Name: observing mitotic division and dynamics in a live zebrafish embryo
Uploaded: 2016-07-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
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We thank Kristen Kwan for the pCS2-H2A.F/Z-EGFP and pCS2-mCherry-CAAX vectors. We thank Chris Rodesch for tutoring us in live imaging in zebrafish. We thank Shawn Williams, Erik Malarkey and Brad Yoder for assistance in confocal imaging at UAB and the High Resolution Imaging Facility at UAB. The High Resolution Imaging Facility is supported by the UAB Comprehensive Cancer Center Support Grant (P30CA013148) and the Rheumatic Disease Core Center (P30 AR048311). J.M.P. is supported by the National Institute of Neurological Disease and Stroke (NIH R21 NS092105), and pilot grants from American Cancer Society (ACS IRG-60-001-53-IRG) and the UAB Comprehensive Cancer Center (P30CA013148). S.M.P. is supported by the Cell and Molecular Biology T32 Training Grant (5T32GM008111-28).

1. transcrição in vitro <ol><li> Linearizar pCS2-H2A.F / Z-EGFP e / ou vetores pCS2-mCherry-CAAX por restrição NotI enzima digerir 31. Utilizando um kit de ARN in vitro a transcrição, gerar produtos 5 &#39;de ARNm tapados de cada molde, de acordo com o protocolo do fabricante. </li><li> Purifica-se o ARNm utilizando um kit tapados purificação. Siga as instruções do fabricante. Eluir com livre de RNase H 2 O. </li><li> Determinar a concentração de ARN por absorvância a 260 nm utilizando um espectrofotómetro. (OD 260 x diluição x 40 ug / ml). </li><li> Diluir o RNA a 100 ng / mL para cada H H2A.F / Z-EGFP e mCherry-CAAX com RNase 2 O. Se a concentração de ARN é muito baixa, a fluorescência será diminuído ou ausente. amostras brilhantes vai diminuir as preocupações sobre a fototoxicidade e fotodegradação. Por outro lado, o excesso de ARN podem ser tóxicos e / ou causar efeitos fora do alvo. Nota: guarde o restantemRNA purificado de -80 ° C congelador. </li></ol> 2. Criação de peixe-zebra, colheita de embriões, e mRNA Injection 36-38 <ol><li> Montar tanques de criação com uma barreira para separar o tanque em duas regiões e encher cada tanque de criação com água sistema de aquicultura utilizados na instalação de peixe-zebra. </li><li> A fim de evitar a reprodução prematura, coloque dois peixes machos em um lado da barreira e dois peixes feminina do outro lado da noite antes de produzir. </li><li> No dia seguinte, descongelar a mistura previamente preparada de ARNm em gelo. Substitua a água em tanques de criação com água sistema de aquicultura frescos e remover as barreiras. Imediatamente após as barreiras são puxados, aquecer um molde de injecção de 28,5 ° C e configurar o equipamento para microinjecção. Nota: Para obter informações sobre moldes de injeção, consulte Gerlach 36. </li><li> Recolher os ovos a cada 10 - 15 minutos utilizando um coador de chá e lavar os ovos em um 100 x 15 mm de prato limpo Petri com E3 Azul (5 mM de NaCl, KCl 0,17 mM, CaCl2 0,33, MgSO4 0,33 mM, 10 -5% azul de metileno). E3 azul é utilizado para evitar o crescimento de fungos e garantir o correcto desenvolvimento de larvas de peixes. Para mais informações sobre o acasalamento e de colheita de embriões, consulte Gerlach 36 e Porazinkski 37. </li><li> Incorporar uma célula-encenado embriões num molde de injecção aquecido e injectar o ARN na gema no valor desejado de embriões (Figura 1A). Conta de morte embrionária natural e embriões não fertilizados por realizar injeções embrionárias em 15% mais embriões do que o necessário para o experimento. Para detalhes adicionais sobre a microinjeção de embriões de peixe-zebra, consulte Gerlach 36 e Porazinkski 37. NOTA: Para uso pela primeira vez de mRNA, realizar uma análise de dose-curva para determinar a dose ideal para a fluorescência e viabilidade (definida como ausência de defeitos de desenvolvimento brutas até 5 dpf) antes da realização de imagiologia 5D. 150-200 ng / ulinjectado em embriões é muitas vezes a concentração óptima, portanto, é um bom ponto de partida para a concentração final. </li><li> Cuidadosamente extrair os embriões injectados desde o molde usando uma versão modificada 9 &quot;pipeta de Pasteur de vidro. Para modificar a pipeta, derreter a fim usando um bico de Bunsen até formar