<ol style="list-style-type:upper-alpha;"><li> Preparação de lesão fantasma (phantom preparar cerca de 38 a 48 horas antes da sessão prática real da FNA proficiência (Figura 1) ou utilizar pronto para usar &#39;AV Fantasma &quot;da FNA Fonte, EUA. A lesão fantasma (armazenadas sob refrigeração sem congelar) pode ser mantido, mesmo preparado 3-4 dias antes da prática da sessão. </li><li> Praticando FNA proficiência: Embora tenhamos demonstrado o procedimento usando THFV Shidham do (Tissue Harvester com válvula Funcional) (FNA Fonte, EUA), qualquer sistema FNA podem ser utilizados outros para a prática (Figura 2). </li><li> Divulgação e processamento do aspirado em lâmina de vidro (Figura 3). </li></ol> Material necessário <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Claro silicone para calafetar disponível em muitas lojas de construção / home melhoria. Muitas marcas estão disponíveis, incluindo DAP GETM, Red Devil, White Lightning, e as marcas da cadeia local. Usamos borracha de silicone transparente, Produtos White Lightning, Cleveland, Ohio, EUA, <a href="http://www.wlcaulk.com/products/all_purpose/silicone_rubber/wl09010.html">http://www.wlcaulk.com/products/all_purpose/silicone_rubber/wl09010.html</a> ) </li><li> Pistola de calafetagem </li><li> Um pedaço de folha de plástico (usamos Saran Cling Além disso Wrap, SC Johnson &amp; Son Inc, Racine, WI, EUA <a href="http://www.saranbrands.com/plastic-wrap/index.asp">http://www.saranbrands.com/plastic-wrap/index.asp</a> </li><li> Luvas de látex </li><li> Bananeira diâmetro largo ou salsicha. </li><li> Firme e liso placa de base (cerca de 6 polegadas X 6 polegadas) feitas de tábua de cartão de espessura, placa de acrílico, ou outros. </li><li> FNA realizando equipamentos <ul><li> 25 agulhas hipodérmicas </li><li> THFV Shidham (ou outros componentes para a realização de FNA) </li><li> lâminas de vidro </li><li> kits de coloração </li></ul></li></ol> Passo-a-passo os detalhes A. Preparação de lesão fantasma (phantom preparar 1-2 dias antes de praticar FNA proficiência (Figura 2) ou utilizar pronto para usar &#39;AV Fantasma &quot;da FNA Fonte, EUA. <ol><li> Cortar uma 6 X 6 polegadas de tamanho apoio bordo. </li><li> Corte um segmento de 2,5 polegada de comprimento de &#39;core lesão fantasma&#39; (banana ou salsicha). </li><li> Expulsar 0,5 polegada de espessura da camada de calafetar na placa de base. </li><li> Pressione o &#39;fantasma lesão core&#39; levemente para esta camada de calafetar. </li><li> Adicione mais caulk sobre o &quot;núcleo lesão fantasma &#39;de modo que é totalmente incorporado no monte de calafetar, sem bolhas de interceptação. </li><li> Ajustar e moldar a calafetação mais &quot;núcleo lesão fantasma &#39;com a mão enluvada. </li><li> Dê uma 6 X 6 polegadas de tamanho pedaço filme plástico e cobrir o monte de calafetar e ajustar a superfície do monte em uma configuração convexa lisa com uma mão, limpa enluvadas. </li><li> Deixe a cura monte calafetar por 6-8 horas a mais do que o tempo de cura mencionados sob as instruções do produto, (geralmente 24 horas), em local aquecido. </li><li> Após a cura, a calafetação deve ser firme, eo filme plástico pode ser retirada facilmente. </li><li> A FNA lesão fantasma está pronto para ser usado para praticar o procedimento FNA após cerca de 8 horas, quando o monte inteiro de calafetar estar completamente curado do centro contendo o &quot;núcleo lesão fantasma &#39;(banana ou salsicha). </li></ol> B. Praticar FNA proficiência na AV lesão Phantom. Qualquer abordagem na obtenção de alta qualidade, aspirados adequados FNA com boa qualidade esfregaços citológicos direta devem seguinte endereço pontos críticos de- <ol style="list-style-type:upper-roman;"><li> O medidor de-agulha como implícita no título do procedimento, as agulhas mais finas (número maior calibre) aspirados rendimento melhor com diluição do sangue mínima. Para balanço crítico dos benefícios e limitações, 22-25 agulhas são preferidos para ótima estabilidade mecânica da agulha sem afetar a qualidade aspirar FNA. </li><li> Controlar sequências apropriadas na aplicação de vácuo e solte durante a FNA procedimento Isso é fundamental para avançar as células da amostra em cada curso da agulha, em direção ao centro da agulha. No entanto, o material aspirado não deve ser permitido chegar até a área do conjunto de punção aspirativa por agulha com seringa. Se isso não for evitado, o material pode ser difícil de recuperar para a tomada de esfregaços (este material pode, no entanto, ser usado para a preparação de blocos de células ou de métodos de concentração, como Cytospin, métodos de filtro, ou recentes líquido preparações de citologia based). </li><li> Desenvolver habilidade apropriada no processamento do espécime aspirado, incluindo a preparação do exame direto e on-site de avaliação de adequação, com triagem adequada para exames complementares, tais como células-bloco preparação para imunocitoquímica eletivo, citometria de fluxo eletivo para imunofenotipagem de lesões linfoproliferativas, submetendo passes estéreis para microbiologia estudos, mate erial para testes molecular (citogenética, etc.) </li></ol> Ba Performing FNA procedimento (mostrado com THFV Shidham [1] (FNA Fonte, EUA), no entanto, qualquer sistema FNA podem ser utilizados outros para a prática). (Figura 3,4,5). <ol><li> Prepare a montagem FNA com a válvula fechada. </li><li> Localizar a lesão e inserir a ponta da