parcial a total do retalho ocorre quando o pedículo do retalho está comprometido, portanto, é essencial a busca contínua de melhorias nas técnicas atuais. Um dos métodos para melhorar a sobrevida do retalho é promover sua neovascularização no leito da ferida, permitindo a perfusão por outra fonte que não o pedículo. O pré-condicionamento isquêmico (PI) foi inicialmente descrito em^{um modelo} cardíaco7, demonstrando que um órgão exposto à isquemia controlada sobrevive em maior grau após perder seu suprimento sanguíneo primário por ser submetido à neovascularização induzida por isquemia. Vários autores têm estudado esse princípio fundamental para otimizar a sobrevida do retalho em modelos pré-clínicos e clínicos ^8,9,10.

A vantagem desta técnica sobre outros métodos para melhorar a sobrevida do retalho é a sua facilidade de execução, consistindo em testes de pinça/declamp da fonte sanguínea. No modelo de ratos, autores anteriores utilizaram o retalho da artéria epigástrica superficial inferior (SIEA) para estudar a I.P. por meio do pinçamento do pedículo principal11,12,13. No entanto, vários problemas técnicos podem ser encontrados com esse modelo, e a literatura carece de protocolos bem descritos.

Portanto, este trabalho tem como objetivo fornecer aos pesquisadores uma descrição detalhada de uma técnica de captação de retalhos SIEA de ratos com dissecção ampliada dos vasos femorais para permitir estudos intravenosos em um modelo de retalho fáscio-cutâneo axial. Esse modelo mantém a integridade dos vasos epigástricos e manipula os vasos femorais, que são mais resistentes. Compartilhamos nossa experiência e ferramentas para aprimorar o estudo desse fenômeno e aumentar a replicabilidade desse procedimento.

Protocolo

O Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Hospital Geral de Massachusetts aprovou o protocolo experimental (IACUC- protocolo #2022N000099). Os autores seguiram a lista de verificação de diretrizes ARRIVE (Animal Research: Reporting In Vivo Experiments) para este trabalho. Todos os animais receberam cuidados humanizados seguindo o Guia do Instituto Nacional de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. Um total de 12 ratos Lewis machos (250-350 g, 8-10 semanas de idade) foram usados para todos os experimentos.

1. Preparo dos animais

NOTA: Os ratos têm uma alta taxa metabólica e reservas de gordura limitadas; Portanto, não os faça jejum antes da cirurgia e nunca restrinja água antes da cirurgia.

1. Para todos os procedimentos, sedar o animal usando isoflurano a 3%-5% na câmara do vaporizador de precisão de isoflurano (ver Tabela de Materiais). Quando o animal estiver bem sedado, reduza a dose de isoflurano para 1%-3% através de um cone nasal.
   NOTA: Um segundo pesquisador deve monitorar continuamente a frequência respiratória e adaptar a dose de isoflurano.
2. Aos 2 dias antes da cirurgia inicial, colocar um colar eletrônico de plástico (tamanho para um rato; ver Tabela de Materiais) no animal e usar uma sutura de náilon 3-0 para fixar o colar eletrônico nas laterais dorsal e ventral do pescoço do animal. Aguarde 2 dias para aclimatação a este e-collar; Deve caber confortavelmente, mas não obstruir as vias aéreas do animal.

2. Cuidados pré-operatórios

1. No dia da cirurgia inicial, raspar a face anterior inferior do abdome, limpando a área da parte lateral do animal para passar ligeiramente além da linha média.
2. Em seguida, use um produto depilatório (creme depilatório; ver Tabela de Materiais) para remover todos os pelos restantes nesta área (a face anterior inferior do abdômen, conforme descrito na etapa anterior).
3. Lave e seque bem a área com esfoliação cirúrgica e solução de betadina (iodopovidona a 10%).
4. Administrar 0,05 mg/kg de buprenorfina por via subcutânea.

3. Monitorização intraoperatória

1. Certifique-se de que o animal permaneça com isoflurano a 1%-3% através de um vaporizador de precisão e cone nasal durante toda a cirurgia. Monitore a frequência respiratória, a respiração e o nível de saturação de oxigênio do animal por observação visual e um oxímetro de pulso de roedor feito para um rato.
   OBS: A frequência respiratória típica é de 80-90 ciclos por minuto^14,15. Qualquer reação que indique consciência observada durante a cirurgia requer o aumento da taxa de isoflurano.
2. Coloque o animal em uma almofada de aquecimento durante toda a cirurgia, pois a temperatura corporal dos roedores esfria rapidamente sob anestesia.

