Name: quantitative real-time pcr using the thermo scientific solaris qpcr assay
Uploaded: 2010-06-17T17:04:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay at JoVE.com

1. A Thermo Scientific Solaris qPCR Algorithm Design de Ensaio <ol><li> O algoritmo usado no projeto de Solaris qPCR sonda / primer pares ajusta o Tm de cada componente permitindo assim condições de ciclismo universal. Incorporação do MGB, ou menor ligação groove, metade na sonda aumenta o Tm e permite sondas mais curto para ser projetado para uma maior flexibilidade de ensaio e performance. Como seu nome sugere, MGBs são uma classe de antibióticos que podem se encaixar no sulco menor da dupla hélice do DNA. MGBs são anexados ao final 3 ou 5 de uma sonda de DNA. Em solução, a fluorescência repórter FAM da sonda se apaga por Eclipse Refrescante Dark. Quando a sonda se liga a uma seqüência alvo, a mudança resultante em conformação a sonda s 3-D permite que um forte sinal fluorescente. Ligação da sonda de DNA para seqüência alvo é estabilizado pelo MGB, que permite o uso de altamente específicas, as sondas mais curtos, mantendo a temperatura de fusão apropriado para PCR. Assim, a detecção do sinal ocorre durante a fase de recozimento de amplificação do alvo. Durante a etapa de extensão, a sonda MGB desassocia ea fluorescência é novamente apagado. Porque a sonda desassocia, ela não afeta a eficiência da PCR. </li><li> Outra característica do algoritmo Solaris é o uso de Superbases. Superbases são modificados bases que têm maior capacidade de ligação para melhorar a estabilidade da AT títulos e eliminar GG auto-associação em guanina seqüências ricas. Além disso, eles não saciar fluoróforos adjacentes conectado no terminal 5. Estas bases são seletivamente colocada, de acordo com o algoritmo, para expandir a disponibilidade de seqüências-alvo. Isto torna possível a utilização de seqüências, tais como as regiões GC ricos, que poderiam ser evitados na elaboração de primers e sondas. </li><li> Sempre que possível, o algoritmo Solaris incorpora regiões junção exon abrangendo no site de destino. Isso aumenta a especificidade, evitando a amplificação do DNA genômico contaminante. </li><li> Importante, o algoritmo também identifica uma seqüência consenso para todas as variantes conhecidas de emenda, de modo que todos estão cobertos por uma única sonda / set primer. Assim, apenas um ensaio é necessário para um determinado gene de interesse. </li><li> Finalmente, o Solaris qPCR algoritmo projeto Ensaio utiliza parâmetros muito rigorosos para considerações de design críticas, incluindo o conteúdo GC, comprimento, Tm, e trechos de nucleotídeos homogênea. As seqüências resultantes são analisados ​​para a especificidade BLAST usando três diferentes bases de dados: genômica, transcrição e pseudogene. </li></ol> 2. Obtenção Solaris Reagentes <ol><li> Para obter o apropriado Solaris reagentes, visite <a href="http://dharmacon.com">www.thermo.com / solaris</a> </li><li> Uma vez no site clique em &quot;Pesquisar Produto GENEius&quot;. Para ir diretamente para a busca de produtos GENEius, vá para <a href="http://www.dharmacon.com/catalogsearch/consolidatedsearch.aspx">www.thermo.com / SolarisSearch</a> </li><li> Clique na caixa de pesquisa de pesquisa e escolha do organismo de destino apropriado. </li><li> A pesquisa de produtos GENEius pode processar muitos identificadores gene diferente. Aqui, entrar em um dos termos