Gostaríamos de agradecer ao Dr. Cashdollar Bill por seu apoio na utilização do Núcleo Citometria de Fluxo.

<ol><li> Antes de iniciar o processo, os seguintes itens precisam ser coletados e preparados: <ol style="list-style-type:lower-roman;"><li> Gelo </li><li> 15 ml tubos cônicos para as células de coloração e 12 x 75 mm para tubos de fluxo coloração controles de cor única. </li><li> Coloração buffer: tampão fosfato (PBS) + 3% de soro fetal bovino (FCS) </li><li> Pipetas </li><li> Fc bloco (se necessário) e anticorpos coloração. Anticorpos devem ser titulada para a coloração ideal. </li><li> Esferas de compensação </li><li> Buffer de suspensão: Solução de Hank salina balanceada (HBSS) + 25 mM HEPES + FCS 3% </li><li> Trypan azul e hemocitômetro </li><li> Célula filtro (40 Nylon mm) </li><li> Tubos de coleta: Dois tipos de tubos de coleta pode ser usado a) 12 x 75 mm tubos de poliestireno (contendo 300 mL FCS e 25 mM HEPES) ou b) 15 ml tubos cônicos (contendo 1 ml + 25 FCS HEPES mM). Qualquer meio rico com concentração sérica elevada pode ser utilizado para a coleta de células classificadas. </li></ol></li><li> Gerar uma suspensão única célula da população celular de partida. </li><li> Opcional: Enriqueça para a população de célula desejada por um método de purificação a granel, tais como o esgotamento de complemento ou de triagem magnética. A principal vantagem da etapa de enriquecimento é que ele reduz o tempo de classificação. </li><li> Lave as células uma vez com coloração buffer. </li><li> Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em coloração tampão com uma concentração até 50 x 10 6 para a coloração eficiente. </li><li> Opcional: Para as células expressando altos níveis de FcR, bloqueiam os receptores usando um método apropriado de bloqueio. Um método de escolha é o uso de um mAb que se liga a FcγR no gelo por 10-15 min. Estes anticorpos são disponíveis comercialmente. </li><li> Adicione o mAb apropriado (em uma concentração predeterminada) para manchar a população de células desejada e incubar por 20-30 min no gelo, no escuro, seguido de duas lavagens com tampão de coloração. Opcional: coloração com um corante vital, como o iodeto de propídio, podem ser incluídos para discernir as células mortas (5). Se multi-cor coloração é para ser usado, controles de cor única são obrigatórios. Usamos CompBeads BD para preparar controles única cor usando o protocolo do fabricante. </li><li> Se não estiver usando anticorpos conjugados diretamente, repita o passo 7 utilizando o anticorpo secundário apropriado ou o conjugado estreptavidina. </li><li> Após a lavagem, ressuspender as células em meio de cultura e determinar a concentração celular utilizando um corante vital, como Trypan azul. </li><li> Ajustar a concentração de células de 15-20 x 10 6 / ml. Para as populações de células que formam grupos, que podem entupir o instrumento durante a classificação, filtro as células através de um filtro. </li><li> Configurar e otimizar o classificador de celular. O processo de criação de um citômetro de fluxo é variado, dependendo da produção e deve ser realizada por pessoal devidamente treinado. As recomendações gerais são as seguintes: <ol style="list-style-type:lower-roman;"><li> Selecione o bico apropriado, dependendo do tipo de célula a ser classificado. </li><li> Para os tipos estéril, esterilizar o instrumento. </li><li> Executar o controle de instrumento de qualidade com contas para verificar lasers estão funcionando, e é classificar com precisão. </li><li> Instalar o dispositivo de coleta necessárias e configurar os fluxos lado. </li><li> Olhe para o instrumento a laser e detector constituída para apurar as etiquetas fluorescentes que podem ser usados ​​(o nosso BD FACS Aria tem três lasers e pode detectar até nove cores). </li><li> Uma vez que é determinado o que etiquetas fluorescentes serão usados ​​no classificador de celular, a compensação pode ser realizada (conforme explicado abaixo). </li></ol></li><li> Efetuar a compensação usando a amostra de controle negativo e os controles único positivo. Compensação é necessário remover a sobreposição de espectro entre dois detectores. É pertinente observar que a compensação não é infalível e é prejudicada pela forma como brilhantemente certos marcadores mancha, e por fluorescência das células que têm autofluorescência baixa, o que pode levar à baixa resolução entre as populações dim e negativos. Para melhores resultados, o projeto experimental deve incluir o uso de fluorocromos brilhante com marcadores que têm baixa expressão ou que não têm um padrão de coloração conhecidas. Marcadores que proporcionam uma boa separação entre as populações de células e são altamente expressa deve ser usado com fluorocromos dímero como aqueles animado com lasers vermelho ou violeta. <ol style="list-style-type:lower-roman;"><li> Compensação pode ser realizada com esferas de compensação, que são micropartículas de poliestireno que foram acopladas a um anticorpo específico para a cadeia leve Kappa de Ig de camundongo, rato, ou o rato / hamster. As contas são fáceis de manchar, tem um sinal robusto e fornecer uma maneira fácil de preparar único controles que têm manchado o fluoróforo mesmo que as amostras experimentais. </li><li> Criar um modelo que inclui uma trama bivariada para mostrar dispersão para a frente (FSC) e dispersão lateral (SSC), e um histograma paracada fluorocromo que será