uma bola. </li><li> Coloque embriões injetados em um prato de 100 x 15 mm Petri na E3 azul e casa em um C incubadora de 28,5 °. </li><li> Seis horas após a injecção, retire todos os embriões mortos ou não fertilizados das placas e adicionar E3 azul limpo. Casa dos embriões em 28,5 ° C. </li></ol> 3. Preparação e incorporação da Vivo embriões Zebrafish for Imaging (Figura 1B) <ol><li> Duas horas antes de imagem, a tela de embriões injectados para GFP, utilizando um microscópio de dissecação fluorescente. Coloque embriões verdes brilhantes que expressam GFP em uma nova placa de 100 mm x 15 Petri com E3 Azul. </li><li> Levar à ebulição uma solução de stock de 1% de agarose de baixa de fusão através da adição de 1 g de agarose a baixo ponto de fusão a 100 ml de E3 azul. Depois de usar a agarose, cobrir o balão com folha de alumínio. A solução permanece útil para até um mês. </li><li> Aliquota de 3 ml de agar derretido em um tubo de cultura de 17 x 100 mm. Manter a quente de agarose, colocando o tubo de cultura em um banho de água a 42 ° C até que esteja pronto para uso. Preparar uma solução de 15 tricaina mM em água deionizada para anestesiar os embriões de peixe-zebra 36. NOTA: Se imagiologia em pontos de tempo anteriores é desejada, a concentração de ágar pode ser diminuída tão baixo quanto 0,3% 39. </li><li> Trazer o mM tricaina 15, embriões selecionados, baixo agarose fundido, E3 Azul, e uma 35 milímetros lamela de vidro cultura fundo prato para um microscópio de luz dissecção. Remova cuidadosamente córion do embrião com # 5 pinças. Faça isso por três embriões. </li><li> Colocar os embriões dechorionated num recipiente separado a ser anestesiado. A tampa da placa de fundo lamela é frequentemente utilizado para este fim. Usando uma pipeta de transferência, adicione três gotas (cerca de 150 mL)tricaina de 15 mM para o prato de 5 ml E3 azul (se utilizar a tampa da lamela prato inferior) ou até os embriões foram suficientemente anestesiados. Além disso, adicionar 3-4 gotas (cerca de 150-200 ul) de 15 mM de solução tricaina ao tubo de agarose fundida a 1%. </li><li> Usando uma pipeta de p200 com 1 cm da ponta da pipeta cortada; transferir os embriões anestesiados para o prato de fundo lamela. Remova qualquer E3 Azul excesso: solução tricaina. </li><li> Lentamente, adicionar 5 - 10 jul de agarose de baixo ponto de fusão: solução tricaina ao longo dos embriões, mantendo cada gota separada para assegurar que os embriões não acidentalmente deriva perto um do outro. Aviso: Se a agarose é muito quente, ele irá danificar o embrião. Uma boa temperatura para manter o agar é a 42 ° C. </li><li> Usando uma agulha de 21 G 1 ½, gentilmente orientar o embrião no agarose para a posição desejada. Ao usar um microscópio invertido para geração de imagens de lapso de tempo, oriente a região de interesse (ROI) tão perto da lamela como possible. Nota: Para fins gerais, a região da cauda oferece facilidade de orientação e clareza devido ao tecido relativamente fino (Figura 1A). Outros tecidos, tais como a camada epitelial em torno das pregas de gema e de aleta, pode ser utilizada 28,29. Estes tecidos oferecem grande clareza, no entanto estas regiões são apenas algumas camadas de células de espessura. Para o propósito deste protocolo, é benéfico para a imagem região da cauda para adquirir como muitas divisões celulares quanto possível. </li><li> Permitir que um min poucos para a solidificação parcial do ágar. Usar a agulha para separar um pequeno pedaço de ágar para testar a sua solidificação. Quando um pedaço de agar pode ser puxado para fora da gota, prossiga para a próxima etapa. </li><li> Cobrir toda a lamela com baixa agar fundido formando uma cúpula sobre os embriões embutidos. Permitir que o agar solidificar antes de mover o prato para imagiologia confocal (Figura 1A). </li><li> Durante o processo de solidificação de agar (demora cerca de 10 min), 3 ml de o prepararf E3 solução azul com cinco gotas de (aproximadamente 250 ul) tricaina 15 mM a ser colocada sobre os embriões incorporados durante o exame. </li></ol> 4. 