Name: quantitative real-time pcr using the thermo scientific solaris qpcr assay
Uploaded: 2010-06-17T17:04:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
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1. Die Thermo Scientific Solaris qPCR Assay-Design-Algorithmus <ol><li> Der Algorithmus in das Design der Solaris qPCR Sonde / Primerpaare verwendet passt die Tm jeder Komponente wodurch universelle Radfahren Bedingungen. Der Einbau der MGB, oder kleine Furche binden, Einheit in der Sonde erhöht die Tm und ermöglicht kürzere Sonden, um eine größere Assay Flexibilität und Leistung ausgelegt sein. Wie ihr Name schon sagt, sind MGBs eine Klasse von Antibiotika, die in die kleine Furche der DNA-Helix passt. MGBs sind die 3 oder 5 Ende einer DNA-Sonde befestigt. In Lösung wird die FAM-Reporter Fluoreszenz der Sonde von Eclipse Dunkle Quencher gequencht. Wenn die Sonde an eine Zielsequenz bindet, kann die daraus resultierende Veränderung in der Sonde s 3-D-Konformation ein starkes Fluoreszenzsignal. Die Bindung der DNA-Sonde zur Zielsequenz wird durch die MGB, die den Einsatz von hochspezifischen, kürzere Sonden ermöglicht und gleichzeitig die entsprechende Schmelztemperatur für PCR stabilisiert. So tritt Signalerkennung beim Glühen Phase der Target-Amplifikation. Während der Erweiterung Schritt distanziert die MGB-Sonde und die Fluoreszenz wieder abgeschreckt. Weil die Sonde distanziert, hat dies keine Auswirkungen PCR-Effizienz. </li><li> Ein weiteres Merkmal der Solaris-Algorithmus ist die Verwendung von Superbases. Superbases sind Grundlagen, die verbindliche Fähigkeiten verbessert haben, um die Stabilität von AT-Anleihen zu verbessern und zu beseitigen GG Selbstassoziation in Guanin reiche Sequenzen modifiziert. Hinzu kommt, dass sie nicht auslöschen benachbarten Fluorophoren an der 5-Terminus angehängt. Diese Basen sind selektiv platziert, nach dem Algorithmus, um die Verfügbarkeit von Zielsequenzen zu erweitern. Dies macht es möglich, Sequenzen, wie GC-reiche Regionen, die sonst in der Gestaltung Primer und Sonden vermieden werden verwenden würde. </li><li> Wann immer möglich, enthält die Solaris-Algorithmus Exon Junction Spanning Regionen in der Ziel-Site. Dies erhöht die Spezifität durch die Vermeidung der Verstärkung der Verunreinigung genomischer DNA. </li><li> Wichtig ist, dass der Algorithmus identifiziert auch eine Konsensus-Sequenz für alle bekannten Splice-Varianten, so dass alle von einer einzigen Sonde / Primer-Set abgedeckt sind. So ist nur ein Test für ein bestimmtes Gen von Interesse erforderlich. </li><li> Schließlich nutzt das Solaris qPCR Assay-Design-Algorithmus sehr strenge Parameter für kritische Überlegungen zum Entwurf einschließlich GC-Gehalt, Länge, Tm, und erstreckt sich von homogenen Nukleotiden. Die resultierenden Sequenzen BLAST für die Spezifität mit 3 verschiedenen Datenbanken analysiert: genomische, Transkript, und Pseudogen. </li></ol> 2. Beziehen Solaris Reagenzien <ol><li> Um die entsprechende Solaris Reagenzien, besuchen <a href="http://dharmacon.com">www.thermo.com / solaris</a> </li><li> Sobald Sie auf der Website auf &quot;GENEius Produktsuche&quot; klicken. Um direkt zu den GENEius Produkt zu suchen, gehen <a href="http://www.dharmacon.com/catalogsearch/consolidatedsearch.aspx">www.thermo.com / SolarisSearch</a> </li><li> Klicken Sie in der Suchanfrage ein und wählen Sie den entsprechenden Zielorganismen. </li><li> Die GENEius Produktsuche verarbeiten kann viele verschiedene Gen-IDs. Geben Sie hier eine der vorgeschlagenen Suchbegriffen, um das Gen von Interesse, einschließlich Ref Seq Beitritt, der Gene-ID, die Gene Symbol, ein Gene Beschreibung der Sanger-ID oder Zugangsnummer oder eine Katalog-Nummer zu finden. Dann auf &quot;Suchen&quot; klicken. </li><li> Identifizieren des Gens von Interesse und klicken Sie auf &quot;Auswählen&quot; auf der linken Seite. Es öffnet sich ein Fenster, das die verschiedenen Thermo Scientific Produkte für das Gen von Interesse zeigt. Unter &quot;Produkte&quot; die Option &quot;qPCR Detection&quot; Tab. </li><li> Unter dem &quot;Solaris Gene Expression Assay&quot; Überschrift, sehen Sie eine optimal Solaris Sonde / der Primer-Assay entwickelt. Dieser Test deckt alle bekannten Spleißvarianten des Gens Ziel. Wählen Sie die gewünschte Menge. Sie sind in 100, 200, 400 zur Verfügung, und 1000 X 25 ul Reaktionen (wenn der Test als made-to-order identifiziert wird, die 100 Packungsgröße nicht verfügbar). Klicken Sie auf &quot;In den Warenkorb&quot;. </li><li> Als nächstes wählen Sie den entsprechenden Master-Mix für den Thermocycler, die verwendet werden. Um festzustellen, welche Master-Mix funktioniert am besten mit der Maschine zur Verfügung, klicken Sie auf &quot;Finden Sie heraus, welche Master Mix am besten mit Ihrem PCR Cycler!