Поверхностный осевой лоскут нижней эпигастральной артерии для изучения эффектов ишемического прекондиционирования на крысиной модели

Резюме

Этот протокол описывает сбор, наложение швов и мониторинг кожно-фасциальных лоскутов у крыс, которые позволяют хорошо визуализировать и манипулировать кровотоком через поверхностные нижние эпигастральные сосуды посредством пережатия и лигирования бедренных сосудов. Это имеет решающее значение для исследований, связанных с ишемическим прекондиционированием.

Аннотация

Фасциокожные лоскуты (ФКЗ) стали золотым стандартом комплексной реконструкции дефектов в пластической и реконструктивной хирургии. Этот метод сохранения мышц позволяет переносить васкуляризированные ткани для покрытия любого крупного дефекта. FCF можно использовать в виде лоскутов на ножках или в виде свободных лоскутов; однако в литературе частота неудач для педикулярного FCF и свободного FCF превышает 5%, оставляя возможности для улучшения этих методов и дальнейшего расширения знаний в этой области. Ишемическое прекондиционирование (ВП) широко изучено, но механизмы и оптимизация режима ВП еще предстоит определить. Это явление действительно мало изучено в пластической и реконструктивной хирургии. Здесь представлена хирургическая модель для изучения режима внутримышечного введения в модели осевого фасциокожного лоскута крысы, описывающая, как безопасно и надежно оценить влияние внутримышечного вмешательства на выживаемость лоскута. В этой статье описывается вся хирургическая процедура, включая предложения по повышению надежности этой модели. Цель состоит в том, чтобы предоставить исследователям воспроизводимую и надежную модель для тестирования различных схем ишемического прекондиционирования и оценки их влияния на выживаемость лоскута.

Введение

Пластическая и реконструктивная хирургия постоянно развивается. Развитие мышечных, кожно-фасциологических и перфораторных лоскутов позволило проводить более качественные реконструкции при одновременном снижении заболеваемости. Сочетая эти улучшенные анатомические знания с улучшенными техническими навыками, реконструктивные хирурги могут выполнять свободные переносы лоскута, когда дефекты не близки к какому-либо локальному решению. Однако, несмотря на то, что перфораторная лоскутная хирургия в настоящее время является наиболее передовой техникой в реконструктивной хирургии, в литературе сообщается о 5% неудачах при переносе свободного лоскута ^1,2,3 и до 20% при реконструкции лоскута на ножке 4,5,6. Частичное или полное разрушение лоскута происходит, когда ножка лоскута скомпрометирована, поэтому важно постоянно искать улучшения в существующих методах. Одним из методов улучшения приживаемости лоскута является содействие его неоваскуляризации на раневом ложе, что позволяет перфузию от источника, отличного от ножки. Ишемическое прекондиционирование (ИП) было первоначально описано на модели^{сердца 7}, демонстрируя, что орган, подвергшийся контролируемой ишемии, выживает в более высокой степени после потери первичного кровоснабжения в результате неоваскуляризации, вызванной ишемией. Несколько авторов изучили этот краеугольный принцип для оптимизации выживаемости лоскутов в доклинических и клинических моделях ^8,9,10.

Преимуществом этого метода перед другими методами улучшения выживаемости лоскута является простота его реализации, состоящая из зажимных/деламповых тестов источника крови. В модели крысы предыдущие авторы использовали лоскут поверхностной нижней эпигастральной артерии (SIEA) для изучения I.P. путем зажима главной ножки^11,12,13. Тем не менее, с этой моделью можно столкнуться с несколькими техническими проблемами, и в литературе отсутствуют хорошо описанные протоколы.

Таким образом, эта работа направлена на то, чтобы предоставить исследователям подробное описание метода получения лоскута SIEA крысы с расширенным рассечением бедренных сосудов, чтобы позволить проводить внутримышечные исследования на модели осевого фасциокожного лоскута. Эта модель сохраняет целостность эпигастральных сосудов и вместо этого манипулирует бедренными сосудами, которые более устойчивы. Мы делимся своим опытом и инструментами для улучшения изучения этого явления и повышения воспроизводимости этой процедуры.