5D Imagem Confocal de US Jogos de embriões Zebrafish 40,41 NOTA: Ver Ariga 40 e O&#39;Brien 41 para detalhes sobre como realizar imagem 5D usando outros sistemas confocal. Para Z-intervalo, Z-pilha, profundidade Z, intervalo de tempo, e definições 5D ver Figura 1C. <ol><li> Abra o software de imagem e definir o microscópio para 60X NA 1.4 lente objetiva. Aplicar óleo de imersão para a lente objetiva e coloque o prato de cultura no compartimento de slides no palco microscópio. Usando o controlador de eixo, o centro do embrião de interesse acima da lente objectiva e trazer a lente objectiva para cima ao encontro do prato de cultura. </li><li> Clique no ícone da parte do olho e mudar para o filtro GFP no microscópio. Concentre-se no ROI. Centrando-se no tecido mais próximo da lamela será offer os melhores resultados de imagem. </li><li> Remova o encravamento. Selecionar os canais de GFP e mCherry (comprimentos de onda pré-estabelecidos em software) e definir a linha de opção ao normal média. </li><li> Use &quot;Controles de Ver / Aquisição / A1 Área de Digitalização&quot; comando para abrir a ferramenta A1 Área de Digitalização. </li><li> Iniciar a digitalização. Usando o eixo-controlador, posicionar o embrião de modo que a área de leitura é preenchido com tanto do peixe-zebra quanto possível. A potência do laser não precisa de ser óptima a este ponto. Diminuir a potência do laser para evitar a fotodegradação desnecessário. </li><li> Use os &quot;Controles de Ver / Aquisição / aquisição ND&quot; comando para abrir o painel de controle de aquisição da ND. </li><li> Iniciar a digitalização para definir os parâmetros Z-stack. Defina o limite superior Z-stack para onde as células não estão em foco e limite inferior para onde as células não são mais visíveis. Permitir um espaço de 3 micrómetros acima da amostra para o crescimento e o movimento celular, o que pode expandir-se para o campo de imagem. O Z-stack para as figuras mostradas neste proprotocolo cobriu uma Z-profundidade de 40 mm na cauda do embrião. </li><li> Defina o tamanho do Z-interval passo para 2 mm. Em média, uma célula é de 10 um de diâmetro; portanto, 2 m vai produzir cinco intervalos de dados de imagem a ser analisada para cada célula. NOTA: A profundidade da imagem que pode ser adquirida depende do intervalo Z. resolução Z é sacrificado para ganhar profundidade total na dimensão Z, a fim de imagem como muitas células que sofrem mitose possível (grande profundidade Z). O inverso é verdadeiro, na medida em que, ao diminuir o tamanho do passo, a resolução Z é adquirida, enquanto Z profundidade é sacrificado (pequena profundidade Z). </li><li> Ajustar a potência do laser de imagem, HV, e compensar os níveis. Para os experimentos demonstraram neste protocolo, use a seguinte potência do laser, HV, e compensar níveis fixados nos níveis correspondentes, respectivamente, para o canal de GFP; 2-5, 120-140, e -9 a -11. Para o canal mCherry, use a seguinte potência do laser, HV, e compensar os níveis, respectivamente; 3-6, 120-140, e -3 para-8. Uma vez que os parâmetros são definidos, desligue a varredura para evitar a exposição a laser desnecessário que pode causar fototoxicidade e fotodegradação da amostra. </li><li> Selecione o ícone de média linha de 2x. &quot;Não média&quot; produz uma imagem granulada enquanto &quot;linha 4x média&quot; aumenta drasticamente o tempo de verificação. Uso de linha 2x média proporciona a melhor qualidade de imagem e tempo mais rápido de digitalização. </li><li> Seleccione a duração do intervalo de tempo e tempo adequados necessários para o experimento. Para divisões de tipo selvagem, os intervalos de tempo de dois minutos durante 2 horas é o melhor para determinar a duração mitótico (utilizados nas Figuras 1, 2, 3A e 3B). Divisões que activam o ponto de verificação para a montagem do eixo mais longo do que 30 minutos são mais adequados para intervalos de cinco minutos, durante quatro horas, a fim de preservar a fluorescência como demonstrado na Figura 3C. </li><li> Marque a caixa &quot;salvar em arquivo&quot; e nome do arquivo para salvar automaticamente o arquivo tal como ele está sendo adquirido. verifique todos os patros estão definidos corretamente e clique em &quot;começar a correr&quot;. </li><li> Após a aquisição for concluída, para exibir o arquivo em um formato tridimensional, clique no ícone do limiar de volume. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

