Este método poderia ajudar a responder a problemas-chave nos campos de virologia e microbiologia relacionados à enumeração de bacteriófagos de amostras complexas e diagnósticos e terapêuticas baseadas em bacteriófagos. A principal vantagem desta técnica é que permite quantificação eficiente e precisa do tempo de um grande número de amostras de experimentos de biopanning phage não viáveis com ensaios tradicionais. Demonstrando o procedimento estarão Rashmi Mohanty e Jasmim Leal, estudantes de pós-graduação do meu laboratório.
Depois de projetar os primers e criar uma concentração de estoque, obtenha referência T7 phage DNA em uma concentração de 0,1 microgramas por microliter. Usando água ultrauso, dilui-se em série este DNA dez vezes, de um milhão de femtogramas por microliter para um femtogramas por microliter em tubos PCR de 0,2 mililitros. Prepare 20 microliters de cada concentração, certificando-se de trocar pontas de pipeta e vórtice dos tubos entre cada estágio da diluição.
Em seguida, converta a concentração de DNA de referência T7 de femtogramas por microliter para cópias de genoma por microliter. Primeiro, pipetas 200 microliters da amostra T7 phage clone em um tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitro para cada uma das 10 amostras desejadas. Adicione dois microliters de DNase um a cada tubo.
Tampe os tubos e incubar a 37 graus Celsius por 10 minutos em um banho seco aquecido. Em seguida, incubar a 100 graus celsius por 15 minutos em um banho seco aquecido. Centrifugar os tubos contendo as pragas tratadas a calor a 18.534 vezes g durante 10 segundos.
Coloque os tubos centrifugados em um misturador de vórtice definido no modo de ativação do toque por 10 segundos para misturar as pragas. Gire novamente aos 18, 534 vezes g por 10 segundos. Depois disso, deixe as amostras no banco do laboratório cerca de uma hora para esfriá-las à temperatura ambiente.
Prepare a pré-mistura qPCR para 10 amostras biopanned phage de concentração desconhecida e sete amostras de concentrações padrão em triplicado. Resultando em uma pré-mistura para 51 amostras contendo 255 microlitros de mix mestre qPCR, 51 microlitros de primers e 102 microlitros de água. Aliquot oito microliters do PCR preparado misturam em 51 poços de uma placa qPCR de 96 poços.
Em seguida, adicione dois microliters de amostras de phage T7 tratadas a calor a cada um desses poços, distribuindo-o abaixo da superfície da pré-mistura qPCR. Usando filme adesivo, sele a placa. Enrole a placa em papel alumínio para minimizar o branqueamento da foto fluorescência e, em seguida, prossiga para executar a placa no equipamento qPCR.
Configure as condições de ciclismo e derreta as configurações da curva, conforme descrito no protocolo de texto. Após a execução do qPCR, o gráfico de amplificação, o plot de curva de fusão e o plot multicomponente são analisados a partir dos dados brutos. O plot de amplificação indica se a amplificação do PCR de cada amostra é bem sucedida ou não.
O enredo multicomponente representa a amplificação e decadência do sinal fluorescente ao longo dos ciclos de amplificação. Enquanto o gráfico da curva de derretimento é usado para validar a especificidade dos primers, uma vez que cada produto PCR tem uma temperatura de fusão única. A curva padrão é então gerada a partir do DNA de referência.
Aqui, a eficiência de amplificação é calculada como sendo de 92,4% Os dados representativos de um estudo qPCR são então comparados com o mesmo phage que foram quantificados por um ensaio de placa de camada dupla na faixa testada de 10 a 10 milhões de cópias de genoma por microliter. Como visto aqui, o número de phages na quantitação qPCR é maior do que no ensaio da placa. A repetibilidade do método qPCR representado pelo coeficiente de variância é vista com valores que variam de 2,85 a 27,2%.Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que existem inúmeras considerações no desenvolvimento e uso do qPCR para quantificar com precisão os phages, incluindo tratamento cuidadoso e preparação de amostras e calibração de equipamentos relevantes.
Seguindo este método, outras técnicas podem ser realizadas a fim de enumerar partículas de phage em uma variedade de aplicações incluídas no biopanning vivo, preparação de DNA da biblioteca phage e detecção de sequenciamento e phage de próxima geração em amostras ambientais complexas. Não se esqueça que os phages são considerados perigos biológicos em laboratório e precauções como equipamentos de proteção individual, incluindo luvas e jalecos, devem ser sempre usadas durante a realização do procedimento.