agulha na lesão. </li><li> Abrir a válvula para ligar o vácuo, através da agulha até a sua ponta, para aspirar representante componentes celulares da lesão em cada lado para o outro curso na lesão. </li><li> Manter as áreas de vácuo e amostras diferentes da lesão através da inserção da agulha na lesão em diferentes direções. </li><li> Fechar a válvula para desligar o vácuo no lúmen da agulha. </li><li> Equalizar a pressão com condições ambientais (por exemplo, desligar o Seringa válvula da agulha por um breve momento e reconectar. Se o dispositivo especial com passos inbuilt, como &#39;THFV&#39; é usado, este e outros passos de Ba1 através BA6 estão concertados automaticamente seguindo diferentes etapas do sistema de válvulas) [1]. </li><li> Retire a agulha da lesão com a válvula fechada, a fim de evitar a perda da amostra por ação capilar na lesão a menos que haja pressão ligeiramente negativa no final hub. </li><li> Desalojar o conteúdo aspirado para a lâmina de vidro para preparar esfregaço direto (veja abaixo) (figura 6). </li></ol> Bb Processing. Da amostra aspirado com triagem adequada Espalhando a aspirar a lâminas de vidro e preparar esfregaço de boa qualidade direto (Figura 6), seguido de coloração adequada e triagem (Figura 7,8). <ol><li> Uma gota de aspirado de desalojados na lâmina de vidro é transmitida por uma variedade de abordagens, como mostrado na (Figura 6) [2]. A abordagem usual é &#39;a&#39;. No entanto, se a amostra é sangue diluído com alguns microfragmentos, o excesso de sangue é drenada inclinando a lâmina, ea microfragmentos então estão espalhados entre este slide e lâmina de vidro segundo semelhante a &#39;a&#39;. Se a aspiração é predominantemente uma suspensão sem microfragmentos, como de lesões linfoproliferativas, é semelhante a se espalhar &#39;b&#39; ou &#39;c&#39;. </li><li> As manchas podem ser processados ​​e fixo em uma variedade de maneiras para diferentes métodos de coloração no local durante a avaliação da adequação. No entanto, a melhor abordagem é secar todos os esfregaços. Os esfregaços secos ao ar pode ser manchado com manchas Romanowski (como Difff-Quik mancha, mancha Wright) após a fixação com metanol ou Pap mancha após a reidratação-salina e pós-fixação (em etanol 95% ou, de preferência em etanol 95% com 5 % de ácido acético) [3]. Eliminação da interferência devido ao sangue obscurecendo é um benefício significativo [3]. </li><li> Dependendo dos resultados iniciais cytomorphologic no local durante a avaliação da adequação, triagem adicionais (como bloco de celas eletivo, microscopia eletrônica, as culturas de microbiologia, citometria de fluxo, citogenética molecular-testes, etc) é recomendada, como indicado. </li></ol> Resultados representativos: <img border="0" src="/files/ftp_upload/1404/1404fig1tmb.jpg" alt="figura 1" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1404/1404fig1.jpg">Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada da figura 1</a> . Figura 1. Material necessário para a preparação AV Fantasma para a prática de FNA proficiência (* Usamos Saran plástico que não aderir ao calafetar no final, durante a remoção após a cura completa da calafetar.) <hr style="border-bottom:1px dotted #999999;" /><img border="0" src="/files/ftp_upload/1404/1404fig2tmb.jpg" alt="figura 2" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1404/1404fig2.jpg">Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada da figura 2.</a> Figura 2. Preparando AV lesão Fantasma <hr style="border-bottom:1px dotted #999999;" /><img border="0" src="/files/ftp_upload/1404/1404fig3tmb.jpg" alt="figura 3" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1404/1404fig3.jpg">Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada da figura 3.</a> Figura 3. Etapas críticas no processo de FNA. <hr style="border-bottom:1px dotted #999999;" /><img border="0" src="/files/ftp_upload/1404/1404fig4tmb.jpg" alt="figura 4" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1404/1404fig4.jpg">Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada da figura 4.</a> Figura 4. EUS-FNA Resumo dos passos críticos * (ver Fig. 3) <hr style="border-bottom:1px dotted #999999;" /><img border="0" src="/files/ftp_upload/1404/1404fig5tmb.jpg" alt="figura 5" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1404/1404fig5.jpg">Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada da figura 5.</a> Figura 5. Armadilhas relacionadas com as etapas críticas na FNA procedure. <hr style="border-bottom:1px dotted #999999;" /><img border="0" src="/files/ftp_upload/1404/1404fig6tmb.jpg" alt="figura 6" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1404/1404fig6.jpg">Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada da figura 6.</a> Figura 6. Preparação de esfregaços diretos de FNA espécime entre dois slides. <hr style="border-bottom:1px dotted #999999;" /><img border="0" src="/files/ftp_upload/1404/1404fig7tmb.jpg" alt="figura 7" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1404/1404fig7.jpg">Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada da figura 7.</a> Figura 7. Wet manchas fixo versus Air-dried. <hr style="border-bottom:1px dotted #999999;" /><img border="0" src="/files/ftp_upload/1404/1404fig8tmb.jpg" alt="figura 8" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1404/1404fig8.jpg">Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada da figura 8.</a> Figura 8. Wet manchas fixo versus Air-dried.