A utilização deste método permite inferir colapso nuclear de envelope, a formação de uma placa de metafase por anexos microtubule-cinetocoro, e a segregação de cromatídeos irmãos para formar duas novas células in vivo e de um modo dependente do tempo. A capacidade de observar a mitose no peixe-zebra é vantajosa em relação a amostras fixadas e sistemas de cultura de células porque as células estão a ser trabalhada na fisiologia natural, o tecido é transparente, o que permite que as proteínas fl...

A mitose é essencial um processo celular fundamental para o crescimento, a diferenciação e regeneração de um organismo vivo. Após a preparação exacta e a replicação de ADN na interfase, a célula é preparado para dividir. A primeira fase da mitose, profase, é iniciada por activação de ciclina B / Cdk1. Prophase é caracterizada por condensação de material cromatina em cromossomas. repartição envelope nuclear ocorre na zona de transição entre a profase e prometáfase. Em prometáfase, centrossomas, o centro de nucleação para a formação do fuso, começam a migrar para os pólos opostos enquanto estende microtúbulos em busca de apego kinetochore. Após a fixação, as conversões ao fim-on fixação dos microtúbulos e forças de tensão orientar os cromossomos que formam uma placa metafásica 1. Se todos os cromossomos estão ligados corretamente, o ponto de verificação de montagem do fuso é satisfeito, anéis coesina segurando as cromátides irmãs em conjunto são clivados, e microtúbulos encurtar a puxar irmãchromatids para pólos opostos durante anaphase 2,3. A fase final, telofase, envolve o alongamento da célula e reformação do envelope nuclear em torno dos dois novos núcleos. A citocinese completa o processo de divisão, separando o citoplasma das duas células filhas novas 4-6. Alteração das vias principais de mitose (ou seja, ponto de verificação de montagem do fuso, a duplicação centrossoma, irmã chromatid coesão, etc.) Pode resultar em prisão metaphase, segregação errada dos cromossomas e instabilidade genômica 7-10. Em última análise, os defeitos nas vias mitose controle pode causar distúrbios do desenvolvimento e câncer, necessitando de visualização de mitose e seus defeitos em um, animal vertebrado, organismo multicelular vivo 10-16. embriões de peixe-zebra servir como um grande organismo modelo para imagens ao vivo devido ao tecido transparente, facilidade de microinjeção, e desenvolvimento rápido. Usando peixes-zebra, o objetivo geral deste artigo é o dedescrevem um método de 5D vivo (dimensões X, Y, Z, tempo, e comprimento de onda) imagiologia de mitose 17 (Figura 1C). O uso de peixe-zebra mutante defeituoso em diferentes vias mitóticas demonstram a consequência de tais defeitos. Para este protocolo, Aurora B e ESCO2 mutantes foram escolhidos para ilustrar esses defeitos. Aurora B é uma cinase que é parte do complexo do cromossoma de passageiros (CPC) envolvida na formação do fuso e do acessório de microtúbulos. Ele também é necessário para a formação de clivagem sulco na citocinese 18,19. Em peixe-zebra, a deficiência de Aurora B leva a defeitos de indução sulco, citocinese, e segregação cromossomo 20. ESCO2, por outro lado, é uma acetiltransferase que é essencial para a irmã cromatídeos coesão 21,22. Ele acetila cohesin na parte SMC3 do anel estabilizando assim cohesin para garantir a segregação cromossômica adequada na transição metaphase-anaphase 23. Perda de ESCO2 no peixe-zebra leva ao chsegregação errada romosome, irmã separação prematura chromatid, instabilidade genômica e dependente de p53 e apoptose independente 24,25. Devido à disponibilidade, auroraB hi1045 e hi2865 ESCO2 peixe-zebra mutante (doravante referida como aurB m / m e ESCO2 m / m, respectivamente) será usada para ilustrar esta técnica 25-27. Acoplamento microscopia confocal com maquinaria da célula fluorescente marcado com permitiu visualizar os investigadores a cromatina e a dinâmica da membrana celular durante a mitose 25,28,29. histonas fluorescentes etiquetadas têm sido historicamente usado para visualizar cromatina. As histonas são proteínas nucleares compostas por quatro pares diferentes (H2A, H2B, H3, e H4), que são responsáveis ​​pela estrutura do nucleossoma que compõe 30 cromossomas. Enquanto H2B é indiscutivelmente a histona mais utilizado para proteínas fluorescentes emrato e a cultura de células, a utilização de Histona 2A, Z Família (H2A.F / Z) revelou-se bem para o uso em peixes-zebra 31,32. Concanavalina A e de caseína-quinase 1-gama por exemplo, localizar na membrana celular e que tenham sido previamente mostrado eficaz em visualizar a membrana celular em Drosophila e ouriços-do-mar 33,34. Outros estudos têm mostrado que a proteína fluorescente marcado com CAAX rotula a membrana celular e foi bem sucedido em peixes-zebra 31. CAAX é um motivo que é reconhecida por enzimas modificadoras de pós-traducionais tais como farnesyltransferases e geranylgeranyltransferases. Modificações por estas enzimas proteínas causar a tornar-se associada a membrana, rotulagem, assim, a membrana da célula 35. Devido ao uso prévio no peixe-zebra, este protocolo escolheu usar H2A.F / Z e CAAX para rotular cromatina e da membrana celular. A aplicação do presente método permitirá que o investigador para monitorar a mitose ao nível da célula individual ao observar cromossomadinâmica, como monitorar bem como, simultaneamente múltiplas divisões celulares que podem afetar a diferenciação e desenvolvimento do tecido. Este artigo irá se concentrar em imagiologia a dinâmica da segregação dos cromossomos durante a mitose no nível da célula individual. Dentro deste manuscrito, a capacidade de observar várias divisões mitóticas, calcular o tempo de divisão, e decifrar os fenótipos mitóticas serão ilustradas e discutidas. Ao usar estes parâmetros, fisiologicamente relevantes de dados pode ser recolhido e aplicado a vários estados de doenças afectadas por defeitos mitóticas.

