Metodologia para Inativação Metabolicamente de Bactérias para Pesquisa de Caenorhabditis elegans

Resumo

A fonte de alimento para Caenorhabditis elegans no laboratório é Escherichia coli viva. Como as bactérias são metabolicamente ativas, elas apresentam uma variável de confusão em estudos metabólicos e de drogas em C. elegans. Um protocolo detalhado para inativar metabolicamente bactérias usando paraformaldeído é descrito aqui.

Resumo

Caenorhabditis elegans é um organismo modelo comum para pesquisa em genética, desenvolvimento, envelhecimento, metabolismo e comportamento. Como C. elegans consomem uma dieta de bactérias vivas, a atividade metabólica de sua fonte alimentar pode confundir experimentos que procuram os efeitos diretos de várias intervenções sobre o verme. Para evitar os efeitos de confusão do metabolismo bacteriano, os pesquisadores de C. elegans usaram vários métodos para inativar metabolicamente as bactérias, incluindo irradiação ultravioleta (UV), morte por calor e antibióticos. O tratamento UV é relativamente baixo rendimento e não pode ser usado em cultura líquida porque cada placa deve ser examinada para matar bactérias com sucesso. Um segundo método de tratamento, o termo-matança, afeta negativamente a textura e a qualidade nutricional das bactérias, levando à parada do desenvolvimento de C. elegans. Finalmente, o tratamento com antibióticos pode alterar diretamente a fisiologia de C. elegans , além de prevenir o crescimento bacteriano. Este manuscrito descreve um método alternativo para inativar metabolicamente bactérias usando paraformaldeído (PFA). O tratamento com PFA faz ligações cruzadas de proteínas dentro das células bacterianas para prevenir a atividade metabólica, preservando a estrutura celular e o conteúdo nutricional. Este método é de alto rendimento e pode ser usado em cultura líquida ou placas sólidas, pois o teste de uma placa de bactérias tratadas com PFA para crescimento valida todo o lote. A inativação metabólica através do tratamento com PFA pode ser usada para eliminar os efeitos de confusão do metabolismo bacteriano em estudos de suplementação de drogas ou metabólitos, resistência ao estresse, metabolômica e comportamento em C. elegans.

Introdução

Caenorhabditis elegans foi originalmente proposto como organismo modelo em 1965¹ e desde então tem sido amplamente adotado em estudos de genética, desenvolvimento, comportamento, envelhecimento e metabolismo². Devido ao seu grande tamanho de ninhada e cutícula transparente, C. elegans é particularmente adequada para triagem de alto rendimento com repórteres fluorescentes³. Seu curto ciclo de vida, reprodução hermafrodita e homologia genética com humanos também fazem de C. elegans um valioso sistema modelo para estudos sobre o desenvolvimento⁴ e biologia do envelhecimento⁵. Além disso, C. elegans são relativamente fáceis de manter. Os vermes podem ser cultivados em cultura líquida ou em placas sólidas de ágar e consumir uma dieta de bactérias vivas de Escherichia coli OP50⁴.

No entanto, a fonte de alimento vivo de C. elegans pode confundir estudos de metabolismo, suplementação de drogas e comportamento. Como as bactérias vivas têm seu próprio metabolismo, as condições experimentais que afetam as bactérias também alteram os nutrientes e metabólitos disponíveis para os vermes. Por exemplo, diferenças nas concentrações bacterianas de ferro, aminoácidos e folato têm diversos efeitos sobre o desenvolvimento, fisiologia e vida útil de C. elegans ⁶. Muitas práticas comuns de laboratório podem provocar tais mudanças na composição de nutrientes e metabólitos produzidos pelo OP50. Especificamente, a exposição à 5-fluor-2'-desoxiuridina (FUdR), um composto comumente usado para prevenir a reprodução em C. elegans, provoca amplas alterações na expressão gênica do gene OP50, incluindo vias de biossíntese de aminoácidos⁷. Bactérias vivas também podem confundir estudos em que C. elegans são suplementados com pequenas moléculas porque as bactérias podem metabolizar parcial ou completamente os compostos ativos. Além disso, os efeitos dessas pequenas moléculas sobre as bactérias podem, por sua vez, alterar a fisiologia de C. elegans, como foi relatado com o fármaco que prolonga a vida útil da metformina⁸. Finalmente, bactérias vivas podem alterar o ambiente do verme de maneiras que alteram o comportamento, como secretar odorantes atraentes⁹, produzir neuromoduladores exógenos¹⁰ e criar gradientes de oxigênio em um gramado bacteriano denso¹¹.