usado. </li><li> Executar o tubo de controle negativo e ajustar a dispersão para a frente (FSC) e dispersão lateral (SSC) para colocar a população de interesse na escala. </li><li> Ajustar as configurações PMT fluorescência para colocar a população negativa ou autofluorescência na parte de mão à esquerda do histograma. </li><li> Registro do tubo de controle negativo. </li><li> Execute o único tubos de controle positivo e gravar os dados de cada tubo. </li><li> Desenhe um portão de intervalo em torno da parte positiva dos dados no histograma, e outro portão intervalo na parte negativa do histograma. </li><li> Compensação manual é feito através do ajuste da mediana (mediana é uma melhor estimativa de tendência central que a média em uma escala logarítmica) dos aspectos positivos até que seja igual à mediana dos negativos. Isso deve ser feito para cada um dos rótulos fluorocromo utilizado no experimento. </li><li> Para ajustar a mediana, ajustar os valores espectrais de sobreposição maior ou menor até que as medianas para cada jogo parâmetro fluorescente, tanto quanto possível. </li><li> Compensação também pode ser feito automaticamente com o software de análise. Compensação automática utiliza os dados gravados a partir de controles de compensação para calcular uma matriz algébrica para todos os fluoróforos usados ​​no experimento. Estes valores são usados ​​para subtrair as contribuições das cores não primárias que estão sangrando no detector uma cor primária. </li></ol></li><li> Registro da amostra experimental a ser classificada e utilizar ferramentas e métodos de propagação subsetting para definir as populações de interesse. <ol style="list-style-type:lower-roman;"><li> Configurar o modelo experimental com um gráfico de pontos que exibe FSC versus SSC e usar uma ferramenta de propagação, polígono, retângulo intervalo, ou quadrante ao portão da população de interesse. O gráfico de dispersão mostra as propriedades físicas da célula que é diferente para o tipo de célula. </li><li> A melhor maneira de determinar a estratégia de propagação de fluorescência é a utilização de fluorescência menos um (FMO) controles. Em um tubo de controle de FMO todos os reagentes que são usados ​​no experimento estão incluídos, exceto para o de interesse. A FMO ajuda a discriminar entre populações vagamente manchada e ampla populações negativas. </li><li> Use os dados gravados a partir de tubos FMO para determinar onde colocar portas no interior do tubo experimental. </li></ol></li><li> Uma vez que portões foram determinados, os portões podem ser selecionados para a classificação em tubos de coleta externa. Até quatro portas (ou populações) podem ser classificados de uma só vez, dependendo da instrumentação disponível. </li><li> Executar o tubo de amostra experimental a 4 ° C, ligar placas de deflexão, e classificar a amostra. 5 x 10 5 -1,5 x 10 6 células podem ser classificadas em um tubo de 12 mm x 75 e 1,5 x 10 6 - 4.5 x 10 6 células podem ser classificadas em a 15 ml. </li><li> Uma vez que o número necessário de células foi obtida, manualmente parar de classificação. </li><li> Realizar uma análise pós-classificação para determinar a pureza das populações de células classificadas. </li></ol> Resultados representativos Nós temos mostrado aqui resultados para B do mouse esplênica e classificação de células CD4 T (Figura 1). Esplenócitos foram coradas com PE Texas Red-conjugado anti-rato-B220, FITC-conjugado TCRβ anti-rato e Alexafluor-700-conjugado anti-CD4 do mouse para identificar as células B (B220 + TCRβ) e CD4 células T (CD4 + + TCRβ ). A classificação foi realizada com instrumento Aria BD FACS. Após a triagem a pureza de células B foi&gt; 97% e as células T CD4 pureza foi&gt; 98%. <img src="/files/ftp_upload/1546/1546fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Pureza de células B do baço e os linfócitos T CD4 células após FACS. Esplenócitos de camundongos foram corados com anti-rato B220, TCRβ e anticorpos CD4. FACS para as células B foi realizada utilizando uma BD FACS Aria pela passagem em B220 + TCRβ células (Fig. 1A, painel esquerdo, quadrante inferior direito). Uma análise pós espécie foi realizada para determinar a pureza das células B (Fig. 1A, painel direito). Coloração B220 é mostrado no eixo-x e coloração TCRβ sobre o eixo-y. FACS para as células T CD4 foi realizada utilizando o citômetro de fluxo mesmo pela passagem em TCRβ + células CD4 + (Figura 1B, painel esquerdo, no quadrante superior direito). Uma análise pós espécie foi realizada para determinar a pureza das células CD4 T (Fig. 1B, painel direito). Coloração TCRβ é mostrado no eixo-x e CD4 coloração no eixo-y. As células positivas por cento em cada quadrante é mostrado. <!--<img src="/files/ftp_upload/1546/1546fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Pureza de CD4 células T esplênicas após FACS. Murino células T esplênicas foram enriquecidas pela remoção de células B por panning. Posteriormente, as células foram marcadas com anti-rato TCRβ e anticorpos CD4 (painel esquerdo). FACS foi realizada utilizando uma BD FACS Aria pela passagem em TCRβ + células CD4 + (painel esquerdo, superior direito Quadrformiga). Uma análise pós espécie foi realizada para determinar a pureza das células T, que foi maior que 99% (painel direito). Coloração TCRβ é mostrado no eixo-x e CD4 coloração no eixo-y. As células positivas por cento em cada quadrante é mostrado. -&gt;