de pesquisa sugeriram para encontrar o gene de interesse, incluindo Ref Seq de Adesão, a identificação do gene, o Symbol Gene, uma descrição do Gene, o ID Sanger ou número de Adesão, ou um número de catálogo. Em seguida, clique em &quot;Pesquisar&quot;. </li><li> Identificar o gene de interesse e clique em &quot;Select&quot; no lado esquerdo. Isto irá abrir uma janela que mostra os diferentes produtos Thermo Scientific disponíveis para o gene de interesse. Em &quot;Produtos&quot; selecione a opção &quot;Detecção de qPCR&quot; Tab. </li><li> Sob o título &quot;Ensaio Expressão Gênica Solaris&quot; título, você vai ver um bem concebido Solaris sonda / ensaio primer. Este ensaio vai cobrir uma emenda todas as variantes conhecidas de seu alvo gene. Escolha a quantidade desejada. Eles estão disponíveis em 100, 200, 400 e 1000 X 25 mL reações (se o ensaio é identificado como made-to-order, o tamanho do pacote de 100 não estará disponível). Clique em &quot;Add to Cart&quot;. </li><li> Em seguida, selecione o master mix apropriado para o termociclador que será usado. Para determinar qual master mix vai funcionar melhor com a máquina disponível, clique em &quot;Saiba quais Mix Master funciona melhor com o seu Cycler PCR!&quot; </li><li> Encontre o cycler qPCR que será usado no menu para determinar quais mix de usar. </li><li> Retornar à janela de busca de produtos GENEius, e selecione o master mix apropriado. O master mix vem em 100, 200, 400 e 1000 tamanhos reação. Clique em &quot;Add to Cart&quot;. </li><li> Genes de referência propostos e kits verso cDNA síntese também pode ser encomendado para uma análise completa qRT-PCR. </li><li> Quando os reagentes Solaris qPCR chegam, armazená-los a -20 ° C até que esteja pronto para uso. Os seguintes reagentes devem ser recebidos: Uma solução de 20X, contendo dois primers fornecidos a 800 nM cada e uma sonda gene específico previsto em 200 nm, sequinformações de referência para ambos os sonda e os primers e qPCR Gene Solaris Mix Master Expressão em uma concentração 2X. Solaris qPCR Ensaios Expressão Gênica são estáveis ​​por um período mínimo de 12 meses. Evite congelar repetido descongelamento. </li></ol> 3. qPCR configuração <ol><li> Iniciar o protocolo de qPCR com cDNA. RNA total deve ser extraído usando um método de coluna de spin. A Thermo Scientific Verso kit síntese de cDNA é recomendado para transcrição reversa para gerar cDNA. </li><li> Prepare-se para qPCR por descongelar os primers, sondas e master mix no gelo. Também tem em mãos PCR água grau e opaco placas qPCR branco, o que pode melhorar a sensibilidade do PCR em tempo real. </li><li> A mistura mestre contém todos os componentes para PCR em tempo real, incluindo: 1) DNA polimerase Thermo-Start, uma versão hot-início da DNA polimerase Thermoprime. Este tipo de polimerase é utilizada para prevenir não-específico de amplificação durante a reação, configurar e requer etapa de ativação de 95 ° C min 15. 2) dNTPs na mistura Mestre Solaris, dTTP substitui dUTP para maximizar a eficiência de amplificação 3) tampão de reação Proprietário, otimizado para trabalhar com Solaris primer / sonda ensaios. Este tampão de reação contém corante azul para aumentar o contraste entre reagente e plástico. 