쥐 모델에서 허혈성 전처리 효과를 연구하기 위한 표재성 하복부 동맥 축 플랩

요약

이 프로토콜은 대퇴 혈관을 클램핑 및 결찰을 통해 표재성 하상복부 혈관을 통한 혈류를 잘 시각화하고 조작할 수 있도록 하는 쥐의 피부 근막 피판을 채취, 봉합 및 모니터링하는 것을 설명합니다. 이것은 허혈성 전처리와 관련된 연구에 중요합니다.

초록

피부 근막 피판(FCF)은 성형 및 재건 수술에서 복잡한 결함 재건을 위한 황금 표준이 되었습니다. 이 근육 보존 기술을 사용하면 혈관 조직을 옮겨 큰 결함을 덮을 수 있습니다. FCF는 페디클 플랩 또는 프리 플랩으로 사용할 수 있습니다. 그러나 문헌에서 페디클 FCF 및 유리 FCF의 실패율은 5% 이상이므로 이러한 기술에 대한 개선과 이 분야의 추가 지식 확장의 여지가 있습니다. 허혈성 전처리(I.P.)가 널리 연구되었지만 I.P. 요법의 메커니즘과 최적화는 아직 결정되지 않았습니다. 이 현상은 실제로 성형 및 재건 수술에서 제대로 조사되지 않았습니다. 여기에서는 I.P. 쥐 축 방향 피부 피판 모델에서 요법을 연구하기 위해 수술 모델을 제시하여 I.P.가 플랩 생존에 미치는 영향을 안전하고 안정적으로 평가하는 방법을 설명합니다. 이 문서에서는 이 모델의 신뢰성을 향상시키기 위한 제안을 포함하여 전체 수술 절차에 대해 설명합니다. 목표는 연구자들에게 다양한 허혈성 전처리 요법을 테스트하고 플랩 생존성에 미치는 영향을 평가할 수 있는 재현 가능하고 신뢰할 수 있는 모델을 제공하는 것입니다.

서문

성형 및 재건 수술은 끊임없이 진화하고 있습니다. 근육, 피부 근막 및 천공기 피판의 발달로 이환율을 줄이면서 더 나은 품질의 재건을 제공할 수 있게 되었습니다. 이 향상된 해부학적 지식과 향상된 기술을 결합하여 재건 외과의는 결함이 국소 솔루션에 가깝지 않을 때 무료 플랩 이식을 수행할 수 있습니다. 그러나, 천공 플랩 수술은 현재 재건 수술에서 가장 진보된 기술이지만, 문헌은 자유 플^{랩 이식에서} 5%의 실패율(1,2,3)과 유경 플^{랩 재건술}(^4,5,6)에서 최대 20%의 실패율을 보고합니다. 부분적 또는 전체 플랩 실패는 플랩의 척추경이 손상되었을 때 발생하므로 현재 기술의 개선 사항을 지속적으로 찾는 것이 필수적입니다. 플랩 생존을 향상시키는 방법 중 하나는 상처 부위에서 신생 혈관 형성을 촉진하여 척추경 이외의 소스에 의한 관류를 허용하는 것입니다. 허혈성 전처리(I.P.)는 심장 모델⁷에서 초기에 기술되었으며, 이는 제어된 허혈에 노출된 기관이 허혈 유발 혈관신생을 겪음으로써 1차 혈액 공급을 상실한 후 더 높은 수준으로 생존한다는 것을 보여줍니다. 몇몇 저자는 전임상 및 임상 모델 ^8,9,10에서 플랩 생존을 최적화하기 위해 이 초석 원리를 연구했습니다.

플랩 생존율을 향상시키는 다른 방법에 비해 이 기술의 장점은 혈액 공급원의 클램프/디클램프 테스트로 구성된 구현이 쉽다는 것입니다. 쥐 모델에서 이전 저자는 표재성 하복부 동맥(SIEA) 플랩을 사용하여 I.P. 주 척추경^11,12,13을 클램핑합니다. 그럼에도 불구하고 이 모델에서는 몇 가지 기술적인 문제가 발생할 수 있으며 문헌에는 잘 설명된 프로토콜이 없습니다.

따라서 이 작업은 연구자들에게 대퇴 혈관의 확장된 해부와 함께 쥐 SIEA 플랩 조달 기술에 대한 자세한 설명을 제공하여 I.P. 축 방향 피부 피판 모델에 대한 연구. 이 모델은 상복부 혈관의 무결성을 유지하고 대신 더 탄력적인 대퇴 혈관을 조작합니다. 우리는이 현상에 대한 연구를 개선하고이 절차의 복제 가능성을 높이기 위해 경험과 도구를 공유합니다.