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	<li>Herzenberg, L. A., De Rosa, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+and+the+FACS:+complementary+tools+for+immunobiology+and+medicine.">Monoclonal antibodies and the FACS: complementary tools for immunobiology and medicine.</a> Immunol Today. 21, 383-390 (2000).</li><li>Givan, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Flow cytometry first principles. , 273-273 (2001).</li><li>Hewitt, Z., Forsyth, N. R., Waterfall, M., Wojtacha, D., Thomson, A. J., McWhir, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-activated+single+cell+sorting+of+human+embryonic+stem+cells.">Fluorescence-activated single cell sorting of human embryonic stem cells.</a> Cloning Stem Cells. 8, 225-234 (2006).</li><li>Walker, A., Parkhill, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+genomics.">Single-cell genomics.</a> Nat Rev Microbiol. 6, 176-177 (2008).</li><li>Sorensen, T. U., Gram, G. J., Nielsen, S. D., Hansen, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safe+sorting+of+GFP-transduced+live+cells+for+subsequent+culture+using+a+modified+FACS+vantage.">Safe sorting of GFP-transduced live cells for subsequent culture using a modified FACS vantage.</a> Cytometry. 37, 284-290 (1999).</li><li>Diamond, R. A., DeMaggio, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> In living color: Protocols in flow cytometry and cell sorting. , 800-800 (2000).</li><li>Karabinus, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+sorting+of+human+sperm:+MicroSort+clinical+trial+update.">Flow cytometric sorting of human sperm: MicroSort clinical trial update.</a> Theriogenology. 71, 74-79 (2009).</li><li>Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seventeen-colour+flow+cytometry:+unravelling+the+immune+system.">Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system.</a> Nat Rev Immunol. 4, 648-655 (2004).</li><li>Herzenberg, L. A., Tung, J., Moore, W. A., Parks, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpreting+flow+cytometry+data:+a+guide+for+the+perplexed.">Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed.</a> Nat Immunol. 7, 681-685 (2006).</li><li>Tung, J. W., Heydari, K., Tirouvanziam, R., Sahaf, B., Parks, D. R., Herzenberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modern+flow+cytometry:+a+practical+approach.">Modern flow cytometry: a practical approach.</a> Clin Lab Med. 27, 453-468 (2007).</li></ol>