протокол

Комитет по уходу за животными и их использованию Массачусетской больницы общего профиля одобрил экспериментальный протокол (протокол IACUC #2022N000099). Авторы следовали контрольному списку рекомендаций COME (Animal Research: Reporting In Vivo Experiments) для этой работы. Все животные получали гуманный уход в соответствии с Руководством Национального института здравоохранения по уходу и использованию лабораторных животных. Всего для всех экспериментов использовали 12 самцов крыс Льюиса (250-350 г, возраст 8-10 недель).

1. Подготовка животных

ПРИМЕЧАНИЕ: Крысы имеют высокую скорость метаболизма и ограниченные запасы жира; Поэтому не делайте их быстро перед операцией и никогда не ограничивайте воду перед операцией.

1. Для всех процедур успокаивайте животное с помощью 3%-5% изофлурана в камере прецизионного испарителя изофлурана (см. Таблицу материалов). Когда животное хорошо успокоено, понизьте дозу изофлурана до 1-3% через носовой конус.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Второй исследователь должен постоянно контролировать частоту дыхания и адаптировать дозу изофлурана.
2. За 2 дня до первоначальной операции наденьте на животное пластиковый электронный ошейник (размером с крысу; см. Таблицу материалов) и используйте нейлоновый шов 3-0, чтобы закрепить электронный ошейник на дорсальной и брюшной сторонах шеи животного. Подождите 2 дня для акклиматизации к этому электронному ошейнику; Он должен плотно прилегать, но не загораживать дыхательные пути животного.

2. Предоперационный уход

1. В день первоначальной операции побрейте нижнюю переднюю часть живота, очистив область от боковой части животного до небольшого расстояния за среднюю линию.
2. Затем используйте средство для депиляции (крем для удаления волос; см. Таблицу материалов), чтобы удалить все оставшиеся волосы в этой области (нижняя передняя часть живота, как описано на предыдущем шаге).
3. Тщательно вымойте и высушите область хирургическим скрабом и раствором бетадина (10% повидон-йод).
4. Вводят 0,05 мг/кг бупренорфина подкожно.

3. Интраоперационный мониторинг

1. Убедитесь, что животное остается на 1-3% изофлурана с помощью прецизионного испарителя и носового конуса на протяжении всей операции. Контролируйте частоту дыхания, дыхания и уровень насыщения кислородом животного с помощью визуального наблюдения и пульсоксиметра грызунов, сделанного для крысы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Типичная частота дыхания составляет 80-90 циклов в минуту^14,15. Любая реакция, указывающая на сознание, наблюдаемая во время операции, требует увеличения скорости изофлурана.
2. Поместите животное на грелку на всю операцию, так как температура тела грызунов быстро охлаждается под наркозом.