<ol>
	<li>Shidham, V. B., Pandit, A. W., Rao, R. N., Basir, Z., Shidham, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Harvester+with+Functional+Valve+(THFV):+Shidham's+device+for+reproducibly+higher+specimen+yield+by+fine+needle+aspiration+biopsy+with+easy+to+perform+steps.">Tissue Harvester with Functional Valve (THFV): Shidham's device for reproducibly higher specimen yield by fine needle aspiration biopsy with easy to perform steps.</a> BMC Clinical Pathology. 7 (2), (2007).</li><li>Shidham, V. B., Epple, J., Shidham, V. B., Atkinson, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AppendiX+I:+Collection+and+processing+of+effusion+fluids+for+cytopathologic+evaluation.">AppendiX I: Collection and processing of effusion fluids for cytopathologic evaluation.</a> , 207-235 (2007).</li><li>Shidham, V., Kampalath, B., England, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routine+air+drying+of+all+the+smears+prepared+during+fine+needle+aspiration+and+intraoperative+cytology+studies:+An+opportunity+to+practice+a+unified+protocol,+offering+the+flexibility+of+choosing+variety+of+staining+methods.">Routine air drying of all the smears prepared during fine needle aspiration and intraoperative cytology studies: An opportunity to practice a unified protocol, offering the flexibility of choosing variety of staining methods.</a> Acta Cytologica. (45), 60-68 (2001).</li></ol>