FACS é uma técnica altamente sofisticada para purificar populações celulares de interesse, em que uma pureza muito alta (95-100%) da população classificada pode ser obtida. Portanto, essa técnica é particularmente importante para os experimentos, onde de alta pureza é um requisito essencial (análise de microarray, por exemplo). FACS é particularmente vantajoso em relação a outros métodos disponíveis de purificação, quando uma população de células precisa ser purificada com base em um marcador de superfície semanal expressa ou quando duas ou mais populações precisam ser purificados, que têm diferentes níveis de expressão do marcador mesma superfície. Por exemplo, a purificação da zona marginal células B (B220 + CD21 oi CD23 int / baixo) e B folicular de células (B220 + CD21 int / baixa CD23 oi) com base em níveis de expressão de CD21 e CD23. Outra aplicação crescente de classificação FACS é única célula permitindo a análise de células individuais (3, 4). FACS também é comumente usado para classificar as células que expressam proteínas fluorescentes que são geneticamente expressa, como o verde proteínas proteína fluorescente etiquetados (5). Se uma espécie estéril é realizada as células podem ser cultivadas. No entanto, a viabilidade celular ea produção pode ser comprometida durante a classificação. Viabilidade pode ser melhorada usando uma temperatura da célula-dependente ideal para a classificação e processamento de tubos de coleta imediatamente após atingir a capacidade. Recuperação pode ser aumentado usando tubos de coleta de polipropileno, coletando células classificadas no soro de mídia rica e tubos de coleta invertendo de forma intermitente, mantendo-se tubos de coleta a uma temperatura ideal e centrifugação células classificadas para ~ 10 min (http://cyto.mednet.ucla.edu / Protocol.htm). O desenvolvimento de ultra-alta velocidade classificadores ampliou a possibilidade da aplicação da filtragem de fluidos em ambientes clínicos. As aplicações potenciais incluem FACS clínica de purificação de células-tronco do sangue do sangue humano para fins terapêuticos, as aplicações na terapia do câncer, a reposição de amniocentese, a classificação do esperma humano e detecções precoce da doença (6, 7). Para a coloração multicolor, a seleção de anticorpos é uma etapa crítica e fluorocromos são escolhidos com base no sistema de detecção para cada instrumento particular. Há um número de empresas que vendem celulares e classificadores a configuração do laser varia de acordo com as necessidades do usuário. Assim não se pode simplesmente usar os anticorpos exatamente o mesmo utilizado em estudos publicados sem confirmar a compatibilidade. Para seleção de anticorpos ideal, deve-se considerar o nível de expressão da proteína que está sendo examinado. Em geral, o mais brilhante disponíveis anticorpos fluorocromo-tag deve ser usado para manchar marcadores de superfície vagamente expressos, enquanto fluorocromos dim pode ser usado para a coloração de marcadores de superfície altamente expresso (8). Além disso, os anticorpos devem ser selecionados de tal forma que se sobrepõem entre seus espectros de emissão é mínima. Para a coloração multicolor, é extremamente difícil escolher fluorocromo que não têm sobreposição espectral. Nesta situação, a compensação é realizada. Compensação é necessário matematicamente eliminar a sobreposição entre o espectro de fluorescência emissões dos vários fluorocromos que é mensurável pelos detectores (8-10). Em outras palavras, a sobreposição de fluorescência de um fluorocromo é subtraído do espectro de emissão de outro fluorocromo. O cálculo da compensação requer um controle sem mácula e única controles positivos para cada fluorocromo usado para uma coloração multicolor (9, 10). Compensação pode ser realizada utilizando células ou grânulos. As contas são fáceis de manchar, tem um sinal robusto e fornecer uma maneira fácil de preparar único controles que têm manchado a fluoróforos mesmo que as amostras experimentais. Contas de compensação são particularmente vantajoso quando a proteína de superfície de células de interesse é expressa em um nível baixo e quando a população de células de interesse é limitante na população de células iniciais de partida. Uma vez que os anticorpos foram escolhidos, sua atividade deve ser otimizado através da realização de uma análise de titulação. Isto é particularmente importante se a máquina tem FACS lasers altamente poderoso. O uso de concentrações de anticorpos suboptimal coloração pode resultar na separação pobres da população de células desejado a partir da população celular total. O uso da concentração dos anticorpos alta aumenta a chance para a coloração de antígenos não-específicas. Portanto, a titulação de anticorpos permitirá a seleção da concentração de anticorpos que dá o brilho máximo da população positiva e coloração de fundo mínima (8). FACS é agora uma técnica padrão para a purificação de subpopulações de células. Ela pode ser usada para separar qualquer tipo de célula em que uma suspensão única célula pode ser gerado e anticorpos estão disponíveis para identificar a população de células desejado. FACS é o método de escolha quando highly populações celulares puras são obrigatórios.

purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (facs)

Estudos experimentais e clínicos muitas vezes exigem altamente purificada populações de células. FACS é uma técnica de escolha para purificar populações de células de fenótipo conhecido. Métodos granel outras de purificação incluem esgotamento complemento panning, e separação grânulo magnético. No entanto, FACS tem várias vantagens sobre outros métodos disponíveis. FACS é o método preferido quando a pureza muito elevada da população desejada é necessário, quando a população de células-alvo expressa um nível muito baixo do marcador de identificação ou quando as populações de células requerem a separação com base na densidade marcador diferencial. Além disso, FACS é a única técnica de purificação disponíveis para isolar as células com base na coloração interna ou a expressão da proteína intracelular, como um marcador de proteína geneticamente modificados fluorescentes. FACS permite a purificação de células individuais com base na granularidade tamanho, e fluorescência. A fim de purificar as células de interesse, são marcadas com fluorescência primeiro-tagged anticorpos monoclonais (mAb), que reconhecem marcadores de superfície específicos sobre a população de células desejado (1). Seleção negativa das células imaculada também é possível. Purificação FACS requer um citômetro de fluxo com a classificação da capacidade e do software apropriado. Para FACS, células em suspensão são passados ​​como um fluxo em gotas com cada uma contendo uma única célula na frente de um laser. O sistema de detecção de fluorescência detecta células de interesse com base em parâmetros pré-determinados fluorescentes das células. O instrumento aplica uma carga para a gota contendo uma célula de interesse e um sistema de deflexão eletrostática facilita a coleta das gotas cobrados em tubos de recolha apropriado (2). O sucesso da coloração e, assim, a classificação depende muito da seleção dos marcadores identificação e escolha de mAb. Parâmetros de classificação pode ser ajustada dependendo da exigência de pureza e rendimento. Embora FACS requer equipamento especializado e treinamento de pessoal, é o método de escolha para o isolamento de populações de células altamente purificado.

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Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Para muitos estudos científicos que requerem uma análise biológica e química de populações de células as células devem estar em um alto estado de pureza. Separação de células ativadas por fluorescência (FACS) é um método superior para a obtenção de populações celulares puras.

Purificação da população de células específicas de separação de células de fluorescência Ativado (FACS)

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

72.5K visualizações.  BloodCenter of Wisconsin. Para muitos estudos científicos que requerem uma análise biológica e química de populações de células as células devem estar em um alto estado de pureza. Separação de células ativadas por fluorescência (FACS) é um método superior para a obtenção de populações celulares puras.

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Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions. In particular, molecular approaches such as real-time PCR and microarray analysis require the isolation of cell populations with high purity. Commonly used purification strategies include fluorescent activated cell sorting (FACS), magnetic bead separation and complement depletion. Of the three strategies, complement depletion offers the advantages of being fast, inexpensive, gentle on the cells and a high cell yield. The complement system is composed of a large number of plasma proteins that when activated initiate a proteolytic cascade culminating in the formation of a membrane-attack complex that forms a pore on a cell surface resulting in cell death1. The classical pathway is activated by IgM and IgG antibodies and was first described as a mechanism for killing bacteria. With the generation of monoclonal antibodies (mAb), the complement cascade can be used to lyse any cell population in an antigen-specific manner. Depletion of cells by the complement cascade is achieved by the addition of complement fixing antigen-specific antibodies and rabbit complement to the starting cell population. The cells are incubated for one hour at 37&deg;C and the lysed cells are subsequently removed by two rounds of washing. MAb with a high efficiency for complement fixation typically deplete 95-100% of the targeted cell population. Depending on the purification strategy for the targeted cell population, complement depletion can be used for cell purification or for the enrichment of cell populations that then can be further purified by a subsequent method.

To effectively study the function of immune cell populations their purification is often required. Complement depletion is a fast and inexpensive technique for the isolation of immune cell populations with high purity.

Esgotamento das populações de células específicas de Esgotamento Complemento

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions.  In particular, molecular approaches such as ...