4. Забор эпигастрального лоскута

1. Поместите животное в положение лежа на спине. Побрейте живот снизу паховой складки до уровня мечевидного отростка.
2. Используя ручку из стерильной кожи и линейку, сначала отметьте среднюю линию живота животного, а затем паховую складку. Разрез вдоль линии паховой складки обнажает нижние эпигастральные сосуды, ответвляющиеся от бедренных сосудов.
   1. Перед разрезом нарисуйте будущий лоскут в виде овала или прямоугольника до 6 см по вертикали и 3 см по горизонтали, вытягиваясь краниально от паховой складки.
   2. Нарисуйте пять или шесть равноудаленных отметок, перпендикулярных границам закрылка. Они служат направляющими для лучшего выравнивания кожи после того, как лоскут был поднят и сшит обратно на место (рис. 1).
3. С помощью ножниц Рагнелля (см. Таблицу материалов) сделайте продольный разрез 3-4 см на паховой складке.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Исследователи должны соблюдать осторожность и тянуть кожу вверх, чтобы не повредить сосуды.
4. Обнажите и идентифицируйте бедренные и эпигастральные сосуды с помощью микрохирургических щипцов #4 jewelers (см. Таблицу материалов), открывая и закрывая щипцы, чтобы отделить фасцию и получить доступ к сосудам, которые находятся под паховым жировым пакетом.
5. Используйте паховый разрез, чтобы начать разрез лоскута с помощью ножниц Рагнелла. Обратите внимание на подрыв всей толщины кожи и соединительной ткани над мышцами живота.
   1. Чтобы облегчить сбор лоскутов, убедитесь, что ножницы следуют правильной плоскости рассечения, подталкивая к мышце и раздвигая лезвия ножниц. Выполните этот подрыв закрылка, двигаясь в скоординированном направлении вокруг чертежа закрылка.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы определить правильную плоскость, ниже плоскости рассечения не должно оставаться микрососудов.
6. По мере того, как начальный кончик лоскута освобождается от окружающей кожи, продолжайте захват лоскута, подрывая его от дистального отдела к проксимальному отделу, используя кончики ножниц Рагнелла, чтобы отделить лоскут от мышцы, прижигая любые перфораторные сосуды и сосуды дермального сплетения вокруг лоскута. Это обеспечивает приток всей крови к лоскуту через эпигастральные сосуды.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо обратить внимание на то, чтобы не повредить сосудистую сеть лоскута, слишком сильно потянув или скрутив кожу во время сбора лоскута. Рекомендуется осторожно поместить освобожденную часть лоскута на большой палец руки хирурга, работая над проксимальной частью лоскута.
7. После того, как лоскут полностью собран, ветви поверхностных нижних эпигастральных сосудов видны на глубокой стороне кожи. Стремитесь инкапсулировать все обе ветви SIEA с помощью лоскута, осторожно поднимая клапан вверх, чтобы визуализировать сосуды.
8. После того, как лоскут собран, отделите жировые подушечки на нижней стороне как на медиальной, так и на латеральной сторонах лоскута. Используйте биполярное прижигание (см. Таблицу материалов), чтобы прижечь жировые подушечки близко к границе разреза, обращая при этом внимание на то, чтобы не повредить поверхностную нижнюю эпигастральную ножку (рис. 2).

Рисунок 1: Рисунок лоскута на животе животного. Средняя линия используется в качестве маркера для определения местоположения эпигастрального лоскута. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Закрылок полностью приподнят. Жировая подушка сохраняется в проксимальной части лоскута, чтобы сохранить васкуляризацию, идущую из поверхностной нижней эпигастральной ножки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

5. Препарирование сосудов и индукция ишемии

ПРИМЕЧАНИЕ: Лоскут полностью собран на этом этапе, но сосуды еще не подготовлены к ишемическому предварительному кондиционированию.

