1. Preparação

1. Antes de começar, coloque luvas de laboratório e as roupas de proteção apropriadas.
2. Esterilize todas as ferramentas de dissecção, primeiro com um detergente e depois com 70% de etanol e depois limpe-as completamente.
3. Prepare 50 mL da solução de sal balanceada da Hank (HBSS) contendo 2% de soro fetal de bezerro (FCS).

2. Dissecção

1. Usando um sistema de entrega de dióxido de carbono, eutanize o rato por hipóxia. Fixar o rato eutanizado em uma placa de dissecção na posição supina e realizar uma laparotomia longitudinal usando tesouras e fórceps.
2. Usando fórceps, mova os intestinos e o estômago do lado direito do abdômen para expor o estômago e o baço. O baço está preso ao estômago.
3. Usando fórceps cuidadosamente desprender o baço do estômago e colocá-lo na placa de Petri contendo 5 mL de HBSS 2% FCS.

3. Isolamento de células imunes

1. Coloque o baço em um coador de célula de 40 μm sobre a mesma placa de Petri. Esmague o baço com um êmbolo para dissociá-lo.
2. Transfira o baço dissociado e o fluido em um tubo centrífuga de 15 mL.
3. Centrifugar o tubo a 370 x g por 7 min a 10°C e descartar o supernatante evitando a pelota.
4. Resuspenque a pelota em 2 mL de acetato de potássio para lise os eritrócitos. Aguarde 2 min e depois coma o volume de até 15 mL usando HBSS 2% FCS.
5. Centrifugar o tubo novamente a 370 x g por 7 min a 10°C. Descarte o supernatante e resuspenque a pelota em 5 mL de HBSS 2% FCS.
6. Conte as células usando um ensaio de coloração azul trypan e ajuste a concentração celular final para 10⁷ células/mL usando um volume apropriado de HBSS 2% FCS.

4. Coloração de CFSE e Estimulação de células T

1. Distribua 10⁷ células de baço isolado/tubo em 4 tubos (tubos de 15 mL, rotulados de 1 a 4)
2. Adicione 3 mL HBSS 2% FCS a cada tubo.
3. Adicione 1 μL de CSFE em cada tubo (concentração final- 5 μM).
4. Incubar os tubos a 37°C em uma incubadora de CO₂ de 5% por 10 minutos.
5. Nos tubos 3 e 4, adicione 12 mL de HBSS 2% de TRFC + anticorpo anti-CD3 em uma concentração final de 2,5 μg/mL. Os tubos 3 e 4 são estimulados usando anticorpo anti-CD3, para observar o efeito no ciclo celular.
6. Nos tubos 1 e 2 adicione 12 mL de HBSS 2% FCS. As células nos tubos 1 e 2 não serão estimuladas.
7. Centrifugar todos os tubos a 370 x g por 7 min a 10°C. Descarte os supernantes.
8. Resuspense as pelotas em 2 mL de HBSS 2%FCS.
9. Transfira as soluções resultantes para poços separados em uma placa de 6 poços.
10. Incubar as células a 37°C, 5% de CO₂ por 3 dias.

5. Mancha celular

1. No dia 3, adicione 2 mL HBSS 2%FCS em bem 1 e 3.
2. Pipeto vigorosamente e transfira as amostras em tubos FACS de 5 mL.
3. Continue incubando as células restantes dos poços 2-4 a 37°C, 5% DE CO₂. Eles serão analisados no dia 5 para investigar os efeitos a longo prazo da estimulação no ciclo celular.
4. Centrifugar os tubos a 370 x g por 7 min a 10°C. Descarte os supernantes.
5. Adicione 100 μL de mistura de anticorpos (ver Tabela 1) a cada tubo.

Tabela 1: Composição de mistura de anticorpos. Quatro preparações de coquetéis de anticorpos utilizando conjugados concentrados de anticorpos fluorescentes e HBSS.

6. Incubar os tubos por 20 minutos no gelo no escuro.
7. Adicione 1 mL de HBSS 2%FCS e centrifugar os tubos a 370 x g por 7 min a 10°C.
8. Descarte o supernatante e resuspenque as pelotas em 200 μL de HBSS 2% FCS.
9. Transfira as pelotas resuspendadas para tubos FACS novos e rotulados.
10. Avalie a proliferação de células T usando FACS.
11. No dia 5, repita o processo de coloração celular com as células dos dois poços restantes da placa de 6 poços.

6. Análise de dados

1. Abra o software "FlowJo" e arraste os arquivos para a janela "All sample".
2. Clique duas vezes no arquivo para células não estimuladas coletadas no dia 3 para exibir um gráfico de pontos com dispersão para a frente no eixo Y e dispersão lateral no eixo X.
3. Clique em "Polygon" e crie uma estratégia de gating para selecionar células linfoides, células Thy1.2⁺ CD3⁺ e distinguir células CD4⁺ e CD8⁺ (ver Figura 1).

Figura 1: Estratégia gating. As células são primeiro fechadas com base em sua morfologia (esquerda: FSC-A, SSC-A). As células T são então fechadas (meio: CD3, Thy1.2) e ainda divididas em células CD4⁺ T (laranja) e células CD8⁺ T (azul) (à direita: CD4, CD8). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Repita os passos com outros arquivos.
5. Para determinar as frequências de células divisórias e não-divisórias, visualize primeiro as populações celulares clicando em "Editor de layout".
6. Arraste as células CD4 T e cd8 T de cada um dos quatro tubos para a "janela de amostra"
7. Gráficos representando cada população aparecerão.
8. Use histograma para visualizar os resultados e selecione "CFSE" como parâmetro para comparação dos diferentes tubos e das diferentes populações.
9. Células não divisórias mantêm níveis mais elevados de CFSE, enquanto células proliferantes dividem o conteúdo de CFSE para células divisórias
10. Crie um portão em células não-divisórias e aplique-o em todos os tubos.
11. Crie um portão sobre células divisórias e aplique-o em todos os tubos.
12. Para examinar a frequência de células CD3+ divididas, clique em "Table editor".
13. Arraste as populações de interesse - dividindo células T CD8 e dividindo células T CD4 - em "Tabela".
14. No menu "Estatística", selecione "frequência de células T", em seguida, clique em "Criar tabela" para revelar a frequência em uma nova tabela.
15. Clique em "Criar tabela". Para revelar os valores de frequência, apareça em uma nova tabela.