Imunologia e Infecção

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully generated and infused T-cells specific for Epstein Barr virus (EBV), cytomegalovirus (CMV) and Adenovirus (Adv) using monocytes and EBV-transformed lymphoblastoid cell (EBV-LCL) gene-modified with an adenovirus vector as antigen presenting cells (APCs). As few as 2x105/kg trivirus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) proliferated by several logs after infusion and appeared to prevent and treat even severe viral disease resistant to other available therapies. The broader implementation of this encouraging approach is limited by high production costs, complexity of manufacture and the prolonged time (4-6 weeks for EBV-LCL generation, and 4-8 weeks for CTL manufacture &#x2013; total 10-14 weeks) for preparation. To overcome these limitations we have developed a new, GMP-compliant CTL production protocol. First, in place of adenovectors to stimulate T-cells we use dendritic cells (DCs) nucleofected with DNA plasmids encoding LMP2, EBNA1 and BZLF1 (EBV), Hexon and Penton (Adv), and pp65 and IE1 (CMV) as antigen-presenting cells. These APCs reactivate T cells specific for all the stimulating antigens. Second, culture of activated T-cells in the presence of IL-4 (1,000U/ml) and IL-7 (10ng/ml) increases and sustains the repertoire and frequency of specific T cells in our lines. Third, we have used a new, gas permeable culture device (G-Rex) that promotes the expansion and survival of large cell numbers after a single stimulation, thus removing the requirement for EBV-LCLs and reducing technician intervention. By implementing these changes we can now produce multispecific CTL targeting EBV, CMV, and Adv at a cost per 106 cells that is reduced by &gt;90%, and in just 10 days rather than 10 weeks using an approach that may be extended to additional protective viral antigens. Our FDA-approved approach should be of value for prophylactic and treatment applications for high risk allogeneic HSCT recipients.

A rapid, simple and cost-effective protocol for the generation of donor-derived multivirus-specific CTLs (rCTL) for infusion to allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients at risk of developing CMV, Adv or EBV infections. This manufacturing process is GMP-compliant and should ensure the broader implementation of T-cell immunotherapy beyond specialized centers.

Geração de células T específicas Multivirus para Prevenir / tratar infecções virais após transplante de células-tronco hematopoéticas alogênico

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

Classificação de células activadas por fluorescência Para a purificação de células dendríticas plasmocitï¿½des do rato de Medula Óssea

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, cloning TCRs specific for various tumor-associated antigens has been the goal of many studies. To elicit an effective T cell response, the TCR must recognize the target antigen with optimal affinity. However, cloning such TCRs has been a challenge and many available TCRs possess sub-optimal affinity for the cognate antigen. In this protocol, we describe a method of cloning de novo high affinity antigen-specific TCRs using existing TCRs by exploiting hemichain centricity. It is known that for some TCRs, each TCR&#945; or TCR&#946; hemichain do not contribute equally to antigen recognition, and the dominant hemichain is referred to as the centric hemichain. We have shown that by pairing the centric hemichain with counter-chains differing from the original counter-chain, we are able to maintain the antigen specificity, while modulating its interaction strength for the cognate antigen. Thus, the therapeutic potential of a given TCR can be improved by optimizing the pairing between the centric and counter hemichains.

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Herein we describe a novel method to generate antigen-specific T cell receptors (TCRs) by pairing the TCR&#945; or TCR&#946; of an existing TCR, possessing the antigen-specificity of interest, with complementary hemichain of the peripheral T cell receptor repertoire. The de novo generated TCRs retain antigen-specificity with varying affinity.

Gerando<em&gt; De Novo</em&gt; Antígeno-específica T Humano receptores celulares por Transdução retroviral de Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) cycles between a tsetse vector and a mammalian host. It evades the mammalian host immune system by periodically switching the dense, variant surface glycoprotein (VSG) that covers its surface. The detection of antigenic variation in Trypanosoma brucei can be both cumbersome and labor intensive. Here, we present a method for quantifying the number of parasites that have 'switched' to express a new VSG in a given population. The parasites are first stained with an antibody against the starting VSG, and then stained with a secondary antibody attached to a magnetic bead. Parasites expressing the starting VSG are then separated from the rest of the population by running the parasites over a column attached to a magnet. Parasites expressing the dominant, starting VSG are retained on the column, while the flow-through contains parasites that express a new VSG as well as some contaminants expressing the starting VSG. This flow-through population is stained again with a fluorescently labeled antibody against the starting VSG to label contaminants, and propidium iodide (PI), which labels dead cells. A known number of absolute counting beads that are visible by flow cytometry are added to the flow-through population. The ratio of beads to number of cells collected can then be used to extrapolate the number of cells in the entire sample. Flow cytometry is used to quantify the population of switchers by counting the number of PI negative cells that do not stain positively for the starting, dominant VSG. The proportion of switchers in the population can then be calculated using the flow cytometry data.