Para atenuar os efeitos de confusão do metabolismo bacteriano na pesquisa de C. elegans , vários métodos para matar bactérias foram desenvolvidos (Tabela 1). Três estratégias comuns para matar OP50 são irradiação UV, morte por calor e tratamento com antibióticos. Embora simples e relativamente de baixo custo, cada um desses métodos pode ter efeitos indesejáveis sobre bactérias e C. elegans. A eliminação por UV através de um reticulador UV¹² é de baixo rendimento e a taxa é limitada pelo número de placas que podem caber no reticulante UV. Além disso, a eficácia da eliminação por UV pode variar de placa para placa dentro de um lote, e o teste de crescimento em todas as placas pode se tornar difícil em grandes experimentos. Matar o calor OP50 expondo a cultura a temperaturas de >60 °C vem com um conjunto separado de desafios. O calor elevado pode danificar nutrientes essenciais para o verme e destruir a estrutura celular das bactérias, criando uma textura mais macia que diminui a quantidade de tempo que os vermes passam no alimento¹³. Este método também não pode ser usado durante todo o ciclo de vida de C. elegans , pois vermes alimentados com bactérias mortas pelo calor podem parar no início do desenvolvimento¹³. O tratamento com antibióticos é um terceiro método comum para suprimir o metabolismo bacteriano¹⁴, mas os antibióticos também podem alterar o crescimento e o metabolismo do verme¹⁵.

Uma solução para eliminar os efeitos metabólicos de bactérias vivas, preservando a estrutura bacteriana e nutrientes essenciais, é matar a OP50 com paraformaldeído (PFA)¹⁶. O PFA é um polímero de formaldeído que pode fazer ligações cruzadas entre proteínas dentro das células¹⁷ para impedir a replicação bacteriana sem destruir estruturas celulares internas, como a membrana plasmática interna¹⁸. Devido a essa preservação da estrutura celular interna, as bactérias tratadas com PFA não exibem crescimento ou atividade metabólica, mas permanecem como fonte alimentar comestível e rica em nutrientes para C. elegans¹⁶. Aqui, um protocolo detalhado é fornecido que mostra como inativar metabolicamente bactérias usando paraformaldeído.

Método	Materiais necessários	Escalonável?		Nutricional?	Efeitos sobre o verme?
UV	Reticulante UV	Limitado por:		Sim	Efeitos variáveis na vida útil de NGM12, 23, 24
		Número de placas que se encaixam no reticulante UV			Efeitos variáveis na vida útil do FUdR24, 26, 27
		Tempo de irradiação por placa			Diminuição da preferência alimentar16
		Capacidade de verificar o crescimento de cada placa8
Calor	Incubadora >60 °C	Sim		Não: destrói a parede celular, diminuição do valor nutricional	Prisão preventiva 13
					Diminuição da preferência alimentar13
					Prolonga a vida útil no NGM31
Antibióticos	Antibióticos (canamicina, carbenicilina, etc.)	Sim		Sim	Atrasa o crescimento e o desenvolvimento15
					Prolonga a vida útil em meios líquidos19
					Prolonga a vida útil no NGM15
PFA	0,5% Paraformaldeído	Sim		Sim	Diminuição do tamanho da ninhadapequena 16
					Aumento do tempo de desenvolvimentopequeno 16
					Diminuição da preferência alimentar16

Tabela 1. Comparações de métodos para matar OP50. UV-killing, heat-killing, antibiotico-treatment, e PFA-treatment têm efeitos variados sobre o estado nutricional das bactérias e a saúde dos vermes alimentados com bactérias tratadas. Esses métodos para inativar replicativamente E. coli também diferem em seus materiais necessários e escalabilidade.

Protocolo

1. Inoculação de bactérias

1. Preparar o caldo Luria (LB) dissolvendo 10 g de triptona, 5 g de extrato de levedura e 10 g de cloreto de sódio (NaCl) em 950 mL de água destilada.
2. Ajustar o pH do LB para 7,0 adicionando hidróxido de sódio (NaOH) 5M. Isso deve exigir apenas cerca de 0,2 mL de NaOH.
3. Autoclave o meio LB ajustado ao pH em um ciclo líquido por 45 min a 15 psi. Deixe a solução arrefecer e armazenar à temperatura ambiente.
4. Inocular uma única colônia de bactérias em 100 mL de LB em um frasco de Erlenmeyer de 500 mL. Cultivar as bactérias durante a noite em uma incubadora de agitação a 37 °C.
5. Dependendo da saúde da colônia bacteriana, do tamanho do frasco e da velocidade com que o agitador está configurado, o tempo que leva para a bactéria crescer pode variar. Após ~14 h, verifique a densidade óptica (OD) das bactérias a 600 nm (OD₆₀₀).
6. Remova as bactérias do agitador quando o OD₆₀₀ for 3,0 (1 x 10⁹ unidades formadoras de colônias (UFC)/mL). Se o OD₆₀₀ for inferior a 3,0, devolva o balão à incubadora do agitador até que o OD desejado seja atingido.
7. Aliquot as bactérias em tubos cônicos de 50 mL e armazenar a 4 °C ou prosseguir para a próxima etapa.