4) ROX, se o seu instrumento qPCR requer ROX. </li><li> Uma vez que as soluções têm descongelado, misture sacudindo o tubo (não vortex). Spin-los para baixo para evitar a perda de reagente. </li><li> Em seguida, preparar um tubo de 15 mL Falcon estéril para configurar o mix de reação para o gene de interesse, mais um para o gene de referência, ampliação, dependendo do número de amostras. Prepare o suficiente tal que três repetições podem ser preparados para cada amostra, incluindo um modelo de controle não (NTC) e as amostras de curva padrão, se o método de curva padrão será usado para análise. </li><li> Para cada amostra rodar em uma placa de 96 poços, misture o seguinte: 5 mL da qPCR Solaris 2X Mix Master, 0,5 mL do conjunto Solaris Primer / Probe (20X), e PCR água grau tal que o volume final de reação, uma vez o cDNA é adicionado será de 25 mL. Para cada amostra rodar em uma placa de 384 poços misturar os seguintes: 12,5 mL da qPCR Solaris 2X Mix Master, 1,25 mL do conjunto Solaris Primer / Probe (20X), e PCR água grau tal que o volume final de reação, uma vez que o cDNA é adicionado será de 10 mL. </li><li> Usando um pipetador multicanal, transferir a mistura de mestre para nos poços apropriados da placa. O corante azul incluídos no master mix vai ajudar no progresso de pipetagem de rastreamento nas placas brancas. Em seguida, adicionar o template 1-5 mL cDNA (para uma placa de 96 poços) ou 1-2 mL de modelo de cDNA (para uma placa de 384 poços). Pipeta cima e para baixo para misturar. Coloque a placa em uma centrífuga e spin para baixo para remover as bolhas, pois estas irão interferir com as leituras de fluorescência. </li><li> Programa do termociclador: A enzima deve ser ativado com um 95 ° C 15 min (1 ciclo). Em seguida, 40 ciclos de 95 ° C, a desnaturação por 15 segundos, e recozimento e extensão a 60 ° C por 60 segundos. </li><li> Coloque a placa no instrumento qPCR. Iniciar o programa. </li></ol> Resultados representativos qPCR usando Solaris <img src="/files/ftp_upload/1700/1700fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Ensaios Solaris dar a detecção confiável, mesmo em concentrações muito baixas de entrada, a julgar pela eficiência da PCR e valores r2. 10 dez diluições de cDNA sintetizado a partir seqüência sintética amplicon RNA ou DNA seqüência amplicon foi amplificado em um instrumento 7900HT ABI usando Solaris qPCR Assay Expressão Gênica para F2RL1 ou CDC20, respectivamente. As curvas de log escala de amplificação e curvas de nível são mostrados juntamente com o desempenho de cada ensaio, incluindo a eficiência, o valor de r2, faixa dinâmica de 10 log10 diluições, eo limite mínimo de detecção. <img src="/files/ftp_upload/1700/1700fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Assays Solaris dar resultados consistentes até mesmo entre diferentes pesquisadores e laboratórios. siRNAs segmentação ALDOA e PPIB, bem como um controle não-alvo (NTC), foram transfectados em células HeLa em 100, 10, 1 e 0,1 nM concentrações final. As células foram colhidas e RNA total isolado 48 horas pós-tratamento. cDNA foi sintetizado usando Thermo Scientific Verso Kit Síntese de cDNA. Uma alíquota do cDNA foi amplificado em dois laboratórios separados geograficamente usando Solaris qPCR Ensaios Expressão Gênica para a detecção de ALDOA, PPIB, e GAPDH em um LightCycler Roche 480 (384 poços) da plataforma. Knockdown foi calculado usando o método ΔΔCq (normalizados para GAPDH referência gene e NTC tratados com células). Os mesmos níveis de knockdown foram demonstradas para alvos tanto gene entre os dois pesquisadores em ambos os locais.