Biópsias com agulha fina de aspiração (PAAF) são amplamente realizada como econômica, técnica segura, rápida e minimamente invasiva para o diagnóstico de tecido de tumores e lesões diversas. Neste procedimento uma agulha de calibre 18-27 é inserido na lesão, mudou-se frente e para trás várias vezes em diferentes áreas da lesão, sob vácuo, controlada (sucção) de intensidade variável que variam de um mínimo sob a forma de ação capilar apenas a cerca de 10 ml vácuo na seringa para obter material de tecido de diagnóstico. A agulha de calibre fino com maior número é o preferido para recuperar material de citologia boa para preparar esfregaços diretos. Agulha de maior calibre de 18G recupera mais amostra adequada para o bloco de células, citometria de fluxo, microscopia eletrônica, citogenética, etc microbiologia culturas Embora o procedimento é simples, controlando várias etapas com a aplicação adequada e liberação de vácuo a medidas apropriadas de maneira concertada é extremamente crucial para os melhores resultados. Devido à não disponibilidade de especialmente concebidos alto rendimento agulhas, agulhas hipodérmicas convencional ou suas modificações são usados ​​para executar este procedimento. No entanto, as agulhas hipodérmicas têm muitas limitações levando a um baixo rendimento da amostra se for utilizado de maneira convencional. A exigência de apertos seringa especial geralmente aumenta a complexidade do procedimento. Assim, devido à falta de dispositivo adequado disponível comercialmente agulha PAAF, este procedimento altamente versátil sofre um problema freqüente de recuperação de espécime inadequada. Recentemente, um dispositivo de aumentar o rendimento com reprodutibilidade tem sido relatada [1]. Além disso, atualmente há uma falta de modelo adequado para a prática de proficiência na realização de PAAF por pessoal de saúde em formação, incluindo residentes e especializandos. Nós tínhamos um modelo padronizado com um pedaço de fígado bovino fresco recheado de luvas de látex para a prática de PAAF de proficiência. No entanto, este modelo é difícil organizar em um curto espaço de tempo. Aquisição de fígado bovino fresco é geralmente a situação limitante. Além disso, a manipulação do fígado pode introduzir contaminação fatores relacionados com um empate importante para trás. A tendência para a luva de látex para depois de um vazamento de picadas de agulha poucos leva à confusão potencial durante a sessão prática. Relatamos e descrever um romance, mas simples método de incorporação de um pequeno pedaço de banana (ou salsicha) em um calafetar comercialmente disponíveis de borracha de silicone e materiais facilmente disponíveis outras. O fantasma PAAF mantém selo de vácuo permitindo assim a aspiração de material da amostra de embutidos, equivalente ao procedimento PAAF real sobre uma lesão no ambiente clínico. Neste vídeo, demonstramos o procedimento de fazer PAAF lesão fantasma e praticar procedimento PAAF. Ele também demonstra no processamento do espécime breve recuperada, incluindo a preparação esfregaço e coloração [2,3]. Porque a calafetação leva tempo para curar a lesão fantasma deve ser preparado com antecedência de cerca de 24 a 48 horas antes da sessão de prática. Comparáveis ​​pronto para usar lesão fantasma pode ser obtido a partir de uma fonte comercial (FNA Fonte, EUA). A lesão fantasma para a prática de PAAF de proficiência podem ser usados ​​para a formação de moradores e companheiros antes do início do desempenho PAAF em pacientes na clínica.