2. Trabalhando com paraformaldeído

NOTA: A concentração de paraformaldeído (PFA) utilizada e a duração da exposição podem variar um pouco dependendo do clima, localização e tipo de bactéria a ser tratada. Um bom ponto de partida para OP50 é a exposição a PFA 0,5% por 1 h, enquanto PFA 0,25% por 1 h pode ser suficiente para HT115.

1. Prepare 32% de estoque de PFA ou use solução de PFA de 32% comprada comercialmente. Use equipamentos de proteção individual (EPIs) adequados ao trabalhar com PFA. Use luvas e proteção ocular.
2. Adicione PFA dentro de um exaustor de fumaça química com ventilação adequada. Descarte as lavagens e pontas de PFA contendo em recipientes apropriados para riscos químicos no exaustor.

3. Tratamento bacteriano com paraformaldeído

1. Quando as bactérias atingirem um OD₆₀₀ de 3,0, utilizar uma pipeta sorológica para transferir 50 mL para um novo frasco de Erlenmeyer de 250 mL. Guarde o resto para um controle ao vivo, um controle simulado (consulte a etapa 4) ou para tratar também com PFA, conforme necessário.
2. Evite derramar de um frasco para outro e tenha cuidado para não salpicar as laterais do novo frasco com bactérias. As colónias do lado do frasco podem receber uma dose mais baixa de PFA.
3. Na capa química, adicionar 781 μL de PFA 32% a 50 mL de bactérias para elevar a concentração final a 0,5%. Descarte a ponta utilizada em recipiente para resíduos sólidos de risco químico.
4. Cobrir o balão com papel alumínio e regressar à incubadora de agitação a 37 °C durante 1 h. Após 1 h, retirar o balão da incubadora e prosseguir para o passo 5.

4. Controle simulado

1. Quando as bactérias atingirem um OD₆₀₀ de 3,0, use uma pipeta sorológica para transferir 50 mL da bactéria para um tubo cônico de 50 mL.
2. Prossiga para o passo 5.3 para concluir os passos de lavagem semelhantes ao grupo tratado com PFA.

5. Lavar as bactérias para remover PFA residual

1. Na capa química, utilizar uma pipeta sorológica para transferir as bactérias tratadas do frasco de Erlenmeyer para um tubo cônico de 50 mL. O uso de uma pipeta sorológica em vez de derramar as bactérias evitará a contaminação de quaisquer colônias bacterianas na borda do frasco que possam ter evitado o tratamento direto com PFA.
2. Centrifuga tratou bactérias a aproximadamente 3000 x g por 20 min. Remova o sobrenadante descartando-o em um recipiente de risco químico de resíduos líquidos na coifa química.
3. Adicione 25 mL de LB e vórtice para ressuspender o pellet bacteriano (Encher o tubo totalmente dificulta a ressuspensão do pellet). Repita a centrifugação e a ressuspensão do pellet 4x.
4. Ressuspenda o pellet em volumes ideais para diferentes ensaios. Para os ensaios de vida útil, sementes de placas de 60 mm com 200 μL de bactérias ressuspendidas em 10 mL de LB. A ressuspensão das bactérias em 10 mL de LB resulta em uma concentração de 5x da cultura original de 50 mL.
5. Conservar as bactérias a 4 °C.

6. Verificação da qualidade do crescimento bacteriano

1. Após a lavagem final e ressuspensão, passe uma placa LB (usando uma ponta de pipeta estéril) com as bactérias preparadas. É uma boa prática riscar o LB usado para lavar e ressuspender em uma placa separada, bem como certificar-se de que o LB usado não foi contaminado.
2. Coloque as placas em uma incubadora de 37 °C durante a noite. Verifique se há algum crescimento. As bactérias são consideradas replicativamente mortas quando as colônias não crescem na placa LB.