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

African trypanosomes grown in vitro undergo antigenic variation at a low rate, such that populations are made up of parasites expressing a dominant variant surface glycoprotein (VSG) type and a small population of "switched" variants. This protocol describes a fast method for detecting and quantifying these populations.

detecção de<em&gt; Trypanosoma brucei</em&gt; Switching Variant glicoproteína de superfície por Magnetic celular ativado Seleção e citometria de fluxo

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) ...

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial and temporal resolution. FCS can quantify the molecular concentration and diffusion coefficient of fluorescently labeled molecules in the cell membrane. This technique has the ability to explore the molecular diffusion characteristics of molecules in the plasma membrane of immune cells in steady state (i.e., without processes affecting the result during the actual measurement time). FCS is suitable for studying the diffusion of proteins that are expressed at levels typical for most endogenous proteins. Here, a straightforward and robust method to determine the diffusion rate of cell membrane proteins on primary lymphocytes is demonstrated. An effective way to perform measurements on antibody-stained live cells and commonly occurring observations after acquisition are described. The recent advancements in the development of photo-stable fluorescent dyes can be utilized by conjugating the antibodies of interest to appropriate dyes that do not bleach extensively during the measurements. Additionally, this allows for the detection of slowly diffusing entities, which is a common feature of proteins expressed in cell membranes. The analysis procedure to extract molecular concentration and diffusion parameters from the generated autocorrelation curves is highlighted. In summary, a basic protocol for FCS measurements is provided; it can be followed by immunologists with an understanding of confocal microscopy but with no other previous experience of techniques for measuring dynamic parameters, such as molecular diffusion rates.

A method to measure protein diffusion in membranes of primary immune cells using fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is described. In this paper, the use of antibodies for fluorescent labeling is illustrated.

Difusão molecular em membranas plasmáticas de linfócitos primários medida por fluorescência Correlation Spectroscopy

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...

Generation of Large Numbers of Myeloid Progenitors and Dendritic Cell Precursors from Murine Bone Marrow Using a Novel Cell Sorting Strategy

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have recently been recognized to be more heterogeneous than previously appreciated. These cultures routinely contain moDC as well monocyte-derived macrophages (moMac), and even some less developed cells such as monocytes. The goal of this protocol is to provide a consistent method for identification and separation of the many cell types present in these cultures as they develop, so that their specific functions may be further investigated. The sorting strategy presented here separates cells first into four populations based on expression of Ly6C and CD115, both of which are expressed transiently by cells as they develop in GM-CSF-driven culture. These four populations include Common myeloid progenitors or CMP (Ly6C-, CD115-), granulocyte/macrophage progenitors or GMP (Ly6C+, CD115-), monocytes (Ly6C+, CD115+), and monocyte-derived macrophages or moMac (Ly6C-, CD115+). CD11c is also added to the sorting strategy to distinguish two populations within the Ly6C-, CD115- population: CMP (CD11c-) and moDC (CD11c+). Finally, two populations may be further distinguished within the Ly6C-, CD115+ population based on the level of MHC class II expression. MoMacs express lower levels of MHC class II, while a monocyte-derived DC precursor (moDP) expresses higher MHC class II. This method allows for the reliable isolation of several developmentally distinct populations in numbers sufficient for a variety of functional and developmental analyses. We highlight one such functional readout, the differential responses of these cell types to stimulation with Pathogen-Associated Molecular Patterns (PAMPs).

Here we provide a method for identifying and isolating large numbers of GM-CSF driven myeloid cells using high speed cell sorting. Five distinct populations (Common myeloid progenitors, granulocyte/macrophage progenitors, monocytes, monocyte-derived macrophages, and monocyte-derived DCs) can be identified based on Ly6C and CD115 expression.

Geração de um grande número de progenitores mieloides e células dendríticas precursores de murino medula óssea usando um celular romance classificação estratégia

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have ...

