A necrose do miofibra é característica de múltiplas doenças neuromusculares e desempenha um papel central na patogênese. Um método específico e confiável para avaliar a degeneração muscular é importante para o diagnóstico e a pesquisa translacional. Esta técnica extremamente adaptável permite a rotulagem de antígeno múltiplo ao mesmo tempo na mesma seção dentro dessa miofibers.
É possível com corantes vitais. A coloração de H&E é um método empírico que não é adaptável para conjugação confiável e reprodutível. A coloração da absorção de IGG, no entanto, é específica para células musculares necróticas e aplicável às biópsias humanas.
Esta técnica pode fornecer insights sobre todos os distúrbios neuromusculares caracterizados pela micose. Depois de remover o cabelo da perna de interesse coloque o animal mdx macho de quatro semanas na posição supina e fixar as patas em uma tábua de rolha. Usando tesouras de precisão ou fórceps, remova a pele da perna do pé para o joelho para expor toda a extensão da tíbia e tibialis anterior.
Use a tesoura para fazer uma incisão entre a tíbia e a tibialis anterior. Use fórceps para remover cuidadosamente a camada de epimísio da superfície do músculo. No tornozelo, use os fórceps para isolar o tendão anterior tibialis dos outros tendões e puxar suavemente para cima no tendão para isolá-lo da tíbia e dos músculos circundantes.
Quando a barriga tibialis anterior tiver separado inteiramente o tendão para que apenas a parte proximal do músculo tibialis anterior seja presa ao joelho. E corte suavemente o tendão proximal o mais próximo possível da patela. Coloque a tibialis anterior em um pedaço de gaze levemente umedecido com soro fisiológico para evitar a secagem.
Mergulhe parcialmente um béquer contendo 70 a 100 mililitros de isopentane em um recipiente de nitrogênio líquido até que a isoperne no fundo do béquer se torne um sólido branco. Prec rotulado cuidadosamente o outro lado das rolhas para que a biópsia possa ser devidamente identificada após o congelamento, e adicione aproximadamente 0,5 mililitros de chiclete tragacanth em uma peça circular de 20 por 11 por 8 milímetros de cortiça. Use fórceps para incorporar a tibialis anterior no lado do tendão distal da gengiva para cima.
Segurando o músculo com seu eixo perpendicular à superfície da rolha. Pelo menos metade do lado tendinoso da tibialis anterior deve permanecer descoberto pela gengiva. Em seguida, mergulhe rapidamente a rolha com o músculo embutido na isopentane gelada e descongelada por cerca de dois minutos para permitir o congelamento completo.
Obtenha seções do tecido congelado, coloque a temperatura do criostat para menos 25 graus Celsius e use o composto de temperatura de corte ideal para fixar o tecido no bloco de corte criostat. Corte a amostra até que a barriga muscular seja atingida. Obtenha de sete a 10 seções de micrômetros coletando pelo menos duas seções por deslizamento de vidro colocando os slides à temperatura ambiente à medida que as seções são capturadas.
Deixe os tecidos secarem por pelo menos 20 minutos à temperatura ambiente em um ambiente ventilado. Em seguida, armazene a seção a menos 80 graus Celsius até que eles estejam manchando. Imunolabel os tecidos.
Primeiro, descongele os slides à temperatura ambiente por pelo menos 15 minutos no ambiente ventilado. Em seguida, delineie as seções com uma caneta hidrofóbica. Fixar os tecidos com 2% de paraformaldeído por 10 minutos em uma câmara úmida.
No final de uma fixação enxágue as seções com duas lavagens de 5 minutos em PBS fresco por lavagem. Bloqueie qualquer ligação não específica com soro de cabra de 10% diluído em PBS. Após 1 hora no rótulo de temperatura ambiente as seções com anticorpos primários de interesse, diluídas em soro de cabra de 5% por 2 horas em temperatura ambiente.
No final da incubação, enxágue os slides com três lavagens de 5 minutos em PBS siga rotulando com os anticorpos secundários conjugados fluoróforos apropriados por 45 minutos à temperatura ambiente protegidos da luz. No final da incubação, lave os slides com três lavagens de 10 minutos em PBS. Monte a seção com um meio de montagem fluorescente contendo 100 nanogramas por mililitro de DAPI e um deslizamento de cobertura.
Em seguida, seque as lâminas durante a noite em quatro graus Celsius antes da imagem. Os músculos anteriores tibialis de quatro semanas de idade mdx camundongos frequentemente exibem perfis heterogêneos, incluindo áreas mal afetadas em áreas degeneradas e regeneradoras juntos na mesma seção transversal. Não afetados por áreas musculares levemente afetadas contêm miofibers de grande e homogêneo e núcleos em baixa densidade que estão localizados principalmente na periferia ou entre os miofibers.
Os myofibers positivos do IGG estão geralmente ausentes em tais áreas de saúde ou levemente afetadas, enquanto a imunoreatividade IgG dentro dos miofibers indica micose. Os miofibers recém-formados estão presentes em um pequeno tamanho em seus estágios iniciais de regeneração aumentando progressivamente à medida que os progenitores musculares se fundem em contribuir para a célula sincicial. Durante esse processo, os mionucleis permanecem no centro do tecido regenerador com aglomerados de miofibers pequenos e centralmente nucleados indicando miofibers recentemente regenerados Para minimizar o risco de artefatos é importante manter nos músculos em linha reta ao congelar o tecido e na temperatura correta.
Isopentane e PFA devem ser sempre manuseadas com cautela e sob um capô de fumaça.