&quot; </li><li> Finden Sie die qPCR-Cycler, dass auf der Speisekarte verwendet werden, um festzustellen, welcher Mix zu verwenden. </li><li> Zurück zur GENEius Produktsuche Fenster, und wählen Sie den entsprechenden Master-Mix. Der Master-Mix kommt in 100, 200, 400 und 1000 Reaktion Größen. Klicken Sie auf &quot;In den Warenkorb&quot;. </li><li> Zitiervorschlag Gene und verso cDNA-Synthese-Kits können auch für eine vollständige qRT-PCR-Analyse bestellt werden. </li><li> Wenn das Solaris-qPCR-Reagenzien kommen, bewahren Sie sie bei -20 ° C bis zur Verwendung. Die folgenden Reagenzien empfangen werden soll: Ein 20fach-Lösung mit zwei Primern bei 800 nm und je einem Gen spezifischen Sonde bei 200 nm, sequ vorgesehenENCE Informationen sowohl für die Sonde und die Primer-und Solaris-qPCR Gene Expression Master Mix in einer 2X-Konzentration. Solaris qPCR Gene Expression Assays sind für mindestens 12 Monate stabil. Vermeiden Sie wiederholtes Einfrieren und Auftauen. </li></ol> 3. qPCR-Setup <ol><li> Beginnen Sie mit der qPCR-Protokoll mit cDNA. Gesamt-RNA extrahiert sollte mit einem Spin-Säule Methode. Die Thermo Scientific Verso cDNA-Synthese-Kit ist für die reverse Transkription in cDNA zu erzeugen empfohlen. </li><li> Bereiten Sie sich für qPCR durch Auftauen der Primer, Sonden und Master-Mix auf Eis. Auch zur Hand haben PCR-Wasser und Deckweiß qPCR-Platten, die die Sensitivität der Real-time PCR zu verbessern. </li><li> Der Master-Mix enthält alle Komponenten für die Echtzeit-PCR einschließlich: 1) Thermo-Start-DNA-Polymerase, ein Hot-Start-Version von Thermoprime DNA-Polymerase. Diese Art der Polymerase wird verwendet, um unspezifische Amplifikation während der Reaktion-Einrichtung zu vermeiden und erfordert die Aktivierung bei 95 ° C 15 min. 2) dNTPs in der Solaris-Master-Mix, ersetzt dTTP dUTP zu Amplifikationseffizienz 3) Proprietary Reaktionspuffer, optimiert, um mit Solaris Primer / Sonden-Assays zu maximieren. Diese Reaktion Puffer enthält blauen Farbstoff, um den Kontrast zwischen Reagenz und Kunststoff zu erhöhen. 4) ROX, wenn Ihr qPCR Gerät benötigt ROX. </li><li> Nachdem die Lösungen aufgetaut haben, Dazu den Schlauch (nicht vortexen) mischen. Spin sie nieder, um den Verlust von Reagenz zu verhindern. </li><li> Als nächstes bereiten ein 15 mL sterile Falcon-Röhrchen zum Einrichten der Reaktion Mix für das Gen von Interesse, plus einer für den Gen, Scaling-up in Abhängigkeit von der Anzahl der Proben. Bereiten Sie genug, so dass drei Wiederholungen kann für jede Probe vorbereitet werden, einschließlich einer Nicht-Template (NTC) und Standard-Kurve Proben, wenn die Standard-Kurve zur Analyse verwendet werden. </li><li> Für jede Probe auf einer 96-Well-Platte laufen, mischen Sie die folgenden: 5 ul des 2X Solaris qPCR Master Mix, .5 ul des Solaris Primer / Probe-Set (20X) und PCR-Wasser, so dass die Endreaktionsvolumen einmal die cDNA angefügt werden mit 25 ul werden. Für jede Probe auf einer 384-Well-Platte laufen Mix folgende: 12,5 ul des 2X Solaris qPCR Master Mix, 1,25 ul des Solaris Primer / Probe-Set (20X) und PCR-Wasser, so dass die Endreaktionsvolumen, sobald die cDNA hinzugefügt werden 10 ul werden. </li><li> Mit einer Multi-Kanal-Pipette, übertragen Sie die Master-Mix in die entsprechenden Vertiefungen der Platte. Der blaue Farbstoff in der Master-Mix enthalten wird bei der Verfolgung Pipettieren Fortschritte auf dem weißen Teller Hilfe. Dann fügen Sie von 1-5 ul cDNA-Template (für eine 96-Well-Platte) oder 1-2 ul der cDNA-Template (für eine 384-Well-Platte). Pipette auf und ab zu mischen. Die Platte wird in eine Zentrifuge und Spin-Down, um Luftblasen zu entfernen, da diese mit der Fluoreszenz-Messungen stören. </li><li> Programmieren Sie den Thermocycler: Das Enzym muss aktiviert werden, eine 95 ° C 15 min (1 Zyklus). Dann wurden 40 Zyklen von 95 ° C, Denaturierung für 15 Sekunden und Annealing und Extension bei 60 ° C für 60 Sekunden. </li><li> Die Platte wird in der qPCR Instrument. Starten Sie das Programm. </li></ol> Vertreter qPCR Ergebnisse mit Solaris <img src="/files/ftp_upload/1700/1700fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Solaris-Assays geben zuverlässige Erkennung selbst bei sehr niedrigen Konzentrationen Eingang, wie die PCR-Effizienz und r2-Werte beurteilt. Zehn 10-fache Verdünnungen der cDNA aus synthetischen RNA-Amplikon DNA-Sequenz oder Amplikon-Sequenz synthetisiert wurde auf einem ABI 7900HT Instrument mit Solaris qPCR Gene Expression Assays für F2RL1 oder Cdc20 bzw. verstärkt. Die log-Skala Amplifikationskurven und Standard-Kurven sind zusammen mit der Leistung der einzelnen Tests einschließlich Effizienz, r2 Wert, Dynamikbereich von 10 log10 Verdünnungen und die untere Nachweisgrenze dargestellt. <img src="/files/ftp_upload/1700/1700fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Solaris Assays geben konsistente Ergebnisse auch zwischen verschiedenen Forscher und Laboratorien. siRNAs ALDOA und PPIB, sowie eine Non-Targeting-Control (NTC), wurden in HeLa-Zellen bei 100, 10, 1 und 0,1 nM Endkonzentration transfiziert. Die Zellen wurden geerntet und Gesamt-RNA isoliert 48 Stunden nach der Behandlung. cDNA wurde unter Verwendung von Thermo Scientific Verso cDNA Synthesis Kit. Ein Aliquot der cDNA wurde in zwei räumlich getrennten Labors verstärkt mit Solaris qPCR Gene Expression Assays für den Nachweis von ALDOA, PPIB und GAPDH auf einem Roche LightCycler 480 (384er)-Plattform. Knockdown wurde anhand der ΔΔCq Methode (normiert auf GAPDH Referenz-Gens und NTC-behandelten Zellen). Das gleiche Maß an Knockdown wurden für beide Gen-Targets zwischen beiden Forscher an beiden Standorten unter Beweis gestellt.