프로토콜

매사추세츠 종합 병원 기관 동물 관리 및 사용 위원회는 실험 프로토콜(IACUC-프로토콜 #2022N000099)을 승인했습니다. 저자는 이 작업에 대한 ARRIVE(Animal Research: Reporting In Vivo Experiments) 지침 체크리스트를 따랐습니다. 모든 동물은 실험 동물의 관리 및 사용을 위한 국립 보건원 가이드에 따라 인도적 관리를 받았습니다. 총 12마리의 수컷 루이스 래트(250-350 g, 8-10주령)를 모든 실험에 사용하였다.

1. 동물 준비

참고: 쥐는 신진대사율이 높고 지방 매장량이 제한되어 있습니다. 따라서 수술 전에 금식하지 말고 수술 전에 물을 제한하지 마십시오.

1. 모든 절차에 대해 이소플루란 정밀 기화기의 챔버에서 3%-5% 이소플루란을 사용하여 동물을 진정시킵니다( 재료 표 참조). 동물이 잘 진정되면 코 콘을 통해 이소 플루 란 용량을 1 % -3 %로 낮추십시오.
   참고: 두 번째 연구원은 호흡수를 지속적으로 모니터링하고 이소플루란 용량을 조정해야 합니다.
2. 초기 수술 2일 전에 플라스틱 e-칼라(쥐 크기, 재료 표 참조)를 동물에 놓고 3-0 나일론 봉합사를 사용하여 동물 목의 등쪽과 복부 쪽에 e-칼라를 고정합니다. 이 e-collar에 적응하는 데 2일이 소요됩니다. 꼭 맞아야 하지만 동물의 기도를 막지 않아야 합니다.

2. 수술 전 관리

1. 초기 수술 당일, 복부의 아래쪽 앞쪽을 면도하여 동물의 측면 부분에서 정중선을 약간 지나서 영역을 제거하십시오.
2. 그런 다음 제모 제품(제모 크림, 재료 표 참조)을 사용하여 이 부위(이전 단계에서 설명한 복부의 아래쪽 앞쪽)에 남아 있는 모든 모발을 제거합니다.
3. 외과 용 스크럽과 베타 딘 용액 (10 % 포비돈 요오드)으로 해당 부위를 철저히 씻고 말리십시오.
4. 부프레노르핀 0.05mg/kg을 피하 투여한다.

3. 수술 중 모니터링

1. 수술 내내 정밀 기화기와 노즈콘을 통해 동물이 1%-3% 이소플루란을 유지하도록 합니다. 육안 관찰과 쥐를 위해 만들어진 설치류 맥박 산소 측정기를 통해 동물의 호흡수, 호흡 및 산소 포화도 수준을 모니터링합니다.
   알림: 일반적인 호흡수는 분당 80-90 사이클입니다^14,15. 수술 중 관찰된 의식을 나타내는 모든 반응은 이소플루란 비율을 증가시켜야 합니다.
2. 설치류의 체온이 마취하에 급속히 냉각됨에 따라 수술 전체를 위해 동물을 온난화 패드에 올려 놓으십시오.