4. Retirada do retalho epigástrico

1. Coloque o animal em decúbito dorsal. Faça a barba do abdome abaixo da prega inguinal até acima do nível do processo xifoide.
2. Usando uma caneta de pele estéril e régua, marque primeiro a linha média do abdômen do animal e, em seguida, a prega inguinal. Uma incisão ao longo da linha da prega inguinal expõe o ramo inferior dos vasos epigástricos dos vasos femorais.
   1. Antes da incisão, desenhar o futuro retalho em forma oval ou retangular até 6 cm na vertical e 3 cm na horizontal, estendendo-se cranialmente a partir da prega inguinal.
   2. Desenhar cinco ou seis marcas equidistantes perpendiculares aos limites do retalho. Estes servem como guias para melhor realinhamento da pele após o retalho ter sido levantado e ser suturado novamente no local (Figura 1).
3. Usando tesoura de Ragnell (ver Tabela de Materiais), faça uma incisão longitudinal de 3-4 cm na prega inguinal.
   NOTA: Os pesquisadores devem ter cuidado e puxar a pele para cima para evitar danificar os vasos.
4. Expor e identificar os vasos femorais e epigástricos usando pinças microcirúrgicas #4 joalheiros (ver Tabela de Materiais), abrindo e fechando a pinça para separar a fáscia e ter acesso aos vasos que estão abaixo do coxim gorduroso inguinal.
5. Utilizar a incisão inguinal para iniciar a incisão do retalho com tesoura de Ragnell. Preste atenção para minar a espessura total da pele e do tecido conjuntivo sobre o músculo abdominal.
   1. Para facilitar a colheita do retalho, certifique-se de que a tesoura siga o plano de dissecção correto, empurrando em direção ao músculo e espalhando as lâminas da tesoura. Execute esse descolamento do retalho movendo-se em uma direção coordenada ao redor do desenho do retalho.
      NOTA: Para determinar o plano adequado, nenhum microvaso deve permanecer presente abaixo do plano de dissecção.
6. À medida que a ponta inicial do retalho é liberada da pele circundante, continuar a captação do retalho descolando da parte distal para a proximal, usando as pontas tesoura de Ragnell para separar o retalho do músculo enquanto cauteriza os vasos perfurantes e os vasos do plexo dérmico ao redor do retalho. Isso garante que todo o sangue flua para o retalho através dos vasos epigástricos.
   NOTA: Deve-se ter atenção para não danificar a vasculatura do retalho puxando com muita força ou torcendo a pele enquanto o retalho está sendo retirado. Sugere-se colocar a porção livre do retalho cuidadosamente sobre o polegar da mão do cirurgião enquanto se trabalha a parte proximal do retalho.
7. Uma vez retirado o retalho, os ramos dos vasos epigástricos superficiais inferiores são visíveis na face profunda da pele. Procure encapsular a totalidade de ambos os ramos do SIEA com o retalho, levantando suavemente o retalho para cima para visualizar os vasos.
8. Uma vez colhido o retalho, separar os coxins gordurosos da face inferior, tanto na face medial quanto na lateral do retalho. Utilizar o cautério bipolar (ver Tabela de Materiais) para cauterizar os coxins gordurosos próximos à borda da incisão, atentando-se para não lesar o pedículo epigástrico superficial inferior (Figura 2).

Figura 1: Desenho do retalho no abdome do animal. A linha média é utilizada como marcador para localizar a localização do retalho epigástrico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Retalho totalmente elevado. O coxim gorduroso é preservado na parte proximal do retalho para preservar a vascularização proveniente do pedículo epigástrico superficial inferior. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

5. Preparo do vaso e indução de isquemia

OBS: O retalho é totalmente colhido nesta fase, mas os vasos ainda não estão preparados para o pré-condicionamento isquêmico.