Die Autoren dieses Artikels sind die Mitarbeiter von Thermo Scientific.

Thermo Scientific Solaris qPCR-Assays bieten eine einfache, verbesserte Verfahren zur Durchführung von qPCR-Analyse. Mit einer hohen Stringenz Algorithmus unter Einbeziehung MGB-Technologie und Superbases maximieren diese Primer und Sonde setzt die Treue und die Robustheit der qPCR-Experimente. Ein Primer und Sonde gesetzt erkennt alle bekannten Spleißvarianten eines bestimmten Gens. Die Ziel-Website, wo immer möglich, umfasst Exon Spanning Regionen, um sicherzustellen, dass genomische DNA nicht verstärkt wird. Diese Eigenschaften machen es möglich, zahlreiche Proben gleichzeitig ausgeführt werden, sehr zur Verringerung der Menge an Zeit benötigt, um komplexe Experimente durchzuführen. Da die Master-Mix ist blau, ist es möglich, weiß-opake Platten, die die Empfindlichkeit der qPCR zu verbessern, ohne den Überblick zu verlieren Pipettieren verwenden. Zusammengenommen machen die Design-Merkmale der Solaris qPCR Assay diesem Roman qPCR Assay eine einfache, aber leistungsfähige Test, dass sowohl spezifische als auch robust ist.