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with histones and antimicrobial proteins. Excessive NET formation (NETosis) and citH3 release during sepsis is associated with multiple organ dysfunction and mortality in mice and humans but its implications in dogs are unknown. Herein, we describe a technique to isolate canine neutrophils from whole blood for observation and quantification of NETosis. Leukocyte-rich plasma, generated by dextran sedimentation, is separated by commercially available density gradient separation media and granulocytes collected for cell count and viability testing. To observe real-time NETosis in live neutrophils, cell permeant and cell impermeant fluorescent nucleic acid stains are added to neutrophils activated either by lipopolysaccharide (LPS) or phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA). Changes in nuclear morphology and NET formation are observed over time by fluorescence microscopy. In vitro NETosis is further characterized by co-colocalization of cell-free DNA (cfDNA), myeloperoxidase (MPO) and citrullinated histone H3 (citH3) using a modified double-immunolabelling protocol. To objectively quantify NET formation and citH3 expression using fluorescence microscopy, NETs and citH3-positive cells are quantified in a blinded manner using available software. This technique is a specific assay to evaluate the in vitro capacity of canine neutrophils to undergo NETosis.

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

We describe methods to isolate canine neutrophils from whole blood and visualize NET formation in live neutrophils using fluorescence microscopy. Also described are protocols to quantify NET formation and citrullinated histone H3 (citH3) expression using immunofluorescence microscopy.

In Vitro Formação canina neutrófilos extracelular armadilha: Análise dinâmica e quantitativa por microscopia de fluorescência

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling and cellular processes that control efferocytosis. This quantification can be difficult to perform as apoptotic cells are often efferocytosed piecemeal, thus necessitating methods which can accurately delineate between the efferocytosed portion of an apoptotic target versus residual unengulfed cellular fragments. The approach outlined herein utilizes dual-labeling approaches to accurately quantify the dynamics of efferocytosis and efferocytic capacity of efferocytes such as macrophages. The cytosol of the apoptotic cell is labeled with a cell-tracking dye to enable monitoring of all apoptotic cell-derived materials, while surface biotinylation of the apoptotic cell allows for differentiation between internalized and non-internalized apoptotic cell fractions. The efferocytic capacity of efferocytes is determined by taking fluorescent images of live or fixed cells and quantifying the amount of bound versus internalized targets, as differentiated by streptavidin staining. This approach offers several advantages over methods such as flow cytometry, namely the accurate delineation of non-efferocytosed versus efferocytosed apoptotic cell fractions, the ability to measure efferocytic dynamics by live-cell microscopy, and the capacity to perform studies of cellular signaling in cells expressing fluorescently-labeled transgenes. Combined, the methods outlined in this protocol serve as the basis for a flexible experimental approach that can be used to accurately quantify efferocytic activity and interrogate cellular signaling pathways active during efferocytosis.

Efferocytosis, the phagocytic removal of apoptotic cells, is required to maintain homeostasis and is facilitated by receptors and signaling pathways that allow for the recognition, engulfment, and internalization of apoptotic cells. Herein, we present a fluorescence microscopy protocol for the quantification of efferocytosis and the activity of efferocytic signaling pathways.

Quantificação de Efferocytosis por microscopia de fluorescência de célula única

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using the analysis of cell membrane receptor clusters as a model, we present a detailed protocol for this image analysis task using Fiji (ImageJ) and Matlab routines to: 1) define regions of interest and design masks adapted to these regions; 2) track the particles in fluorescence microscopy videos; 3) analyze the diffusion and intensity characteristics of selected tracks. The quantitative analysis of the diffusion coefficients, types of motion, and cluster size obtained by fluorescence microscopy and image processing provides a valuable tool to objectively determine particle dynamics and the consequences of modifying environmental conditions. In this article we present detailed protocols for the analysis of these features. The method described here not only allows single-molecule tracking detection, but also automates the estimation of lateral diffusion parameters at the cell membrane, classifies the type of trajectory and allows complete analysis thus overcoming the difficulties in quantifying spot size over its entire trajectory at the cell membrane.

Here, we present a protocol for single particle tracking image analysis that allows quantitative evaluation of diffusion coefficients, types of motion and cluster sizes of single particles detected by fluorescence microscopy.

Processamento de imagem protocolo para análise de difusão e o tamanho do Cluster de receptores de membrana por microscopia de fluorescência

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using ...