Os autores deste artigo são funcionários da Thermo Scientific.

Thermo Scientific Ensaios Solaris qPCR fornecer um método simples e melhor para a realização de análise de qPCR. Usando um algoritmo de alta severidade, incorporando tecnologia e MGB Superbases, esses conjuntos de primers e sonda maximizar a fidelidade ea robustez dos experimentos qPCR. Uma cartilha e definir sonda reconhece todas as variantes conhecidas emenda de um determinado gene. O site de destino, sempre que possível, inclui as regiões exon abrangendo, para garantir que o DNA genômico não é amplificado. Estas características tornam possível executar várias amostras simultaneamente, reduzindo a quantidade de tempo necessário para realizar experimentos complexos. Desde a mistura principal é azul, é possível usar placas brancas opacas, que melhoram a sensibilidade do qPCR, sem perder de vista a pipetagem. Tomados em conjunto, as características do projeto do Ensaio qPCR Solaris fazer este ensaio qPCR romance um ensaio simples, mas de alto desempenho que é específica e robusta.

quantitative real-time pcr using the thermo scientific solaris qpcr assay

O Solaris qPCR Assay expressão do gene é um novo tipo de primer / sonda conjunto, projetado para simplificar o processo de qPCR, mantendo a sensibilidade e precisão do ensaio. Estes conjuntos primer / sonda são pré-concebidos para&gt; 98% dos genomas humano e do rato e melhorias característica importante das tecnologias anteriormente disponíveis. Estas melhorias foram possíveis em virtude de um algoritmo de design inovador, desenvolvido por especialistas Thermo Scientific bioinformática. Várias características convenientes foram incorporados Ensaio qPCR Solaris para agilizar o processo de realizar quantitativa PCR em tempo real. Primeiro, o protocolo é semelhante ao de alternativas comumente empregados, por isso os métodos utilizados durante a qPCR são susceptíveis de ser familiar. Segundo, a mistura principal é azul, o que torna a configuração das reações qPCR mais fácil de rastrear. Em terceiro lugar, as condições de ciclos térmicos são os mesmos para todos os ensaios (genes), tornando possível para executar muitas amostras em um tempo e reduzindo o potencial de erro. Finalmente, a sonda e informações de seqüência de primer são fornecidos, simplificando o processo de publicação. Aqui, nós demonstrar como obter os reagentes apropriados Solaris usando o recurso de busca GENEius produto encontrado no site da ordenação (www.thermo.com / solaris) e como utilizar os reagentes para a realização de qPCR Solaris usando o método de curva padrão.

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay at JoVE.com

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

O Solaris qPCR Ensaios Expressão Gênica são novos pré-concebidas qPCR primer / sonda combinações projetado para simplificar o processo de qPCR sem sacrificar a especificidade e robustez do ensaio.

Quantitativas Real-Time PCR usando o Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

quantitative-real-time-pcr-using-thermo-scientific-solaris-qpcr

Research

JoVE Journal

Biology

49.7K visualizações.  Thermo Scientific Solaris qPCR Products.  日本語 

Vídeo: Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

Protocol for HER2 FISH Using a Non-cross-linking, Formalin-free Tissue Fixative to Combine Advantages of Cryo-preservation and Formalin Fixation

Morphologic assessment of formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue samples has been the gold standard for cancer diagnostics for decades due to its excellent preservation of morphology. Personalized medicine increasingly provides individually adapted and targeted therapies for characterized individual diseases enabled by combined morphological and molecular analytical technologies and diagnostics. Performance of morphologic and molecular assays from the same FFPE specimen is challenging because of the negative impact of formalin due to chemical modification and cross-linking of nucleic acids and proteins. A non-cross-linking, formalin-free tissue fixative has been recently developed to fulfil both requirements, i.e., to preserve morphology like FFPE and biomolecules like cryo-preservation. Since FISH is often required in combination with histopathology and molecular diagnostics, we tested the applicability of FISH protocols on tissues treated with this new fixative. We found that formalin post-fixation of histological sections of non-cross-linking, formalin-free and paraffin-embedded (NCFPE) breast cancer tissue generated equivalent results to those with FFPE tissue in human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) FISH analysis. This protocol describes how a FISH assay originally developed and validated for FFPE tissue can be used for NCFPE tissues by a simple post-fixation step of histological sections.

Fluorescence in-situ hybridization (FISH) is often required in combination with histopathology and molecular diagnostics for selection of therapy in personalized medicine. A novel non-cross-linking, formalin-free tissue fixative that allows high quality morphologic, molecular and FISH analyses from the same specimen by addition of a post-fixation step before FISH is presented.

Protocolo para HER2 pescar usando um fixador de tecido não-cross-linking, livre de formol para combinar as vantagens da crio-preservação e fixação de formalina

Morphologic assessment of formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue samples has been the gold standard for cancer diagnostics for decades due to its ...