preparation and using phantom lesions to practice fine needle aspiration biopsies

Atualmente, os trabalhadores de saúde, incluindo os residentes e os companheiros não têm um modelo adequado para a prática do fantasma aspirativa por agulha fina procedimento de biópsia (PAAF). No passado, padronizamos um modelo composto por luvas de látex contendo fígado bovino fresco para a prática de PAAF. No entanto, este modelo é difícil de organizar e preparar a curto prazo, com a aquisição de fígado bovino fresco sendo o aspecto mais desafiador. Manipulação de fígado com problemas de contaminação relacionados com um empate também é significativa para trás. Além disso, os vazamentos luva de material após uma agulha poucos passes, com a resultante confusão. Nós estabelecemos um novo método simples de incorporar um pequeno pedaço de salsicha ou banana em uma calafetar comercialmente disponíveis silicone de borracha. Este modelo permite a retenção do selo de vácuo e aspiração de material da amostra de embutidos, assemelhando-se um procedimento de PAAF real sobre lesões de massa clínico. O material aspirado no canhão da agulha pode ser processado semelhante ao das amostras obtidas durante um procedimento de PAAF real, facilitando a proficiência adicional em preparação esfregaço e coloração.

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Preparation and Using Phantom Lesions to Practice Fine Needle Aspiration Biopsies

Prática de PAAF (PAAF) por estagiários é relativamente difícil, devido à falta de uma lesão facilmente disponível, apropriado. Preparação de uma lesão phantom AV para a prática do procedimento de PAAF e proficiência masterização é relativamente fácil.

Preparação e Utilização de lesões Fantasma à Prática biópsias aspirativa por agulha fina

Currently, health workers including residents and fellows do not have a suitable phantom model to practice the fine- needle aspiration biopsy (FNAB) ...

preparation-using-phantom-lesions-to-practice-fine-needle-aspiration

Research

JoVE Journal

Biology

17.7K visualizações.  University of Wisconsin - Milwaukee. Prática de PAAF (PAAF) por estagiários é relativamente difícil, devido à falta de uma lesão facilmente disponível, apropriado. Preparação de uma lesão phantom AV para a prática do procedimento de PAAF e proficiência masterização é relativamente fácil.

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Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish (Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the cellular and molecular features of the epithelia, which are mainly composed of two types of cells: hair cells (HCs) and supporting cells (SCs). Here we choose to study the inner ear sensory epithelia in adult zebrafish not only because the epithelial structures are highly conserved in all vertebrates studied, but also because the adult zebrafish is able to regenerate HCs, an ability that mammals lose shortly after birth. We use the inner ear of adult zebrafish as a model system to study the mechanisms of inner ear HC regeneration in adult vertebrates that could be helpful for clinical therapy of hearing/balance deficits in human as a result of HC loss.
Here we demonstrate how to do gross and fine dissections of inner ear sensory epithelia in adult zebrafish. The gross dissection removes the tissues surrounding the inner ear and is helpful for preparing tissue sections, which allows us to examine the detailed structure of the sensory epithelia. The fine dissection cleans up the non-sensory-epithelial tissues of each individual epithelium and enables us to examine the heterogeneity of the whole epithelium easily in whole-mount epithelial samples.

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish Danio rerio

The inner ear sensory epithelium of adult zebrafish is a good model system for understanding the mechanisms of hair cell regeneration in adult vertebrates. This protocol demonstrates the fine dissection of the epithelia, through which we can get tissue samples for studying the regenerative events at cellular and subcellular levels.

Dissecação bruta e Multa de Ouvido Interno Epitélio sensorial em adultos Zebrafish ( Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the ...

Biologia

Western Blotting: Sample Preparation to Detection

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel electrophoresis to separate native or denatured proteins by the length of the polypeptide (denaturing conditions) or by the 3-D structure of the protein (native/ non-denaturing conditions). The proteins are then transferred to a membrane (typically nitrocellulose or PVDF), where they are probed (detected) using antibodies specific to the target protein.

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract.

Western Blotting: Preparação de amostras para detecção

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel ...

