Fonte: Perchet Thibaut1,2,3, Meunier Sylvain1,2,3, Sophie Novault4, Rachel Golub1,2,3
1 Unidade de Linfísia, Departamento de Imunologia, Instituto Pasteur, Paris, França
2 INSERM U1223, Paris, França
3 Université Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité, Cellule Pasteur, Paris, França
4 Flow Cytometry Platfrom, Cytometry and Biomarkers UtechS, Center for Translational Science, Pasteur Institute, Paris, França
O ciclo celular é um processo universal de vida. Durante o ciclo celular, uma célula sofre várias modificações para se dividir em duas células filhas. Esse mecanismo ocorre ao longo da vida de um organismo em resposta às suas necessidades. Divisões celulares e desenvolvimento embrionário produzem um organismo completo a partir de um zigoto unicelular. Durante a idade adulta, o ciclo celular é central para muitos processos biológicos críticos, como reparos teciduais.
Mecanismos de divisão celular são eventos fortemente controlados onde a célula sofre modificações stepwise antes da divisão final. As células que ainda não estão no ciclo são descritas como estando na fase Gap 0 (G0). Durante esta fase, a célula é considerada quiescente. Quando a célula começa a pedalar, quatro fases distintas são reconhecidas: Gap 1 (G1),Síntese (S), Gap 2 (G2) e Mitosis (M). A fase G1 é um ponto de verificação para os recursos necessários pela célula para a síntese de DNA. Em seguida, ocorre a fase S, e a replicação do DNA começa, seguida pela interfase G2, outro ponto de verificação que controla todos os elementos necessários para que a célula se divida. Finalmente, a célula entra na mitose e se divide em duas células filhas.
A divisão celular é um parâmetro altamente informativo em muitos sistemas biológicos diferentes. No campo da imunologia, a análise da proliferação de leucócitos pode indicar o mecanismo da resposta imune. Outros domínios da investigação também se baseiam na análise do ciclo celular. Por exemplo, a análise do ciclo celular durante o desenvolvimento do tumor melhorou nossa compreensão do câncer.
Muitos corantes fluorescentes estão agora disponíveis para rastrear a proliferação celular. Estes corantes diferem em suas propriedades químicas e espectrais. Existem duas classes diferentes de corantes: corantes proteicos se combinam permanentemente com proteínas formando uma ligação covalente, e corantes de membrana intercalam-se dentro das membranas celulares através de fortes associações hidrofóbicas. Estudos in vitro e in vivo de proliferação de células imunes por citometria de fluxo estão entre as aplicações mais comuns de ambas as classes de corantes de rastreamento celular (1, 2).
CFSE (Carboxyfluorescein succinimidyl é um corante fluorescente que marca células divisórias. Inicialmente, todas as células recebem a mesma quantidade de corante; dividindo células uniformemente dividir o corante que receberam entre suas duas células filhas. Consequentemente, o ciclo celular pode ser seguido pela diminuição progressiva da intensidade do corante nas células. A coloração do CFSE é seguida pela citometria de fluxo multiparamétrico convencional, uma tecnologia baseada em fluorescência de alto rendimento que permite caracterização fenotípica e funcional das células com base no seu grau de coloração de CFSE (3).
No experimento a seguir, avaliamos a proliferação de células CD4+ e CD8+ T in vitro,seguindo a estimulação do CD3, utilizando coloração de CFSE e citometria de fluxo.
1. Preparação
2. Dissecção
3. Isolamento de células imunes
4. Coloração de CFSE e Estimulação de células T
5. Mancha celular
Anticorpo | Fluorochrome | Diluição |
CD3 | Azul do Pacífico | 1/100 |
CD4 | BV786 | 1/1600 |
CD8 | PE | 1/400 |
Teu1.2 | BV605 | 1/400 |
Tabela 1: Composição de mistura de anticorpos. Quatro preparações de coquetéis de anticorpos utilizando conjugados concentrados de anticorpos fluorescentes e HBSS.
6. Análise de dados
Figura 1: Estratégia gating. As células são primeiro fechadas com base em sua morfologia (esquerda: FSC-A, SSC-A). As células T são então fechadas (meio: CD3, Thy1.2) e ainda divididas em células CD4+ T (laranja) e células CD8+ T (azul) (à direita: CD4, CD8). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Neste experimento, acompanhamos a proliferação de células BAçosa CD4+ e CD8+ T na cultura in vitro. Após 3 dias, não vimos forte proliferação em células CD4+ e CD8+ T com ou sem estimulação. Isso pode ser visto no painel superior da Figura 2 onde os picos de CSFE não estão diminuindo. No entanto, após 5 dias, começamos a ver proliferação em ambas as populações, o que é evidente a partir da diminuição dos picos de CSFE (painéis inferiores, Figura 2). A coloração do CFSE demonstra claramente que tanto as células CD4+ quanto CD8+ T estavam se dividindo mais após a estimulação. Além disso, as células CD8+ T pareciam ser um pouco mais proliferativas do que as células CD4+ T após 5 dias de estimulação.
Figura 2: Proliferação de células CD4 versus CD8 T. Proliferação de células T nos dias 3 (painel superior) e dia 5 (painel inferior). O ciclo celular é comparado entre células CD4 e CD8 T com ou sem estimulação em dois dias diferentes. As células CD4 e CD8 T proliferam mais quando estimuladas. As células T estimuladas pelo CD8 proliferam mais do que as células T estimuladas pelo CD4 no dia 5. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Ensaios de proliferação são frequentemente usados em diferentes campos, como a imunologia, para determinar o grau de ativação das células. Também é realizado no diagnóstico oncológico para determinar a agressividade tumoral em pacientes. A coloração de CFSE é uma técnica útil para acompanhar a proliferação das populações de células imunes ao longo do tempo. Outros métodos permitem a caracterização do ciclo celular. BrdU, um equivalente de CFSE é incorporado apenas em células divisórias. O modelo recente do mouse Fucci ainda permite a detecção de fases de ciclo celular, sem coloração adicional.
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