1. Antes da preparação dos vasos femorais, injetar uma dose única de 17,5 UI de heparina sódica através da veia peniana.
   NOTA: Esta injeção é feita expondo a glande, segurando o pênis externamente usando pinça de Adson atraumática, identificando a veia peniana e injetando superficialmente e ao longo da veia peniana usando uma seringa 27G.
2. Para criar uma melhor exposição, coloque o animal dentro de um afastador auto-retentor Lone Star (consulte a Tabela de Materiais).
   OBS: As estadas elásticas Lone Star afastam a pele do local cirúrgico, permitindo uma melhor visualização dos vasos. O pesquisador agora deve trabalhar sob microscópio cirúrgico (aumento de 40x).
3. Para exposição dos vasos, utilizar duas pinças microcirúrgicas #4 para dissecar os vasos femorais proximal e distalmente à emergência dos vasos epigástricos superficiais. Não segure os vasos diretamente, mas use a pinça para separar suavemente o tecido conjuntivo camada por camada, abrindo e fechando a pinça verticalmente para os vasos.
4. Nos vasos femorais distais, limpe a fáscia e libere suavemente o nervo da artéria e da veia. Usando um 8-0 sutura com náilon (ver Tabela de Materiais), ligadura dos vasos femorais distais contornando o porta-agulha microcirúrgico sob a artéria e veia, apertando a sutura e amarrando esses vasos (Figura 3). O nervo não deve ser lesado nem amarrado para minimizar a morbidade pós-operatória.
   NOTA: Os cirurgiões podem usar uma das pinças para puxar suavemente a fáscia lateral ao nervo com uma mão e usar outro par para separar totalmente o nervo dos vasos.
5. Usando um 8-0 suturar, ligadura dos vasos distais logo após a emergência dos vasos epigástricos, deixando uma distância de 1 mm após a origem do pedículo. Isso garante que nenhum fluxo reverso venha através do SIEA dos ramos profundos durante as fases isquêmicas.
   OBS: A Figura 3 mostra a ligadura dos vasos femorais distais após a emergência do pedículo da SIEA.
6. Nos vasos femorais proximais, repetir o mesmo processo de limpeza do tecido conjuntivo. No entanto, separe a artéria e a veia uma da outra para permitir um pinçamento eficiente. Isso pode ser conseguido colocando-se suavemente pinças fechadas entre a artéria e a veia e abrindo lentamente as pinças na direção de corrida dos vasos.
7. Para induzir isquemia intermitente, colocar pinças microcirúrgicas separadamente em cada artéria e veia femoral proximal (Figura 4).
8. Ao término das lesões isquêmicas, sutura do retalho à sua posição original, alinhando-se as marcações conforme traçado no pré-operatório (passo 4.2.2). Sutura do retalho com fio de náilon 3-0 (ver Tabela de Materiais), iniciando-se na prega inguinal medialmente, ao redor do retalho, e terminando na prega inguinal lateralmente.
   OBS: Ao longo da prega inguinal, pode-se utilizar a mesma sutura para colocação de pontos interrompidos. Isso permite que os pesquisadores abram essa área sem afetar o fechamento do retalho.
9. Para verificar o suprimento sanguíneo para o retalho, injetar 0,25 mL de fluoresceína sódica estéril (10%, ver Tabela de Materiais) na veia peniana usando a mesma técnica e ferramentas descritas para a injeção de solução salina de heparina (passo 5.1). Após 3 min, ilumine uma lâmpada UV-366 nm de onda longa (luz de excitação fluoresceína) para revelar as áreas fluorescentes correspondentes às áreas perfundidas.
10. Após o fechamento e verificação, espalhe metronidazol triturado (ver Tabela de Materiais) ao longo das suturas para evitar automutilação e borrife atadura líquida na mesma área.
11. Antes da recuperação do animal da anestesia, administrar Carprofeno (2-5 mg/kg) por via subcutânea.
12. Os pesquisadores agora podem acessar os vasos femorais, a única fonte de alimentação para o retalho, para testar regimes experimentais de pré-condicionamento isquêmico por vários dias seguidos. Em cada dia de cirurgia, fornecer uma dose de 2-5 mg/kg de Carprofeno por via subcutânea.
13. Ao final do período de pré-condicionamento isquêmico, para retirar o retalho do suprimento sanguíneo epigástrico, cauterizar inferior ao coxim gorduroso ao longo da borda inferior do retalho.

Figura 3: Visão microscópica dos vasos femorais. Os vasos femorais distais estão amarrados. O nervo foi preservado. O lado da dissecção é a prega inguinal direita (R). Ampliação: 40x. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Pinçamento dos vasos femorais proximais com duas pinças microcirúrgicas separadas. Isso permite um melhor controle do clampeamento, garantindo a ausência de fluxo arterial e venoso retrógrado. (A) mostra ambos os vasos femorais esquerdos (L) pinçados. Os vasos epigástricos superficiais inferiores são visíveis (SIEA/SIEV). (B) mostra artéria femoral pinçada e veia femoral antes do pinçamento, na prega inguinal direita do animal (R). Ampliação: 40x. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