Advanced Confocal Microscopy Techniques to Study Protein-protein Interactions and Kinetics at DNA Lesions

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological approach to analyzing protein kinetics at DNA lesions over time or protein-protein interactions on locally microirradiated chromatin. We also show how to recognize individual phases of the cell cycle using the Fucci cellular system to study cell-cycle-dependent protein kinetics at DNA lesions. A methodological description of the use of two UV lasers (355 nm and 405 nm) to induce different types of DNA damage is also presented. Only the cells microirradiated by the 405-nm diode laser proceeded through mitosis normally and were devoid of cyclobutane pyrimidine dimers (CPDs). We also show how microirradiated cells can be fixed at a given time point to perform immunodetection of the endogenous proteins of interest. For the DNA repair studies, we additionally describe the use of biophysical methods including FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) and FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) in cells with spontaneously occurring DNA damage foci. We also show an application of FLIM-FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) in experimental studies of protein-protein interactions.

Laser microirradiation is a useful tool for studies of DNA repair in living cells. A methodological approach for the use of UVA lasers to induce various DNA lesions is shown. We have optimized a method for local microirradiation that maintains the normal cell cycle; thus, irradiated cells proceed through mitosis.

Avançadas técnicas de microscopia Confocal para estudar interações da proteína-proteína e cinética de lesões do ADN

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological ...

Immunolabelling Myofiber Degeneration in Muscle Biopsies

The necrosis of muscle fibres (myonecrosis) plays a central role in the pathogenesis of several muscle conditions, including muscular dystrophies. Therapeutic options addressing the causes of muscular dystrophy pathogenesis are expected to alleviate muscle degeneration. Therefore, a method to assay and quantify the extent of cell death in muscle biopsies is needed. Conventional methods to observe myofiber degeneration in situ are either poorly quantitative or rely on the injection of vital dyes. In this article, an immunofluorescence protocol is described that stains necrotic myofibers by targeting immunoglobulin G (IgG) uptake by myofibers. The IgG uptake method is based on cell features characterizing the necrotic demise, including 1) the loss of plasma membrane integrity with the release of damage-associated molecular patterns and 2) the uptake of plasmatic proteins. In murine cross-sections, the co-immunolabelling of myofibers, extracellular matrix proteins, and mouse IgG allows clean and straightforward identification of myofibers with necrotic fate. This simple method is suitable for quantitative analysis and applicable to all species, including human samples, and does not require the injection of vital dye. The staining of necrotic myofibers by IgG uptake can also be paired with other co-immunolabelling.

Described here is a protocol for direct immunolabelling of necrotic myofibers in muscle cryosections. Necrotic cells are permeable to serum proteins, including immunoglobulin G (IgG). Revealing the uptake of IgG by myofibers allows the identification and quantification of myofibers that undergo necrosis regardless of muscle condition.

Imunolabellagem de degeneração da miofibra em biópsias musculares

The necrosis of muscle fibres (myonecrosis) plays a central role in the pathogenesis of several muscle conditions, including muscular dystrophies. ...

Single Cell Micro-aspiration as an Alternative Strategy to Fluorescence-activated Cell Sorting for Giant Virus Mixture Separation

During the amoeba co-culture process, more than one virus may be isolated in a single well. We previously solved this issue by end point dilution and/or fluorescence activated cell sorting (FACS) applied to the viral population. However, when the viruses in the mixture have similar morphologic properties and one of the viruses multiplies slowly, the presence of two viruses is discovered at the stage of genome assembly and the viruses cannot be separated for further characterization. To solve this problem, we developed a single cell micro-aspiration procedure that allows for separation and cloning of highly similar viruses. In the present work, we present how this alternative strategy allowed us to separate the small viral subpopulations of Clandestinovirus ST1 and Usurpativirus LCD7, giant viruses that grow slowly and do not lead to amoebal lysis compared to the lytic and fast-growing Faustovirus. Purity control was assessed by specific gene amplification and viruses were produced for further characterization.

Here, we describe a single cell micro-aspiration method for the separation of infected amoebae. In order to separate viral subpopulations in Vermamoeba vermiformis infected by Faustoviruses and unknown giant viruses, we developed the protocol detailed below and demonstrated its ability to separate two low-abundance novel giant viruses.