<table><tbody><tr><td>pCS2 vectors</td><td>Gift from K. Kwan</td><td></td><td>For plasmid of interest</td></tr><tr><td>NotI-HF restriction enzyme</td><td>New England BioLabs</td><td>R3189S</td><td>For restriction digest of plasmid</td></tr><tr><td>mMessage SP6 kit</td><td>Life Technologies</td><td>AM1340</td><td>For &lt;em&gt;in vitro&lt;/em&gt; transcription</td></tr><tr><td>RNeasy Mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>For purifying mRNA</td></tr><tr><td>100 x 15 mm Petri dishes</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td>For housing embryos</td></tr><tr><td>microinjection mold</td><td>homemade</td><td></td><td>For holding embryos during microinjection</td></tr><tr><td>Agarose II</td><td>Amresco</td><td>0815-25G</td><td>For embedding embryos</td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521-10G</td><td>For anesthetizing embryos</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td>For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td>For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Calcium Chloride Dihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8106</td><td>For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate</td><td>Fisher Scientific</td><td>M7506</td><td>For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Methylene Blue Hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MB1</td><td>For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>100 mm culture tube</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-819-812</td><td>For melted agar</td></tr><tr><td>35 mm glass coverslip bottom culture dish&amp;nbsp;</td><td>MatTek Corp</td><td>P35G-0-20-C&amp;nbsp;</td><td>No. 0, 20 mm glass, For embedding embryos</td></tr><tr><td>#5 tweezers</td><td>Dumont</td><td>72701-D</td><td>For dechorionating embryos</td></tr><tr><td>21 G 1 1/2 gauge needle</td><td>Becton Dickinson</td><td>305167</td><td>For positioning embryos in agar</td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Nikon AZ100</td><td></td><td>For screening and embedding embryos, any dissecting scope will do</td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Nikon A1+</td><td></td><td>For time-lapse imaging</td></tr><tr><td>Confocal software</td><td>NIS Elements AR 4.13.00</td><td></td><td>For image acquisition and processing</td></tr></tbody></table>