Pesquisa do câncer

Looking for Driver Pathways of Acquired Resistance to Targeted Therapy: Drug Resistant Subclone Generation and Sensitivity Restoring by Gene Knock-down

The past two decades have seen a shift from cytotoxic drugs to targeted therapy in medical oncology. Although targeted therapeutic agents have shown more impressive clinical efficacy and minimized adverse effects than traditional treatments, drug resistance has become the main limitation to their benefits. Several preclinical in vitro/in vivo models of acquired resistance to targeted agents in clinical practice have been developed mainly by using two strategies: i) genetic manipulation for modeling genotypes of acquired resistance, and ii) in vitro/in vivo selection of resistant models. In the present work, we propose a unifying framework, for investigating the underlying mechanisms responsible for acquired resistance to targeted therapeutic agents, starting from the generation of drug-resistant cellular subclones to the description of silencing procedures used for restoring the sensitivity to the inhibitor. This simple time- and cost-effective approach is widely applicable, and could be easily extended to investigate resistance mechanisms to other targeted therapeutic drugs in different tumor histotypes.

This is a time- and cost-effective in vitro protocol investigating the mechanisms of acquired resistance to targeted therapeutic agents, which is a highly unmet medical need in cancer management.

À procura de caminhos de Driver do adquiriu resistência à terapia-alvo: geração de Subclone resistentes aos medicamentos e sensibilidade restaurando pelo Gene Knock-down

The past two decades have seen a shift from cytotoxic drugs to targeted therapy in medical oncology. Although targeted therapeutic agents have shown more ...

Simultaneous DNA-RNA Extraction from Coastal Sediments and Quantification of 16S rRNA Genes and Transcripts by Real-time PCR

Real Time Polymerase Chain Reaction also known as quantitative PCR (q-PCR) is a widely used tool in microbial ecology to quantify gene abundances of taxonomic and functional groups in environmental samples. Used in combination with a reverse transcriptase reaction (RT-q-PCR), it can also be employed to quantify gene transcripts. q-PCR makes use of highly sensitive fluorescent detection chemistries that allow quantification of PCR amplicons during the exponential phase of the reaction. Therefore, the biases associated with &#39;end-point&#39; PCR detected in the plateau phase of the PCR reaction are avoided. A protocol to quantify bacterial 16S rRNA genes and transcripts from coastal sediments via real-time PCR is provided. First, a method for the co-extraction of DNA and RNA from coastal sediments, including the additional steps required for the preparation of DNA-free RNA, is outlined. Second, a step-by-step guide for the quantification of 16S rRNA genes and transcripts from the extracted nucleic acids via q-PCR and RT-q-PCR is outlined. This includes details for the construction of DNA and RNA standard curves. Key considerations for the use of RT-q-PCR assays in microbial ecology are included.

A protocol to quantify bacterial 16S rRNA genes and transcripts from coastal sediments via real-time PCR is provided. The methodology includes the co-extraction of DNA and RNA; preparation of DNA-free RNA; and 16S rRNA gene and transcript quantification via RT-q-PCR, including standard curve construction.

DNA-RNA simultânea de extração de sedimentos costeiros e quantificação de 16S rRNA genes e transcritos por PCR em tempo real

Real Time Polymerase Chain Reaction also known as quantitative PCR (q-PCR) is a widely used tool in microbial ecology to quantify gene abundances of ...