Micro-aspiração de célula única como uma estratégia alternativa à classificação celular ativada por fluorescência para separação de mistura de vírus gigante

During the amoeba co-culture process, more than one virus may be isolated in a single well. We previously solved this issue by end point dilution and/or ...

Assessing Agrochemical Risk to Mated Honey Bee Queens

Current risk assessment strategies for honey bees rely heavily upon laboratory tests performed on adult or immature worker bees, but these methods may not accurately capture the effects of agrochemical exposure on honey bee queens. As the sole producer of fertilized eggs inside a honeybee colony, the queen is arguably the most important single member of a functioning colony unit. Therefore, understanding how agrochemicals affect queen health and productivity should be considered a critical aspect of pesticide risk assessment. Here, an adapted method is presented to expose honey bee queens and worker queen attendants to agrochemical stressors administered through a worker diet, followed by tracking egg production in the laboratory and assessing first instar eclosion using a specialized cage, referred to as a Queen Monitoring Cage. To illustrate the method&#39;s intended use, results of an experiment in which worker queen attendants were fed diet containing sublethal doses of imidacloprid and effects on queens were monitored are described.

This protocol was developed to enhance the understanding of how agrochemicals affect honey bee (Apis mellifera) reproduction by establishing methods to expose honey bee queens and their worker caretakers to agrochemicals in a controlled, laboratory setting and carefully monitoring their relevant responses.

Avaliando o risco agroquímico para rainhas de abelhas de mel acasaladas

Current risk assessment strategies for honey bees rely heavily upon laboratory tests performed on adult or immature worker bees, but these methods may not ...

Profiling of H3K4me3 Modification in Plants using Cleavage under Targets and Tagmentation

Epigenomic regulation at the chromatic level, including DNA and histone modifications, behaviors of transcription factors, and non-coding RNAs with their recruited proteins, lead to temporal and spatial control of gene expression. Cleavage under targets and tagmentation (CUT&#38;Tag) is an enzyme-tethering method in which the specific chromatin protein is firstly recognized by its specific antibody, and then the antibody tethers a protein A-transposase (pA-Tn5) fusion protein, which cleaves the targeted chromatin in situ by the activation of magnesium ions. Here, we provide our previously published CUT&#38;Tag protocol using intact nuclei isolated from allortetraploid cotton leaves with modification. This step-by-step protocol can be used for epigenomic research in plants. In addition, substantial modifications for plant nuclei isolation are provided with critical comments.

Cleavage under targets and tagmentation (CUT&amp;Tag) is an efficient chromatin epigenomic profiling strategy. This protocol presents a refined CUT&amp;Tag strategy for the profiling of histone modifications in plants.

Perfil da modificação H3K4me3 em plantas usando decote sob alvos e tagmentação

Epigenomic regulation at the chromatic level, including DNA and histone modifications, behaviors of transcription factors, and non-coding RNAs with their ...

An Improved Chemotaxis Assay for the Rapid Identification of Rhizobacterial Chemoattractants in Root Exudates

Chemotaxis identification is very important for the research and application of rhizosphere growth-promoting bacteria. We established a straightforward method to quickly identify the chemoattractants that could induce the chemotactic movement of rhizosphere growth-promoting bacteria on sterile glass slides via simple steps. Bacteria solution (OD600 = 0.5) and sterile chemoattractant aqueous solution were added dropwise on the glass slide at an interval of 1 cm. An inoculating loop was used to connect the chemoattractant aqueous solution to the bacterial solution. The slide was kept at room temperature for 20 min on the clean bench. Finally, the chemoattractant aqueous solution was collected for bacterial counting and microscopic observation. In this study, through multiple comparisons of experimental results, the method overcame multiple shortcomings of traditional bacterial chemotaxis methods. The method reduced the error of plate counting and shortened the experimental cycle. For the identification of chemoattractant substances, this new method can save 2-3 days compared to the traditional method. Additionally, this method allows any researcher to systematically complete a bacterial chemotaxis experiment within 1-2 days. The protocol can be considered a valuable resource for understanding plant-microbe interactions.