observing mitotic division and dynamics in a live zebrafish embryo

A mitose é essencial para o crescimento do organismo e diferenciação. O processo é muito dinâmico e requer ordenou eventos para realizar a condensação adequada cromatina, o apego microtúbulos-kinetochore, segregação cromossômica, e citocinese em um pequeno período de tempo. Erros no delicado processo pode resultar em doenças humanas, incluindo defeitos de nascença e câncer. As abordagens tradicionais investigam estados de doença mitótico humanos muitas vezes dependem de sistemas de cultura celular, que não têm a fisiologia natural e contexto de desenvolvimento / específicas do tecido vantajoso quando estudar doenças humanas. Este protocolo supera muitos obstáculos, fornecendo uma forma de visualizar, com alta resolução, a dinâmica de cromossomos em um sistema de vertebrados, o peixe-zebra. Este protocolo irá detalhar uma abordagem que pode ser usada para obter imagens dinâmicas de células em divisão, que incluem: a transcrição in vitro, produção de peixe-zebra / registo, a incorporação de embrião e de imagem time-lapse. Otimização e modifications deste protocolo também são explorados. Usando H2A.F / Z-EGFP (etiquetas cromatina) e mCherry-CAAX (membrana celular etiquetas) embriões com injecção de mRNA, mitose em AB-tipo selvagem, auroraB hi1045 e hi2865 ESCO2 peixe-zebra mutante é visualizado. Alta resolução de imagem ao vivo no peixe-zebra permite observar várias mitoses quantificar estatisticamente defeitos mitóticas e tempo de progressão da mitose. Além disso, a observação de aspectos qualitativos que definem processos inadequados de mitose (ou seja, defeitos congression, segregação errada dos cromossomas, etc.) e os resultados cromossômicas imprópria (isto é, a aneuploidia, poliploidia, micronúcleos, etc.) são observados. Este ensaio pode ser aplicado para a observação de tecido diferenciação / desenvolvimento e é receptivo à utilização de peixe-zebra mutante e agentes farmacológicos. Visualização de como defeitos na mitose levar a distúrbios de câncer e de desenvolvimento será muitomelhorar o entendimento da patogênese da doença.

A Figura 2 demonstra a capacidade de observar muitas divisões celulares utilizando uma ampla visão de campo de um tipo selvagem de cauda de peixe-zebra AB. Mais de sete células mitóticas são gravadas em um prazo de 14 min (Filme 1). Dentro de duas horas tempo de curso, mais de 40 eventos de mitose foram capturados. Em média, 50 células em divisão foram observados no AB e 30 células que se dividem em AUR B M / m embri...

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Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

Mitosis is critical to every living organism and defects often lead to cancer and developmental disorders. Using this imaging protocol and zebrafish as a model system, researchers can visualize mitosis in a live vertebrate organism and the multitude of defects that arise when mitotic processes are defective.

Observando mitótico Division e Dinâmica em um embrião de peixe-zebra ao vivo

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

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12.0K visualizações.  University of Alabama at Birmingham. Mitosis is critical to every living organism and defects often lead to cancer and developmental disorders. Using this imaging protocol and zebrafish as a model system, researchers can visualize mitosis in a live vertebrate organism and the multitude of defects that arise when mitotic processes are defective.

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Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two layers of skin that enclose undifferentiated mesenchyme, and because the larval tail fin regenerates rapidly within 2-3 days. Using this system, we demonstrate a method for capturing the repair dynamics of the amputated tail fin with time-lapse video brightfield stereomicroscopy. We demonstrate that fin amputation triggers a contraction of the amputation wound and extrusion of cells around the wound margin, leading to their subsequent clearance. Fin regeneration proceeds from proximal to distal direction after a short delay. In addition, developmental growth of the larva can be observed during all stages. The presented method provides an opportunity for observing and analyzing whole tissue-scale behaviors such as fin development and growth in a simple microscope setting, which is easily adaptable to any stereomicroscope with time-lapse capabilities.

We present a protocol for capturing the dynamics of zebrafish larval tail fin regeneration on a whole-tissue scale using brightfield-based stereomicroscopy. This technique enables capturing the regeneration dynamics with single cell resolution. This methodology can be adapted to any stereomicroscope equipped with a CCD camera and time-lapse software.