Ambiente

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process including development1, apoptosis2, and cell cycle regulation3. MiRNAs are estimated to regulate the expression of 30% to 90% of human genes4 by binding to their target messenger RNAs (mRNAs)5. Widespread dysregulation of miRNAs has been reported in various diseases and cancer subtypes6. Due to their prevalence and unique structure, these small molecules are likely to be the next generation of biomarkers, therapeutic agents and/or targets.
Methods used to investigate miRNA expression include SYBR green I dye- based as well as Taqman-probe based qPCR. If miRNAs are to be effectively used in the clinical setting, it is imperative that their detection in fresh and/or archived clinical samples be accurate, reproducible, and specific. qPCR has been widely used for validating expression of miRNAs in whole genome analyses such as microarray studies7. The samples used in this protocol were from patients who underwent radical prostatectomy for clinically localized prostate cancer; however other tissues and cell lines can be substituted in. Prostate specimens were snap-frozen in liquid nitrogen after resection. Clinical variables and follow-up information for each patient were collected for subsequent analysis8.
Quantification of miRNA levels in prostate tumor samples. The main steps in qPCR analysis of tumors are: Total RNA extraction, cDNA synthesis, and detection of qPCR products using miRNA-specific primers. Total RNA, which includes mRNA, miRNA, and other small RNAs were extracted from specimens using TRIzol reagent. Qiagen's miScript System was used to synthesize cDNA and perform qPCR (Figure 1). Endogenous miRNAs are not polyadenylated, therefore during the reverse transcription process, a poly(A) polymerase polyadenylates the miRNA. The miRNA is used as a template to synthesize cDNA using oligo-dT and Reverse Transcriptase. A universal tag sequence on the 5' end of oligo-dT primers facilitates the amplification of cDNA in the PCR step. PCR product amplification is detected by the level of fluorescence emitted by SYBR Green, a dye which intercalates into double stranded DNA. Specific miRNA primers, along with a Universal Primer that binds to the universal tag sequence will amplify specific miRNA sequences. 
The miScript Primer Assays are available for over a thousand human-specific miRNAs, and hundreds of murine-specific miRNAs. Relative quantification method was used here to quantify the expression of miRNAs. To correct for variability amongst different samples, expression levels of a target miRNA is normalized to the expression levels of a reference gene. The choice of a gene on which to normalize the expression of targets is critical in relative quantification method of analysis. Examples of reference genes typically used in this capacity are the small RNAs RNU6B, RNU44, and RNU48 as they are considered to be stably expressed across most samples. In this protocol, RNU6B is used as the reference gene.

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR

Quantitative Real Time polymerase chain reaction (qPCR) is a rapid and sensitive method to investigate the expression levels of various microRNA (miRNA) molecules in tumor samples. Using this method expression of hundreds of different miRNA molecules can be amplified, quantified, and analyzed from the same cDNA template.

Detecção MicroRNA em tumores de próstata por Quantitative PCR em tempo real (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process ...

Medicina

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their translational repression. Changes in miRNA expression have been shown to be involved in the development of all major complex diseases. Furthermore, recent findings showed that miRNAs can be secreted to the extracellular environment and enter the bloodstream and other body fluids where they can circulate with high stability. The function of such circulating miRNAs remains largely elusive, but systematic high throughput approaches, such as miRNA profiling arrays, have lead to the identification of miRNA signatures in several pathological conditions, including neurodegenerative disorders and several types of cancers. In this context, the identification of miRNA expression profile in the cerebrospinal fluid, as reported in our recent study, makes miRNAs attractive candidates for biomarker analysis.
There are several tools available for profiling microRNAs, such as microarrays, quantitative real-time PCR (qPCR), and deep sequencing. Here, we describe a sensitive method to profile microRNAs in cerebrospinal fluids by quantitative real-time PCR. We used the Exiqon microRNA ready-to-use PCR human panels I and II V2.R, which allows detection of 742 unique human microRNAs. We performed the arrays in triplicate runs and we processed and analyzed data using the GenEx Professional 5 software.
Using this protocol, we have successfully profiled microRNAs in various types of cell lines and primary cells, CSF, plasma, and formalin-fixed paraffin-embedded tissues.

We describe a protocol of real time PCR to profile microRNAs in the cerebrospinal fluid (CSF). With the exception of RNA extraction protocols, the procedure can be extended to RNA extracted from other body fluids, cultured cells, or tissue specimens.

Líquido cefalorraquidiano MicroRNA perfil usando Quantitative PCR em Tempo Real

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

De alto rendimento quantitativo em tempo real de RT-PCR Ensaio para Determinar Perfis de Expressão do tipo I e III do interferão subtipos