1. Перед подготовкой бедренного сосуда введите однократную дозу 17,5 МЕ гепарина натрия через вену полового члена.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эта инъекция выполняется путем обнажения головки полового члена, удержания полового члена снаружи с помощью атравматических щипцов Adson, идентификации вены полового члена и введения поверхностно и вдоль вены полового члена с помощью шприца 27 г.
2. Чтобы создать лучшую экспозицию, поместите животное в самоудерживающийся ретрактор Lone Star (см. Таблицу материалов).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эластичные стойки Lone Star оттягивают кожу от места операции, обеспечивая лучший обзор сосудов. Теперь исследователь должен работать под хирургическим микроскопом (40-кратное увеличение).
3. Чтобы обнажить сосуды, используйте два микрохирургических щипца #4, чтобы рассечь бедренные сосуды как проксимально, так и дистально до появления поверхностных эпигастральных сосудов. Не держите сосуды напрямую, а вместо этого используйте щипцы, чтобы аккуратно отделить соединительную ткань слой за слоем, открывая и закрывая щипцы вертикально по отношению к сосудам.
4. На дистальных бедренных сосудах очистите фасцию и аккуратно освободите нерв от артерии и вены. Использование 8-0 нейлоновый шов (см. Таблицу материалов), перевязать дистальные бедренные сосуды, обойдя микрохирургический иглодержатель под артерией и веной, обхватив шов и перевязав эти сосуды (рис. 3). Нерв не должен быть поврежден или перевязан, чтобы свести к минимуму послеоперационную заболеваемость.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Хирурги могут использовать один из щипцов, чтобы аккуратно потянуть фасцию латерально к нерву одной рукой, и использовать другую пару, чтобы полностью отделить нерв от сосудов.
5. Использование 8-0 Шов, перевязка дистальных сосудов сразу после появления эпигастральных сосудов, оставляя расстояние в 1 мм после начала ножки. Это гарантирует, что обратный поток не проходит через SIEA из глубоких ветвей во время ишемических фаз.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 3 показаны перевязанные дистальные сосуды бедренной кости после появления ножки SIEA.
6. На проксимальном отделе бедренных сосудов повторите тот же процесс очистки соединительной ткани. Тем не менее, отделите артерию и вену друг от друга, чтобы обеспечить эффективное пережатие. Этого можно достичь, осторожно поместив закрытые щипцы между артерией и веной и медленно открыв щипцы в направлении движения сосудов.
7. Чтобы вызвать перемежающуюся ишемию, установите микрохирургические зажимы отдельно на каждую проксимальную бедренную артерию и вену (рис. 4).
8. Когда ишемические повреждения будут завершены, зашите лоскут в исходное положение, выровняв отметины, нарисованные до операции (шаг 4.2.2). Зашить лоскут с помощью бегового шва из нейлона 3-0 (см. Таблицу материалов), начиная с паховой складки медиально, вокруг лоскута и заканчивая паховой складкой сбоку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Вдоль паховой складки тот же шов можно использовать для наложения прерывистых швов. Это позволяет исследователям открывать эту область, не влияя на закрытие клапана.
9. Чтобы проверить кровоснабжение лоскута, введите 0,25 мл стерильного флуоресцеина натрия (10%, см. Таблицу материалов) в вену полового члена, используя ту же технику и инструменты, которые описаны для инъекции физиологического раствора гепарина (этап 5.1). Через 3 минуты посветите длинноволновой лампой УФ-366 нм (флуоресцеиновый возбуждающий свет), чтобы выявить флуоресцентные области, соответствующие перфузируемым участкам.
10. После закрытия и проверки распределите измельченный метронидазол (см. Таблицу материалов) вдоль швов, чтобы предотвратить аутоувечье, и распылите жидкую повязку на ту же область.
11. До того, как животное оправится от анестезии, введите карпрофен (2-5 мг/кг) подкожно.
12. Теперь исследователи могут получить доступ к бедренным сосудам, единственному источнику питания лоскута, чтобы протестировать экспериментальные схемы ишемического предварительного кондиционирования в течение нескольких дней подряд. В каждый день операции вводите 2-5 мг / кг карпрофена подкожно.
13. В конце периода ишемического прекондиционирования, чтобы удалить лоскут из эпигастрального кровоснабжения, прижигают нижнюю жировую подушку вдоль нижней границы лоскута.

Рисунок 3: Микроскопический вид бедренных сосудов. Дистальные бедренные сосуды перевязываются. Нерв сохранился. Сторона рассечения представляет собой правую паховую складку (R). Увеличение: 40x. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Зажим проксимальных бедренных сосудов с помощью двух отдельных микрохирургических зажимов. Это позволяет лучше контролировать зажим, обеспечивая отсутствие артериального и ретроградного венозного кровотока. (А) показывает зажатые оба левых (L) бедренных сосуда. Видны поверхностные нижние эпигастральные сосуды (SIEA/SIEV). (B) показывает зажатую бедренную артерию и бедренную вену до пережатия на правой паховой складке животного (R). Увеличение: 40x. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