Captura de Reparo de Tecidos em Zebrafish larvas com a Time-lapse Brightfield lupa estereoscópica

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Biologia do Desenvolvimento

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA mutation rates. Changes in replication timing occur during development and in cancer, but the role replication timing plays in development and disease is not known. Zebrafish were recently established as an in vivo model system to study replication timing. Here is detailed the protocols for using the zebrafish to determine DNA replication timing. After sorting cells from embryos and adult zebrafish, high-resolution genome-wide DNA replication timing patterns can be constructed by determining changes in DNA copy number through analysis of next generation sequencing data. The zebrafish model system allows for evaluation of the replication timing changes that occur in vivo throughout development, and can also be used to assess changes in individual cell types, disease models, or mutant lines. These methods will enable studies investigating the mechanisms and determinants of replication timing establishment and maintenance during development, the role replication timing plays in mutations and tumorigenesis, and the effects of perturbing replication timing on development and disease.

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Zebrafish were recently used as an in vivo model system to study DNA replication timing during development. Here is detailed the protocols for using zebrafish embryos to profile replication timing. This protocol can be easily adapted to study replication timing in mutants, individual cell types, disease models, and other species.

Sincronismo de replicação de DNA usando Zebrafish como um sistema modelo In Vivo de criação de perfil

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Genética

Ploidy Manipulation of Zebrafish Embryos with Heat Shock 2 Treatment

Manipulation of ploidy allows for useful transformations, such as diploids to tetraploids, or haploids to diploids. In the zebrafish Danio rerio, specifically the generation of homozygous gynogenetic diploids is useful in genetic analysis because it allows the direct production of homozygotes from a single heterozygous mother. This article describes a modified protocol for ploidy duplication based on a heat pulse during the first cell cycle, Heat Shock 2 (HS2). Through inhibition of centriole duplication, this method results in a precise cell division stall during the second cell cycle. The precise one-cycle division stall, coupled to unaffected DNA duplication, results in whole genome duplication. Protocols associated with this method include egg and sperm collection, UV treatment of sperm, in vitro fertilization and heat pulse to cause a one-cell cycle division delay and ploidy duplication. A modified version of this protocol could be applied to induce ploidy changes in other animal species.

A modified protocol for ploidy manipulation uses a heat shock to induce a one-cycle stall in cytokinesis in the early embryo. This protocol is demonstrated in the zebrafish but may be applicable to other species.

Manipulação de ploidia de embriões Zebrafish com choque térmico 2 Tratamento

Manipulation of ploidy allows for useful transformations, such as diploids to tetraploids, or haploids to diploids. In the zebrafish Danio rerio, ...

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. In particular, posterior body elongation is an essential process in embryonic development by which multiple tissue deformations act together to direct the formation of a large part of the body axis. In order to observe this process by long-term time-lapse imaging it is necessary to utilize a mounting technique that allows sufficient support to maintain samples in the correct orientation during transfer to the microscope and acquisition. In addition, the mounting must also provide sufficient freedom of movement for the outgrowth of the posterior body region without affecting its normal development. Finally, there must be a certain degree in versatility of the mounting method to allow imaging on diverse imaging set-ups. Here, we present a mounting technique for imaging the development of posterior body elongation in the zebrafish D. rerio. This technique involves mounting embryos such that the head and yolk sac regions are almost entirely included in agarose, while leaving out the posterior body region to elongate and develop normally. We will show how this can be adapted for upright, inverted and vertical light-sheet microscopy set-ups. While this protocol focuses on mounting embryos for imaging for the posterior body, it could easily be adapted for the live imaging of multiple aspects of zebrafish development.

Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

Um método de montagem versátil para Long Term Imagens de Desenvolvimento Zebrafish

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

Vivem de imagem do cérebro Zebrafish embrionárias por microscopia confocal

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Biologia

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling processes of excitable neuronal and muscular cells and many other biological processes, such as embryonic developmental patterning. However, there is a need for in vivo electrical activity monitoring in vertebrate embryogenesis. The advances of genetically encoded fluorescent voltage indicators (GEVIs) have made it possible to provide a solution for this challenge. Here, we describe how to create a transgenic voltage indicator zebrafish using the established voltage indicator, ASAP1 (Accelerated Sensor of Action Potentials 1), as an example. The Tol2 kit and a ubiquitous zebrafish promoter, ubi, were chosen in this study. We also explain&#160;the processes of Gateway site-specific cloning, Tol2 transposon-based zebrafish transgenesis, and the imaging process for early-stage fish embryos and fish tumors using regular epifluorescent microscopes. Using this fish line, we found that there are cellular electric voltage changes during zebrafish embryogenesis, and fish larval movement. Furthermore, it was observed that in a few zebrafish malignant peripheral nerve sheath tumors, the tumor cells were generally polarized compared to the surrounding normal tissues.