4. 상복부 플랩 수확

1. 동물을 앙와위 자세로 놓습니다. 사타구니 주름 아래에서 xiphoid 과정의 수준 위까지 복부를 면도하십시오.
2. 멸균 된 스킨 펜과 자를 사용하여 먼저 동물의 복부 정중선을 표시 한 다음 사타구니 주름을 표시하십시오. 사타구니 주름선을 따라 절개하면 대퇴 혈관에서 분기되는 하복부 혈관이 노출됩니다.
   1. 절개하기 전에 미래의 플랩을 타원형 또는 직사각형으로 세로로 최대 6cm, 수평으로 3cm까지 그려 사타구니 주름에서 두개골로 뻗어 있습니다.
   2. 플랩 한계에 수직인 5개 또는 6개의 등거리 표시를 그립니다. 이는 플랩을 들어 올리고 제자리로 봉합한 후 피부를 더 잘 재정렬하기 위한 가이드 역할을 합니다(그림 1).
3. Ragnell 가위( 재료 표 참조)를 사용하여 사타구니 주름에 3-4cm 세로 절개를 합니다.
   알림: 연구원은 혈관 손상을 방지하기 위해 주의를 기울이고 피부를 위로 당겨야 합니다.
4. #4 보석상 미세 수술 겸자( 재료 표 참조)를 사용하여 대퇴 및 상복부 혈관을 노출하고 식별하여 겸자를 열고 닫아 근막을 분리하고 사타구니 지방 패드 아래에 있는 혈관에 접근합니다.
5. 사타구니 절개를 사용하여 Ragnell 가위를 사용하여 플랩 절개를 시작합니다. 복부 근육의 피부와 결합 조직의 전체 두께를 훼손하도록주의하십시오.
   1. 플랩 수확을 용이하게 하려면 가위가 근육 쪽으로 밀고 가위 날을 벌려 올바른 해부면을 따르도록 합니다. 플랩 도면 주위에서 조정된 방향으로 이동하여 이 플랩 훼손을 수행합니다.
      알림: 적절한 평면을 결정하려면 해부면 아래에 미세 혈관이 남아 있지 않아야 합니다.
6. 플랩의 초기 팁이 주변 피부에서 분리되면 Ragnell 가위 팁을 사용하여 플랩을 근육에서 분리하면서 플랩 주변의 천공 혈관과 피부 신경총 혈관을 소작하면서 원위에서 근위 부분으로 훼손하여 플랩 조달을 계속합니다. 이것은 상복부 혈관을 통해 플랩으로 모든 혈액이 흐르도록 합니다.
   알림: 플랩을 채취할 때 너무 세게 당기거나 피부를 비틀어 플랩 맥관 구조를 손상시키지 않도록 주의해야 합니다. 플랩의 근위 부분에서 작업하는 동안 플랩의 풀린 부분을 외과의의 손의 엄지손가락 위에 조심스럽게 놓는 것이 좋습니다.
7. 플랩이 완전히 채취되면 표재성 하복부 혈관의 가지가 피부의 깊은 측면에서 볼 수 있습니다. 플랩을 부드럽게 위로 들어 올려 혈관을 시각화하여 SIEA의 두 지점 전체를 플랩으로 캡슐화하는 것을 목표로 합니다.
8. 플랩이 수확되면 플랩의 내측과 외측 모두에서 아래쪽 부분의 지방 패드를 분리합니다. 양극성 소작기(재료 표 참조)를 사용하여 절개 부위의 경계에 가까운 지방 패드를 소작하고 표재성 하복부 척추경에 해를 끼치지 않도록 주의하십시오(그림 2).

그림 1 : 동물의 복부에 플랩 그림. 정중선은 상복부 피판 위치를 찾는 마커로 사용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 플랩이 완전히 올라갔습니다. 뚱뚱한 패드는 표재성 하복부 척추경에서 오는 혈관 형성을 보존하기 위해 플랩의 근위 부분에 보존됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

5. 혈관 준비 및 허혈 유도

참고: 플랩은 이 단계에서 완전히 수확되지만 혈관은 아직 허혈성 전처리를 위해 준비되지 않았습니다.