7. Verificação de qualidade do metabolismo bacteriano usando um respirômetro

1. Após a lavagem final e ressuspensão do passo 5.4, confirmar se as bactérias estão metabolicamente mortas usando ferramentas disponíveis, como respirômetros^19,20 e medindo a taxa basal de consumo de oxigênio (OCR).
2. Preparar solução M9: Dissolver 3 g de fosfato de potássio monobásico (KH 2 PO 4), 6 g de fosfato de sódio dibásico (Na₂HPO₄) e 5 g de cloreto de sódio (NaCl) em 950 ml de água destilada. Autoclave em ciclo líquido por 45 min a 15 psi e, em seguida, deixe a solução esfriar até a temperatura ambiente. Adicionar 1 mL de sulfato de magnésio 1 M (MgSO₄) e armazenar à temperatura ambiente.
3. Hidratar o cartucho do respirômetro: Adicione 200 μL de calibrador a todos os poços de uma placa de 96 poços. Coloque o cartucho na placa de 96 poços e incube durante a noite em uma incubadora de 37 °C.
4. Calibração do ensaio: No dia seguinte, coloque o cartucho hidratado na máquina e inicie a calibração.
5. Configuração da placa de teste de ensaio: Usando uma nova placa de 96 poços, adicione 160 μL de M9 e 40 μL das bactérias preparadas (1 x 10⁹ UFC/mL) para testar poços. Adicione 200 μL de M9 aos 4 poços de canto para usar como poços em branco. Adicionar 160 μL de M9 e 40 μL de LB utilizados para lavagem e ressuspensão para utilização como controlos negativos. Adicionar 200 μL de M9 ao restante dos poços que não serão utilizados.
6. Execute o ensaio: Quando a calibração do cartucho estiver concluída, insira a placa de ensaio da etapa 7.5 na máquina para análise. As configurações incluem etapas para misturar, esperar, medir e fazer loop. Os resultados serão apresentados como taxa de consumo de oxigênio (OCR). As bactérias estão metabolicamente mortas e prontas para uso quando o OCR é zero.

Gráfico 1. Fluxo de trabalho para tratamento com paraformaldeído. Uma única colônia de bactérias E. coli OP50 é cultivada durante a noite. PFA é adicionado a uma concentração final de 0,5%, e a cultura tratada com PFA é agitada por 1 h a 37 °C. Finalmente, o PFA é removido lavando a cultura com LB fresco 5x. Para confirmar que as bactérias tratadas são replicativamente inativas, retire uma placa LB das bactérias tratadas e cresça durante a noite. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Resultados

Um fluxo de trabalho detalhado do protocolo é mostrado na Figura 1. Um método de alto rendimento foi desenvolvido e otimizado para inativar consistentemente a replicação bacteriana (Figura 2A) e o metabolismo (Figura 2B) para estudos metabólicos e de drogas em pesquisas de C. elegans usando paraformaldeído¹⁶. O objetivo era determinar a menor concentração de PFA necessária e o menor tempo ne...

Discussão

Benefícios da morte por PFA em relação a outros métodos de eliminação bacteriana
O tratamento com PFA é um método de alto rendimento para prevenir o metabolismo bacteriano, mantendo uma fonte de alimento nutritivo para C. elegans. Matar bactérias através do tratamento com PFA tem múltiplas vantagens sobre outros métodos. Ao contrário do tratamento UV, onde cada placa deve ser testada para matar com sucesso, uma única placa de um lote de bactérias tratadas com PFA pode ser testa...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aluminum Foil	Staples	2549291
Bunsen burner	VWR	470121-700
Cell Density Meter	Denville	80-3000-45
Centrifuge	Eppendorg	5430
Chemical fume hood	Labcono	975050411384RG
Conincal tubes (50 mL)	Fisher	339652
Cuvettes	Fisher	14-955-127
E. coli OP50	CGC	OP50
Erlenmyer flasks	Fisher	250 mL: FB501250 500 mL: FB501500 1000 mL: FB5011000
Inoculation loop	Fisher	22-363-605
LB Agar	Fisher	BP1425500
Liquid waste collection bottle	Thomas Scientific	1230G50
Magnesium Sulfate (MgSO4)	Sigma	M7506
Paraformaldehyde (32%)	Electron Microscopy Sciences	15714-S	Paraformaldehyde – methanol free solution
Pipettor	Eppendorf	Eppendorf Easypet 3
Plastic dishes (100 mm)	Fisher	FB0875712
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4)	Fisher	P2853
Seahorse XF Calibrant	Agilent	100840-000
Seahorse XFe96 Extracellular Flux Assay Kit and Cell Culture Microplate	Agilent	101085-004
Serological pipettes (50 mL)	Genesee Scientific	12-107
Shaker incubator	Thermo	11 676 083
Sodium Chloride (NaCl)	Fisher	S640-3
Sodium Hydroxide (NaOH)	Fisher	S318500
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (Na2HPO4)	Sigma	S374-500
Solid waste collection bucket	M&M Industries	5.0 Gallon M1 Traditional Pail
Tryptone	Genesee Scientific	20-251
Vortex	Thermo	11676331
Weighing balance	C Goldenwall	HZ10K6B
Yeast Extract	Genesee Scientific	20-255