1. Configuração

Tampões e reagentes

1. Salina tamponada de fosfato estéril (PBS) sem cálcio ou magnésio
2. Tampão de revestimento- PBS estéril ou tampão de carbonato
3. Ensaio diluído- 10% soro bovino fetal (FBS) na PBS
4. Cultura celular média- RPMI 1640 com 10% de FBS, penicilina/estreptomicina, & L-glutamina
5. Tampão de lavagem- PBS contendo 0,05% Tween20
6. Dupla água destilada (ddH₂O)
7. Substrato de detecção- 100 mg AEC (3-amino-9-etil-carbazole) em 10 mL DMF (N,N, Dimetilformamida).

Equipamento

8. Capa de fluxo laminar
9. Incubadora umidificada (fixada em 37°C, 5% CO₂)
10. Leitor ELISPOT automatizado ou microscópio de dissecação

Materiais

11. Placas ELISPOT
12. Reservatórios estéreis e não tésteres
13. Pipettors e dicas
14. Pipetas sorológicas estéreis
15. Tubos estéreis e cônicos de polipropileno
16. Duas garrafas de espremer para lavagem de pratos

Reagentes específicos de ensaio

17. Células- células primárias ou linhas celulares (aqui, esplenócitos de C57BL/6 camundongos foram usados)
18. Estimulantes- mitogênio ou antígeno (aqui, phorbol 12-myristate 13-acetato (PMA, 50 ng/mL) e ionomicina (1 μM) foram usados)
19. Anticorpo primário- biotinilado anti-citocinas detectando anticorpos (diluídos a 2 μg/mL em diluente de ensaio)
20. Anticorpo secundário- streptavidin-rabanete peroxidase (SAv-HRP)

2. Procedimento

Revestimento

1. Mantendo as condições estéreis e dentro de uma coifa de fluxo laminar, diluir o anticorpo purificado anti-citocina capturar a uma concentração final de 0,5-4,0 μg/mL em tampão de revestimento estéril. (Nota: para IFN- γ e IL-6 use 5 μg/mL).
2. Transfira a solução de anticorpos de captura, 100 μL/well, para a placa ELISPOT.
3. Cubra a placa com uma tampa de placa e sele-a para evitar a evaporação.
4. Incubar a placa durante a noite a 4°C.

Bloqueio

5. No dia seguinte, descubra a placa ELISPOT no capô de fluxo laminar. Inverta rapidamente a placa em lenços estéreis para remover a solução de anticorpos de captura de cada poço.
6. Em seguida, adicione 200 μL de cultura celular média a cada poço. Esta etapa bloqueará a vinculação não específica durante o ensaio.
7. Substitua a tampa da placa e incubar a placa por 2 horas a 37°C.

Células de revestimento e ativação

8. Enquanto a placa estiver incubando, prepare uma solução 2X mitogen contendo 50 ng/mL PMA e 1 μM de ionomicina em meio de cultura celular.
9. Em seguida, prepare as suspensões celulares de destino para uma concentração de estoque de 2 x 10⁶ células/mL.
10. Depois que a incubação estiver completa, remova o meio de cultura celular de cada poço, invertendo rapidamente a placa em lenços estéreis dentro da capa de fluxo laminar.
11. Em seguida, gere uma diluição serial 2X da solução de suspensão de células de estoque. Para isso, adicione primeiro 200 μL da solução de estoque de suspensão celular preparada nos poços na linha superior da placa ELISPOT.
12. Em seguida, adicione 100 μL de cultura de célula simples ao próximo cinco linhas da placa abaixo das linhas que contêm solução de estoque celular.
13. Depois disso, realize uma diluição serial 2X ao pipetar 100 μL da suspensão celular da linha superior para a linha superior diretamente abaixo. Certifique-se de uma mistura adequada, encanar suavemente esta solução para cima e para baixo para garantir a distribuição uniforme das células.
14. Repita este processo para as quatro linhas restantes.
15. Deixe a sexta fila apenas com o meio de cultura. Servirá como controle experimental.
16. Em seguida, adicione 100 μL da solução mitogênio preparada aos poços experimentais das cinco primeiras linhas da placa. Nos poços de controle e na sexta linha, adicione 100 μL da mídia de cultura celular sem mitogênio.
17. Substitua a tampa da placa e incuba a placa de 37°C, 5% DE CO₂ em uma incubadora por 20-48 horas. (Nota: 20-24 horas é normalmente suficiente para detectar IL-2 e TNF-α, enquanto 48 horas é ideal para IL-4 e IFN-γ).