1. 대퇴 혈관 준비 전에 음경 정맥을 통해 17.5IU의 헤파린 나트륨을 단회 투여합니다.
   참고: 이 주사는 귀두를 노출시키고, 비외상성 Adson 겸자를 사용하여 외부에서 음경을 잡고, 음경 정맥을 식별하고, 27G 주사기를 사용하여 음경 정맥을 따라 표면적으로 주사하여 수행됩니다.
2. 더 나은 노출을 만들려면 동물을 Lone Star 자체 고정 견인기 안에 넣으십시오( 재료 표 참조).
   알림: Lone Star 탄성 스테이는 피부를 수술 부위에서 끌어당겨 혈관을 더 잘 볼 수 있도록 합니다. 연구원은 이제 수술용 현미경(40배 배율)으로 작업해야 합니다.
3. 혈관을 노출시키려면 두 개의 #4 미세 수술 겸자를 사용하여 대퇴 혈관을 근위 및 원위부에서 표재성 상복부 혈관의 출현까지 해부합니다. 혈관을 직접 잡지 말고 집게를 사용하여 집게를 혈관에 수직으로 열고 닫아 결합 조직을 층별로 부드럽게 분리하십시오.
4. 원위 대퇴 혈관에서 근막을 청소하고 동맥과 정맥에서 신경을 부드럽게 제거합니다. 8-0 사용 나일론 봉합사( 재료 표 참조)는 동맥과 정맥 아래의 미세 수술 바늘 홀더를 우회하고 봉합사를 잡고 이 혈관을 묶어 원위 대퇴 혈관을 결찰합니다(그림 3). 수술 후 이환율을 최소화하기 위해 신경이 손상되거나 묶여서는 안 됩니다.
   알림: 외과의는 집게 중 하나를 사용하여 한 손으로 신경 측면의 근막을 부드럽게 당기고 다른 한 쌍을 사용하여 신경을 혈관에서 완전히 분리할 수 있습니다.
5. 8-0 사용 봉합사, 상복부 혈관이 출현 한 직후 원위 혈관을 결찰하고 척추 경 기원 후 1mm 거리를 남겨 둡니다. 이렇게 하면 허혈성 단계 동안 깊은 가지에서 SIEA를 통해 역류가 발생하지 않습니다.
   참고: 그림 3 은 SIEA 척추경이 출현한 후 결찰된 원위 대퇴 혈관을 보여줍니다.
6. 근위 대퇴 혈관에서 결합 조직을 청소하는 것과 동일한 과정을 반복하십시오. 그러나 효율적인 클램핑을 위해 동맥과 정맥을 서로 분리하십시오. 이것은 동맥과 정맥 사이에 닫힌 집게를 부드럽게 놓고 혈관의 진행 방향으로 집게를 천천히 열어 달성할 수 있습니다.
7. 간헐적 허혈을 유도하려면 각 근위 대퇴 동맥과 정맥에 미세 수술 클램프를 별도로 배치합니다(그림 4).
8. 허혈성 손상이 완료되면 플랩을 원래 위치로 봉합하고 수술 전에 그려진 표시를 정렬합니다 (4.2.2 단계). 3-0 나일론( 재료 표 참조)이 있는 러닝 봉합사를 사용하여 내측의 사타구니 주름에서 시작하여 플랩 주위의 사타구니 주름에서 측면으로 끝나는 플랩을 봉합합니다.
   알림: 사타구니 주름을 따라 동일한 봉합사를 사용하여 중단된 바늘을 배치할 수 있습니다. 이를 통해 연구원은 플랩 폐쇄에 영향을 주지 않고 이 영역을 열 수 있습니다.
9. 플랩에 혈액 공급을 확인하려면 헤파린 식염수 주사에 대해 설명된 것과 동일한 기술과 도구를 사용하여 0.25mL의 멸균 플루오레세인 나트륨(10%, 재료 표 참조)을 음경 정맥에 주입합니다(5.1단계). 3분 후, 장파 UV-366 nm 램프(fluorescein excitation light)를 비추어 관류된 영역에 해당하는 형광 영역을 드러낸다.
10. 봉합 및 확인 후, 자동 절단을 방지하기 위해 봉합사를 따라 분쇄 된 메트로니다졸 ( 재료 표 참조)을 뿌리고 같은 부위에 액체 붕대를 뿌립니다.
11. 동물이 마취에서 회복되기 전에 Carprofen(2-5mg/kg)을 피하 투여합니다.
12. 연구원들은 이제 플랩의 유일한 공급원인 대퇴골 혈관에 접근하여 며칠 동안 실험적 허혈성 전처리 요법을 연속으로 테스트할 수 있습니다. 수술 당일 2-5mg/kg 용량의 카르프로펜을 피하 주사합니다.
13. 허혈성 전처리 기간이 끝나면 상복부 혈액 공급에서 플랩을 제거하고 플랩의 하부 경계를 따라 지방 패드보다 하위를 소작합니다.

그림 3: 대퇴 혈관의 현미경 보기. 원위 대퇴 혈관이 묶여 있습니다. 신경이 보존되었습니다. 해부 쪽은 오른쪽 사타구니 주름(R)입니다. 배율 : 40x. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 두 개의 개별 미세수술용 클램프를 사용한 근위 대퇴 혈관의 클램핑. 이를 통해 더 나은 클램핑 제어가 가능하여 동맥 및 역행성 정맥 흐름이 없음을 보장합니다. (A)는 모두 좌측(L) 대퇴골관이 고정된 것을 나타낸다. 표재성 하복부 혈관이 보입니다(SIEA/SIEV). (B)는 동물 (R)의 우측 사타구니 주름 상에 클램핑 전의 대퇴 동맥 및 대퇴 정맥을 나타낸다. 배율 : 40x. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