Here, we present an improved chemotaxis assay protocol. The goal of this protocol is to reduce the steps and costs of traditional bacterial chemotaxis methods and to serve as a valuable resource for understanding plant-microbe interactions.

Um ensaio de quimiotaxis melhorado para a identificação rápida de quimioattractants rizobacterianos em Exudates radiculares

Chemotaxis identification is very important for the research and application of rhizosphere growth-promoting bacteria. We established a straightforward ...

Comprehensive Echocardiographic Assessment of Right Ventricle Function in a Rat Model of Pulmonary Arterial Hypertension

Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a progressive disease caused by vasoconstriction and remodeling of the small arteries in the lungs. This remodeling leads to increased pulmonary vascular resistance, worsened right ventricular function, and premature death. Currently approved therapies for PAH largely target pulmonary vasodilator pathways; however, recent emerging therapeutic modalities are focused on other novel pathways involved in the pathogenesis of the disease, including right ventricle (RV) remodeling. Imaging techniques that allow longitudinal assessment of novel therapeutics are very useful for determining the efficacy of new drugs in preclinical studies. Noninvasive trans-thoracic echocardiography remains the standard approach to evaluating heart function and is widely used in rodent models. However, echocardiographic evaluation of the RV can be challenging due to its anatomical position and structure. In addition, standardized guidelines are lacking for echocardiography&#160;in preclinical rodent models, making it difficult to carry out a uniform assessment of RV&#160;function across studies in different laboratories. In preclinical studies, the monocrotaline (MCT) injury model in rats is widely used to evaluate drug efficacy for treating PAH. This protocol describes the echocardiographic evaluation of the RV in na&#239;ve and MCT-induced PAH rats.

The present protocol describes the echocardiographic characterization of right ventricular morphology and function in a rat model of pulmonary arterial hypertension.

Avaliação Ecocardiográfica Abrangente da Função do Ventrículo Direito em Modelo de Hipertensão Arterial Pulmonar em Rato

Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a progressive disease caused by vasoconstriction and remodeling of the small arteries in the lungs. This ...

Usando biópsias de pele para gerar podócitos derivados de pacientes

Generation of Patient-Derived Podocytes from Skin Biopsies

Podocytes are epithelial cells sitting on the urinary site of the glomerular filtration barrier that contribute to the selective filter function of the glomerulus. Mutations in podocyte-specific genes can cause focal segmental glomerulosclerosis (FSGS), and podocytes are also affected in many other primary and secondary nephropathies. Due to their differentiated nature, primary cell culture models are limited for podocytes.&#160;Therefore, commonly conditionally immortalized cells are used. However, these conditionally immortalized podocytes (ciPodocytes) have several limitations: the cells can dedifferentiate in culture, especially when they reach confluency, and several podocyte-specific markers are either only slightly or not expressed at all. This brings the use of ciPodocytes and their applicability for physiological, pathophysiological, and clinical reach into question. Here, we describe a protocol for the generation of human podocytes-including patient-specific podocytes-from a skin punch biopsy by episomal reprogramming of dermal fibroblasts into hiPSCs and subsequent differentiation into podocytes. These podocytes resemble in vivo podocytes much better in terms of morphological characteristics, like the development of foot processes and the expression of the podocyte-specific marker. Finally, yet importantly, these cells maintain patients&#39; mutations, resulting in an improved ex vivo model to study podocyte diseases and potential therapeutic substances in an individualized approach.

Autor em destaque: Geração de podócitos derivados de pacientes a partir de biópsias de pele  

This manuscript describes a two-step protocol to generate patient-specific podocytes from dermal fibroblasts via episomal reprogramming into human-induced pluripotent stem cells (hiPSCs) and subsequent differentiation into podocytes.

Geração de Podócitos Derivados do Paciente a partir de Biópsias de Pele

Podocytes are epithelial cells sitting on the urinary site of the glomerular filtration barrier that contribute to the selective filter function of the ...