Detecção

Anticorpo primário

18. Prepare o anticorpo biotinína anti-citocina detectador para uma concentração de 2 μg/mL em diluente de ensaio.
19. Prepare 20-25 mL de tampão de lavagem neste momento misturando 0,05% Tween-20 em PBS.
20. Depois que a incubação estiver completa, desprezam a placa e invertam-na rapidamente sobre uma pia para remover todo o líquido dos poços. (Nota: Após este ponto a placa não precisa mais ser mantida estéril).
21. Em seguida, lave a placa adicionando ~200 μL de tampão de lavagem a cada poço. Expulse este líquido invertendo rapidamente e movendo a placa sobre uma pia. Repita este processo para um total de cinco lavagens.
22. Em seguida, adicione 100 μL da solução de anticorpos biotiniladas diluídas que detectam anticorpos a cada poço. Incubar em temperatura ambiente por 2 horas em temperatura ambiente ou durante a noite a 4°C.

Anticorpo secundário

23. Após a incubação ser concluída, expulse o anticorpo de detecção invertendo e sacudindo a placa sobre a pia.
24. Como antes, lave a placa 5 vezes com ~200 μL de tampão de lavagem, expelindo o líquido entre cada lavagem.
25. Em seguida, adicione 100 μL de solução de peroxidase de streptavidin-rabanete diluída a cada poço (diluído à sua concentração ideal pré-determinada no diluente do ensaio).
26. Substitua a tampa da placa e incubar à temperatura ambiente por 1,5-2 horas a 37°C.

Substrato

27. Após a incubação, não mais do que 15 minutos antes do uso, ative primeiro a solução de substrato AEC de acordo com as instruções do fabricante.
28. Em seguida, descarte o conteúdo dos poços e lave a placa cinco vezes com tampão de lavagem, como antes.
29. Em seguida, adicione imediatamente 100 μL de solução de substrato AEC preparada em cada poço.
30. Incubar a placa em temperatura ambiente por ~10-20 minutos enquanto monitora o desenvolvimento do local.
31. Pare a reação enxaguando a placa com água e jogando a placa sobre a pia.
32. Borrique a placa em toalhas de papel e deixe a placa secar durante a noite ou até que esteja completamente seca. A remoção da bandeja de plástico sob a placa facilitará a secagem.

3. Aquisição e Análise de Dados

1. Após a secagem, as manchas estão prontas para serem contadas com um leitor automático de placas. Aqui, o leitor CTL Immunospot é usado, mas este protocolo pode ser adaptado para qualquer leitor.
2. Primeiro ligue o instrumento, depois o computador. Em seguida, abra o programa CTL e clique em "contagem de varredura".
3. Empurre "ejetar" para que a bandeja se estenda da máquina. Em seguida, remova o adaptador plástico e alinhe a linha "A" na placa e adaptador ELISPOT.
4. Escolha um nome de arquivo e localização para que o arquivo seja salvo e carregue a placa na bandeja.
5. Em seguida, clique em "carregar" no software e feche a porta na lateral da máquina.
6. Pressione "start-after count". Certifique-se de que o arquivo está salvo e, em seguida, abra o software de controle de qualidade "QC" para analisar os dados e contar o número de pontos.

Anotações:

1. O número mínimo de células deve ser determinado em experimentos preliminares. O número ideal de pontos é ~50/bem. Se muitas células estiverem carregadas, será difícil detectar pontos distintos. Além disso, as células se sobreporão e não podem formar uma monocamada na membrana, assim o nível de detecção pode ser reduzido.
2. Ao otimizar o experimento, considere o nível de expressão esperado da proteína alvo. Quanto menor a expressão, maior o número de células exigidas por poço.
3. Ao contrário da ELISA, é melhor lavar a placa à mão em vez de usar uma arruela de placa. As placas ELISPOT são mais delicadas e deve-se evitar perfurar a membrana PVDF.
4. Deve-se limitar o movimento da placa durante o período de incubação, pois pode fazer com que as manchas borrem.
5. As placas devem ser armazenadas no escuro, pois a exposição à luz direta faz com que as manchas desapareçam.