Here, we show the process of creating a cellular electric voltage reporter zebrafish line to visualize embryonic development, movement, and fish tumor cells in vivo.

Visualização da atividade elétrica celular no Zebrafish embriões adiantados e tumores

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene knockdown approaches can be utilized to examine the molecular mechanisms underlying nervous system development. Second, large clutches of developmentally synchronized embryos provide large experimental sample sizes. Third, the optical clarity of the zebrafish embryo permits researchers to visualize progenitor, glial, and neuronal populations. Although zebrafish embryos are transparent, specimen thickness can impede effective microscopic visualization. One reason for this is the tandem development of the spinal cord and overlying somite tissue. Another reason is the large yolk ball, which is still present during periods of early neurogenesis. In this article, we demonstrate microdissection and removal of the yolk in fixed embryos, which allows microscopic visualization while preserving surrounding somite tissue. We also demonstrate semipermanent mounting of zebrafish embryos. This permits observation of neurodevelopment in the dorso-ventral and anterior-posterior axes, as it preserves the three-dimensionality of the tissue.

Developmental processes such as proliferation, patterning, differentiation, and axon guidance can be readily modeled in the zebrafish spinal cord. In this article, we describe a mounting procedure for zebrafish embryos, which optimizes visualization of these events.

Dissecção e montagem lateral de embriões Zebrafish: Análise de Desenvolvimento da Medula Espinhal

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene ...

Neurociência

<meta charset="utf8"></head><body>Protocolo de microscopia de folha de luz multiview refinada para embriões de peixe-zebra

Light Sheet Microscopy Imaging and Mounting Strategies for Early Zebrafish Embryos

Light sheet microscopy has become the methodology of choice for live imaging of zebrafish embryos over long time scales with minimal phototoxicity. In particular, a multiview system, which allows sample rotation, enables imaging of entire embryos from different angles. However, in most imaging sessions with a multiview system, sample mounting is a troublesome process as samples are usually prepared in a polymer tube. To aid in this process, this protocol describes basic mounting strategies for imaging early zebrafish development between the 70% epiboly and early somite stages. Specifically, the study provides statistics on the various positions the embryos default to at the 70% epiboly and bud stages within the chorion. Furthermore, it discusses the optimum number of angles and the interval between angles required for imaging whole zebrafish embryos at the early stages of development so that cellular-scale information can be extracted by fusing the different views. Finally, since the embryo covers the entire field of view of the camera, which is required to obtain a cellular-scale resolution, this protocol details the process of using bead information from above or below the embryo for the registration of the different views.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor em destaque: Estratégias para montagem de embriões de peixe-zebra para microscopia de folha de luz multivisualização de alta resolução - técnicas para imagem

A sample preparation strategy for imaging early zebrafish embryos within an intact chorion using a light-sheet microscope is described. It analyzes the different orientations that embryos acquire within the chorion at the 70% epiboly and bud stages and details imaging strategies for obtaining cellular-scale resolution throughout the embryo using the light-sheet system.

Imagem de microscopia de folha de luz e estratégias de montagem para embriões iniciais de peixe-zebra

Light sheet microscopy has become the methodology of choice for live imaging of zebrafish embryos over long time scales with minimal phototoxicity. In ...

Observando mitótico Division e Dinâmica em um embrião de peixe-zebra ao vivo

Resumo

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Captura de Reparo de Tecidos em Zebrafish larvas com a Time-lapse Brightfield lupa estereoscópica

Sincronismo de replicação de DNA usando Zebrafish como um sistema modelo In Vivo de criação de perfil

Manipulação de ploidia de embriões Zebrafish com choque térmico 2 Tratamento

Um método de montagem versátil para Long Term Imagens de Desenvolvimento Zebrafish

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Imagem de microscopia de folha de luz e estratégias de montagem para embriões iniciais de peixe-zebra

Imagem de microscopia de folha de luz e estratégias de montagem para embriões iniciais de peixe-zebra

Imagem de microscopia de folha de luz e estratégias de montagem para embriões iniciais de peixe-zebra