6. Cuidados pós-operatórios

1. Administrar Carprofeno (2-5 mg/kg) por via subcutânea uma vez ao dia por 4 dias de pós-operatório e uma vez após qualquer sedação suplementar.
2. Durante as primeiras 24 h, observe o animal duas vezes. Em seguida, avaliar o animal e o retalho pelo menos uma vez ao dia até o final do estudo.
   NOTA: O animal deve estar brilhante, alerta e reativo. Se houver sinais de infecções oportunistas sistêmicas (isto é, letargia ou perda de peso), o animal deve ser sacrificado seguindo protocolos aprovados pela instituição.
3. Monitorar o retalho quanto à necrose precoce (antes da ligadura no 5º dia de pós-operatório [DPO5]), deiscência do sítio cirúrgico, infecção, hematoma, isquemia e/ou autofagia do retalho.
4. Se houver deiscência do sítio cirúrgico, desbridar as margens da cicatriz, limpar o local com iodopovidona a 10% antes de enxaguar abundantemente com água estéril ou soro fisiológico estéril e fechar a ferida com pontos de náilon 3-0 interrompidos.
5. Ao final do estudo, sacrificar o animal com uma injeção IV de 0,1-0,2 mL de solução de fenobarbital sódico a 31% ou com o protocolo recomendado pela IACUC local. Confirmar a morte pela ausência de batimentos cardíacos e movimentos respiratórios.

Resultados

Todos os retalhos foram viáveis no POD5, mostrando boa vascularização pelo SIEA isoladamente. A Figura 5 mostra o retalho antes e após a injeção IV de fluoresceína, mostrando vascularização completa.

Figura 5: Angiofluoresceinografia intravenosa imediata (DPO0). Essa avaliação most...

Discussão

Este artigo descreve um modelo de retalho fasciocutâneo reprodutível colhido em ratos, permitindo a avaliação da I.P. Este protocolo cirúrgico passo a passo fornece aos grupos de pesquisa um modelo confiável para testar diferentes regimes de IP. Ao impedir qualquer vascularização que não seja o pedículo, esse modelo permite estudar a neovascularização do retalho a partir do leito e margem da ferida. Este estudo realizou a ligadura no DPO5, pois estudos prévios observaram a autonomização deste retalho em ra...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Syringe Luer-Lok Tip	BD	309628
3-0 Ethilon 18” Black Monofilament Nylon suture	Ethicon	ETH-663H
8-0 Ethilon 12” Black Monofilament Nylon suture	Ethicon	1716G
Adson Atraumatic Forceps	Aesculap Surgical Instruments	BD51R
Akorn Fluorescein Injection USP 10% Single Dose Vial 5 mL	Akorn	17478025310
Betadine Solution 5% Povidone-Iodine Antiseptic Microbicide	PBS Animal Health	11205
Bipolar Cords	ASSI	ASSI.ATK26426
Buprenorphine Hydrochloride Injection	PAR Pharmaceutical	3003406C	This concentration needs to be diluted for rodents.
Depilatory product – Nair Hair remover lotion	Nair	NC0132811
Ear tag applier	World Precision Instruments	NC0038715
Gauze Sponges	Curity	6939
Isoflurane Auto-Flow Anesthesia Machine	E-Z Systems	EZ-190F
Isoflurane, USP	Patterson Veterinary	1403-704-06
Jewelers Bipolar Forceps Non-Stick 11 cm, straight pointed tip, 0.25 mm tip diameter	ASSI	ASSI.BPNS11223
Lone Star elastic stays	Cooper Surgical	3311-1G
Lone star Self-retaining retractor	Cooper Surgical	3304G
Metronidazole tablets USP	Teva	500111-333-06
Micro spring handle scissors	AROSurgical	11.603.14
Microscope (surgical)	Leica	M525 F40
Microsurgical clamp applying forceps	Ambler Surgical	31-906
Microsurgical clamps (x2)	Millennium Surgical	18-B1V
Microsurgical Dumont #4 forceps	Dumont Swiss made	1708-4TM-PO
Microsurgical needle holder	ASSI	B-14-8
Needle holder	World Precision Instruments	501246
Nosecone for Anesthesia	World Precision Instruments	EZ-112
Pixel analysis software	GNU Image Manipulation Program v2.10	GIMP	GNU Open licence
PrecisionGlide Needle 27 G	BD	305109
Ragnell Scissors	Roboz Surgical	RS-6015
Rimadyl (carprofen)	Zoetis	10000319	This concentration needs to be diluted for rodents
Scientific Elizabethan collar (e-collar) for Rats	Braintree Scientific	NC9263311
Small animal ear tag	National Band & Tag Company	Style 1005-1
Small Animal Heated Operating Table (Adjustable)	Peco Services Ltd	69023
Sterile towel drape	Dynarex Corporation	4410
Sterile water for injection and irrigation	Hospira	0409488724-1
Surgical scrub – BD ChloraPrep Hi-Lite Orange 3 mL applicator with Sterile Solution	BD	930415
UV lamp	UVP	UVL-56
Webcol Alcohol prep pads	Simply Medical	5110