6. Послеоперационный уход

1. Вводите карпрофен (2-5 мг / кг) подкожно один раз в день в течение 4 дней после операции и один раз после любых дополнительных седативных препаратов.
2. В течение первых 24 часов наблюдайте за животным дважды. Затем оценивайте животное и лоскут не реже одного раза в день до конца исследования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Животное должно быть ярким, бдительным и реактивным. Если есть признаки системных оппортунистических инфекций (например, летаргия или потеря веса), животное должно быть усыплено в соответствии с утвержденными учреждениями протоколами.
3. Контролируйте лоскут на предмет раннего некроза (до лигирования на 5-й день послеоперационного периода [POD5]), расхождения в месте операции, инфекции, гематомы, ишемии и/или аутофагии лоскута.
4. Если есть расхождение в месте операции, удалите края рубца, очистите место 10% повидон-йодом, прежде чем тщательно промыть стерильной водой или стерильным физиологическим раствором и закройте рану прерывистыми нейлоновыми швами 3-0.
5. По окончании исследования усыпьте животное внутривенной инъекцией 0,1-0,2 мл 31% раствора фенобарбитала натрия или протоколом, рекомендованным местным IACUC. Подтверждают смерть по отсутствию сердцебиения и дыхательных движений.

Результаты

Все лоскуты были жизнеспособными на POD5, демонстрируя хорошую васкуляризацию только SIEA. На рисунке 5 показан лоскут до и после внутривенной инъекции флуоресцеина, демонстрирующий полную васкуляризацию.

Обсуждение

В этой статье описывается воспроизводимая модель фасциокожного лоскута, собранная у крыс, что позволяет оценить IP. Этот пошаговый хирургический протокол дает исследовательским группам надежную модель для тестирования различных схем внутримышечного введения. Предотвращая любую васк...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Syringe Luer-Lok Tip	BD	309628
3-0 Ethilon 18” Black Monofilament Nylon suture	Ethicon	ETH-663H
8-0 Ethilon 12” Black Monofilament Nylon suture	Ethicon	1716G
Adson Atraumatic Forceps	Aesculap Surgical Instruments	BD51R
Akorn Fluorescein Injection USP 10% Single Dose Vial 5 mL	Akorn	17478025310
Betadine Solution 5% Povidone-Iodine Antiseptic Microbicide	PBS Animal Health	11205
Bipolar Cords	ASSI	ASSI.ATK26426
Buprenorphine Hydrochloride Injection	PAR Pharmaceutical	3003406C	This concentration needs to be diluted for rodents.
Depilatory product – Nair Hair remover lotion	Nair	NC0132811
Ear tag applier	World Precision Instruments	NC0038715
Gauze Sponges	Curity	6939
Isoflurane Auto-Flow Anesthesia Machine	E-Z Systems	EZ-190F
Isoflurane, USP	Patterson Veterinary	1403-704-06
Jewelers Bipolar Forceps Non-Stick 11 cm, straight pointed tip, 0.25 mm tip diameter	ASSI	ASSI.BPNS11223
Lone Star elastic stays	Cooper Surgical	3311-1G
Lone star Self-retaining retractor	Cooper Surgical	3304G
Metronidazole tablets USP	Teva	500111-333-06
Micro spring handle scissors	AROSurgical	11.603.14
Microscope (surgical)	Leica	M525 F40
Microsurgical clamp applying forceps	Ambler Surgical	31-906
Microsurgical clamps (x2)	Millennium Surgical	18-B1V
Microsurgical Dumont #4 forceps	Dumont Swiss made	1708-4TM-PO
Microsurgical needle holder	ASSI	B-14-8
Needle holder	World Precision Instruments	501246
Nosecone for Anesthesia	World Precision Instruments	EZ-112
Pixel analysis software	GNU Image Manipulation Program v2.10	GIMP	GNU Open licence
PrecisionGlide Needle 27 G	BD	305109
Ragnell Scissors	Roboz Surgical	RS-6015
Rimadyl (carprofen)	Zoetis	10000319	This concentration needs to be diluted for rodents
Scientific Elizabethan collar (e-collar) for Rats	Braintree Scientific	NC9263311
Small animal ear tag	National Band & Tag Company	Style 1005-1
Small Animal Heated Operating Table (Adjustable)	Peco Services Ltd	69023
Sterile towel drape	Dynarex Corporation	4410
Sterile water for injection and irrigation	Hospira	0409488724-1
Surgical scrub – BD ChloraPrep Hi-Lite Orange 3 mL applicator with Sterile Solution	BD	930415
UV lamp	UVP	UVL-56
Webcol Alcohol prep pads	Simply Medical	5110