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Imunologia e Infecção

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower detection limit compared to other methods of gene expression profiling while using smaller amounts of input for each assay.  Automated qPCR setup has improved this field by allowing for greater reproducibility.  Its convenient and rapid setup allows for high-throughput experiments, enabling the profiling of many different genes simultaneously in each experiment.  This method along with internal plate controls also reduces experimental variables common to other techniques.  
We recently developed a qPCR assay for profiling of pre-microRNAs  (pre-miRNAs) using a set of 186 primer pairs.  MicroRNAs have emerged as a novel class of small, non-coding RNAs with the ability to regulate many mRNA targets at the post-transcriptional level.  These small RNAs are first transcribed by RNA polymerase II as a primary miRNA (pri-miRNA) transcript, which is then cleaved into the precursor miRNA (pre-miRNA).  Pre-miRNAs are exported to the cytoplasm where Dicer cleaves the hairpin loop to yield mature miRNAs.  Increases in miRNA levels can be observed at both the precursor and mature miRNA levels and profiling of both of these forms can be useful.  There are several commercially available assays for mature miRNAs; however, their high cost may deter researchers from this profiling technique.  Here, we discuss a cost-effective, reliable, SYBR-based qPCR method of profiling pre-miRNAs.  Changes in pre-miRNA levels often reflect mature miRNA changes and can be a useful indicator of mature miRNA expression.  However, simultaneous profiling of both pre-miRNAs and mature miRNAs may be optimal as they can contribute nonredundant information and provide insight into microRNA processing.  Furthermore, the technique described here can be expanded to encompass the profiling of other library sets for specific pathways or pathogens.

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

We will demonstrate the setup and analysis of pre-microRNA 96-well arrays for QPCR using a robot as well as by hand with a Thermo Scientific Matrix multichannel pipette.

Perfil dos pré-micro RNAs e microRNAs usando Quantitative PCR em tempo real (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

Biologia

Quantitative PCR of T7 Bacteriophage from Biopanning

This protocol describes the use of quantitative PCR (qPCR) to enumerate T7 phages from phage selection experiments (i.e., &#34;biopanning&#34;). qPCR is a fluorescence-based approach to quantify DNA, and here, it is adapted to quantify phage genomes as a proxy for phage particles. In this protocol, a facile phage DNA preparation method is described using high-temperature heating without additional DNA purification. The method only needs small volumes of heat-treated phages and small volumes of the qPCR reaction. qPCR is high-throughput and fast, able to process and obtain data from a 96-well plate of reactions in 2&#8211;4 h. Compared to other phage enumeration approaches, qPCR is more time-efficient. Here, qPCR is used to enumerate T7 phages identified from biopanning against in vitro cystic fibrosis-like mucus model. The qPCR method can be extended to quantify T7 phages from other experiments, including other types of biopanning (e.g.,&#160;immobilized protein binding, in vivo phage screening) and other sources (e.g., water systems or body fluids). In summary, this protocol can be modified to quantify any DNA-encapsulated viruses.

A reproducible, accurate, and time efficient quantitative PCR (qPCR) method to enumerate T7 bacteriophage is described here. The protocol clearly describes phage genomic DNA preparation, PCR reaction preparation, qPCR cycling conditions, and qPCR data analysis.

PCR quantitativo do bacteriófago T7 de Biopanning

This protocol describes the use of quantitative PCR (qPCR) to enumerate T7 phages from phage selection experiments (i.e., &#34;biopanning&#34;). qPCR is a ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that provides an accurate and reproducible analysis. Probe-based chemistry offers the least background fluorescence as compared to other (dye-based) chemistries. Presently, there are several platforms available that use probe-based chemistry to quantitate transcript abundance. qPCR in a 96 well plate is the most routinely used method, however only a maximum of 96 samples or miRNAs can be tested in a single run. This is time-consuming and tedious if a large number of samples/miRNAs are to be analyzed. High-throughput probe-based platforms such as microfluidics (e.g. TaqMan Array Card) and nanofluidics arrays (e.g. OpenArray) offer ease to reproducibly and efficiently detect the abundance of multiple microRNAs in a large number of samples in a short time. Here, we demonstrate the experimental setup and protocol for miRNA quantitation from serum or plasma-EDTA samples, using probe-based chemistry and three different platforms (96 well plate, microfluidics and nanofluidics arrays) offering increasing levels of throughput.

Circulating microRNAs have recently emerged as promising and novel biomarkers for various cancers and other diseases. The goal of this article is to discuss three different probe-based real-time PCR platforms and methods that are available to quantify and determine the abundance of circulating microRNAs.

Baseado-Probe-PCR em tempo real Abordagens para a medição quantitativa de microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

Análise qPCRTag - A High Throughput, PCR em Tempo Real Ensaio para Sc2.0 Genotipagem

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...