1. Preparação

1. Antes de começar, coloque luvas de laboratório e roupas de proteção apropriadas.
2. Lave todas as ferramentas de dissecção, primeiro com um detergente e depois com 70% de etanol e depois seque-as com uma toalha de papel limpa.
3. Prepare 200 mL da solução de sal balanceada da Hank (HBSS) contendo 2% de soro fetal de bezerro (FCS).

2. Dissecção

1. Fixar um rato eutanizado em uma placa de dissecção na posição supina.
2. Usando tesouras e fórceps, faça uma laparotomia longitudinal para acessar a cavidade torácica.
3. Remova o coração para ter acesso ao timo, que está localizado acima do coração. Em seguida, identifique o timo, que é composto por dois lobos brancos e está localizado na cavidade torácica acima do coração.
4. Usando fórceps cuidadosamente desprender o timo e colocá-lo na placa de Petri com 5 mL de HBSS 2% FCS.

3. Isolamento de células imunes

1. Coloque o timo em um coador de célula de 40 μm sobre a mesma placa de Petri. Esmague o timo com um êmbolo para dissociá-lo no mesmo prato.
2. Transfira o timo dissociado e o fluido em um tubo de centrífuga de 15 mL.
3. Lave a placa de Petri com 5 mL de HBSS 2% FCS e transfira o meio lavado também para o mesmo tubo de centrífuga.
4. Centrifugar o tubo a 370 x g por 7 min a 20°C e descartar o supernatante evitando a pelota.
5. Resuspenque a pelota em 2 mL de acetato de potássio para lise os eritrócitos. Aguarde 2 min e, em seguida, compor o volume de até 14 mL usando HBSS 2% FCS.
6. Centrifugar o tubo novamente a 370 x g por 7 min a 20°C. Descarte o supernatante e resuspenque a pelota em 5 mL de HBSS 2% FCS.
7. Estime a concentração celular usando o ensaio de coloração azul trypan e ajuste a concentração celular final para 10⁷ células/mL usando volume apropriado de HBSS 2% FCS.

4. Rotulagem magnética de células imunes

1. Pegue dois tubos FACS. Rotular um tubo, "células T não enriquecidas", e o outro tubo, "células T enriquecidas", que serão separados usando rotulagem magnética.
2. Distribuição da solução celular em cada um dos dois tubos FACS.
3. Centrifugar o tubo "células T enriquecidas" a 370 x g por 3 min a 20°C e descartar o supernatante evitando a pelota.
4. Resuspende a pelota em 250 μL de mistura de anticorpos biotinilados anti-CD3 (Tabela 1, Mix 1).

Tabela 1: Mistura de anticorpos. Misturas 1 e 2 são usadas para separação magnética. Mix 3 é usado para avaliar o enriquecimento celular após a separação magnética.

5. Incubar a mistura de anticorpos suspensão celular por 15 minutos a 4°C no escuro.
6. Adicione 3 mL de HBSS 2% FCS aos tubos e centrífugue novamente a 370 x g por 3 min a 20°C.
7. Descarte o supernatante e resuspenda a pelota em 250 contas acoplado streptavidin (Tabela 1, Mix 2).
8. Incubar a mistura celular e as contas por 20 minutos no gelo.
9. Em seguida, adicione 3 mL de HBSS 2% FCS e misture bem e centrífuga novamente a 370 x g para 3 min a 20°C.
10. Resuspense a pelota em 2 mL de HBSS 2% FCS.

5. Separação magnética de células CD3-Positivas

1. Coloque a coluna no ímã e adicione 3 mL de HBSS 2% FCS para umidificar o sistema. Espere 5 minutos.
2. Em seguida, coloque as células rotuladas na coluna.
3. Após a suspensão do celular passar pela coluna, lave a coluna X3 vezes com 3 mL de HBSS 2% FCS.
4. Em seguida, remova a coluna do ímã e coloque-a em um tubo de coleta de 15 mL.
5. Para elutar as células-alvo, adicione 5 mL de HBSS 2% FCS à coluna e lave a coluna com o êmbolo.
6. Repetir a etapa de eluição com mais 5 mL de HBSS 2% FCS.

6. Avaliação do enriquecimento de células-alvo por citometria de fluxo

1. Transfira 500 μL de suspensão celular elucida para um tubo FACS rotulado de "células T enriquecidas". Transfira 200 μL de suspensão "células T não enriquecidas" para um segundo FACS.
2. Em seguida, centrifugar ambos os tubos a 370 x g por 7 min a 20°C.
3. Descarte o supernatante e adicione 100 μL de anticorpo fluorescente Mix 3 (ver Tabela 1) a ambos os tubos.
4. Incubar os dois tubos por 20 min a 4°C no escuro.
5. Em seguida, adicione 3 mL de HBSS 2% FCS aos tubos e centrífugue-os a 370 x g por 3 min a 20°C.
6. Descarte o supernasal, depois resuspende cada tubo em 250 μL de HBSS 2% FCS.
7. Agora, avalie a taxa de enriquecimento celular CD3 positivo por citometria de fluxo.

7. Análise de dados

1. Abra o ícone 'FlowJo' e arraste os arquivos para cada tubo na janela "All Sample".
2. Clique duas vezes no arquivo "células T enriquecidas" para exibir o gráfico de pontos exibindo dispersão para a frente (FSC-A) no eixo X e dispersão lateral (SSC-A) no eixo Y.
3. Clique em "Polígono" para circular as populações de linfócitos.
4. Em seguida, clique duas vezes na população circulada para criar uma nova janela.
5. Selecione "FSC-W" no eixo Y e "FSC-A" no eixo X, e circule as células negativas FSA-W. Na janela"Identificação de Subpopulação",nomeie a população celular como "células únicas".
6. Clique duas vezes na população circulada para criar uma nova janela. Selecione "CD3" no eixo Y e circule as células CD3 positivos. Na janela"Identificação de Subpopulação"nomeie sua população celular "células T".
7. Repita com as "células T não enriquecidas".
8. Para visualizar a população celular, clique em "Editor de layout" e arraste a população de "células T" de arquivos "células T enriquecidas" e "células T não enriquecidas" na guia.
9. Gráficos de ponto representando linfócitos CD3+aparecerão. As células CD3+ só devem aparecer na população de interesse do tubo enriquecido CD3+.
10. Para avaliar o enriquecimento de linfócitos CD3+ nas células classificadas, clique em "Table editor", e depois arraste a população de "células T" de arquivos "células T enriquecidas" e "células T não enriquecidas" para a mesa.
11. No menu "Estatística", selecione "Frequência de linfócitos" para verificar a porcentagem de células CD3+ em todos os linfócitos, em seguida, clique em "Criar tabela".
12. Os valores dos parâmetros aparecerão em uma nova tabela. Para as "células T enriquecidas", a frequência das células CD3+ deve ser em torno de 80%.