6. 수술 후 관리

1. Carprofen(2-5 mg/kg)을 수술 후 4일 동안 하루에 한 번, 보충 진정 후 한 번 피하 투여합니다.
2. 처음 24 시간 동안 동물을 두 번 관찰하십시오. 그런 다음 연구가 끝날 때까지 하루에 한 번 이상 동물과 플랩을 평가합니다.
   알림: 동물은 밝고 경계심이 많으며 반응이 좋아야 합니다. 전신 기회 감염(예: 혼수 또는 체중 감소)의 징후가 있는 경우 기관은 승인된 프로토콜에 따라 동물을 안락사시켜야 합니다.
3. 초기 괴사(수술 후 5일째 결찰 전[POD5]), 수술 부위 열개, 감염, 혈종, 허혈 및/또는 플랩의 자가포식에 대해 플랩을 모니터링합니다.
4. 수술 부위 열개가 있는 경우 흉터 가장자리를 괴사하고 10% 포비돈 요오드로 해당 부위를 세척한 후 멸균수 또는 멸균 식염수로 완전히 헹구고 중단된 3-0 나일론 봉합사를 사용하여 상처를 봉합합니다.
5. 연구가 끝나면 31% 페노바르비탈 나트륨 용액 0.1-0.2mL를 IV 주사하거나 현지 IACUC에서 권장하는 프로토콜로 동물을 안락사시킵니다. 심장 박동과 호흡 운동이 없어 사망을 확인하십시오.

결과

모든 플랩은 POD5에서 실행 가능했으며 SIEA 단독으로 우수한 혈관 형성을 보여주었습니다. 도 5 는 플루오레세인 IV 주입 전후의 플랩을 보여주며, 완전한 혈관형성을 나타낸다.

그림 5: 즉각적인 정맥 형광 혈관조영술(POD0). ?...

토론

이 기사는 쥐에서 수확한 재현 가능한 피부 근막 피판 모델에 대해 설명하여 IP 평가를 허용합니다. 이 단계별 수술 프로토콜은 연구 그룹에 다양한 IP 요법을 테스트할 수 있는 신뢰할 수 있는 모델을 제공합니다. 척추경 이외의 혈관 형성을 방지함으로써 이 모델을 사용하면 상처 부위와 가장자리에서 플랩의 혈관신생을 연구할 수 있습니다. 이 연구는 이전 연구에서 POD5-7^11,13,16...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Syringe Luer-Lok Tip	BD	309628
3-0 Ethilon 18” Black Monofilament Nylon suture	Ethicon	ETH-663H
8-0 Ethilon 12” Black Monofilament Nylon suture	Ethicon	1716G
Adson Atraumatic Forceps	Aesculap Surgical Instruments	BD51R
Akorn Fluorescein Injection USP 10% Single Dose Vial 5 mL	Akorn	17478025310
Betadine Solution 5% Povidone-Iodine Antiseptic Microbicide	PBS Animal Health	11205
Bipolar Cords	ASSI	ASSI.ATK26426
Buprenorphine Hydrochloride Injection	PAR Pharmaceutical	3003406C	This concentration needs to be diluted for rodents.
Depilatory product – Nair Hair remover lotion	Nair	NC0132811
Ear tag applier	World Precision Instruments	NC0038715
Gauze Sponges	Curity	6939
Isoflurane Auto-Flow Anesthesia Machine	E-Z Systems	EZ-190F
Isoflurane, USP	Patterson Veterinary	1403-704-06
Jewelers Bipolar Forceps Non-Stick 11 cm, straight pointed tip, 0.25 mm tip diameter	ASSI	ASSI.BPNS11223
Lone Star elastic stays	Cooper Surgical	3311-1G
Lone star Self-retaining retractor	Cooper Surgical	3304G
Metronidazole tablets USP	Teva	500111-333-06
Micro spring handle scissors	AROSurgical	11.603.14
Microscope (surgical)	Leica	M525 F40
Microsurgical clamp applying forceps	Ambler Surgical	31-906
Microsurgical clamps (x2)	Millennium Surgical	18-B1V
Microsurgical Dumont #4 forceps	Dumont Swiss made	1708-4TM-PO
Microsurgical needle holder	ASSI	B-14-8
Needle holder	World Precision Instruments	501246
Nosecone for Anesthesia	World Precision Instruments	EZ-112
Pixel analysis software	GNU Image Manipulation Program v2.10	GIMP	GNU Open licence
PrecisionGlide Needle 27 G	BD	305109
Ragnell Scissors	Roboz Surgical	RS-6015
Rimadyl (carprofen)	Zoetis	10000319	This concentration needs to be diluted for rodents
Scientific Elizabethan collar (e-collar) for Rats	Braintree Scientific	NC9263311
Small animal ear tag	National Band & Tag Company	Style 1005-1
Small Animal Heated Operating Table (Adjustable)	Peco Services Ltd	69023
Sterile towel drape	Dynarex Corporation	4410
Sterile water for injection and irrigation	Hospira	0409488724-1
Surgical scrub – BD ChloraPrep Hi-Lite Orange 3 mL applicator with Sterile Solution	BD	930415
UV lamp	UVP	UVL-56
Webcol Alcohol prep pads	Simply Medical	5110