quantitative real-time pcr using the thermo scientific solaris qpcr assay

Die Solaris qPCR Gene Expression Assay ist eine neue Art von Primer / Sonden gesetzt, entwickelt, um die qPCR-Prozess zu vereinfachen und gleichzeitig die Empfindlichkeit und Genauigkeit des Assays. Diese Primer / Sonden-Sets sind zu&gt; 98% der humanen und Maus-Genom und verfügen über signifikante Verbesserungen von bereits verfügbaren Technologien pre-designed. Diese Verbesserungen waren möglich durch ein neuartiges Design-Algorithmus von Thermo Scientific Bioinformatik-Experten entwickelt. Mehrere praktische Funktionen wurden in die Solaris qPCR Assay um den Prozess der Durchführung quantitativer real-time PCR rationalisieren eingeflossen. Zuerst wird das Protokoll ähnlich üblicherweise eingesetzten Alternativen, so dass die Methoden bei der qPCR verwendet werden wahrscheinlich vertraut sein. Zweitens ist die Master-Mix Blau, das macht die Einstellung der qPCR Reaktionen leichter zu verfolgen. Drittens sind die Temperaturwechsel die gleichen Bedingungen für alle Assays (Gene), die es ermöglichen, viele Proben gleichzeitig ausgeführt und reduzieren das Potenzial für Fehler. Schließlich werden die Sonde und Primer-Sequenz zur Verfügung gestellten Informationen und vereinfacht den Publikationsprozess. Hier zeigen wir, wie Sie die entsprechenden Solaris Reagenzien mit dem GENEius Produkt Suchfunktion auf der Website zum Bestellen (www.thermo.com / Solaris) und wie die Solaris-Reagenzien für die Durchführung von qPCR mittels Standardkurve Methode gefunden zu erhalten.

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Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

Die Solaris qPCR Gene Expression Assays sind neuartige pre-designed qPCR Primer / Sonden-Kombinationen entwickelt, um die qPCR-Prozess, ohne die Spezifität und Robustheit des Tests zu vereinfachen.

Quantitative Real-Time PCR unter Verwendung der Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

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Research

JoVE Journal

Biology

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Protocol for HER2 FISH Using a Non-cross-linking, Formalin-free Tissue Fixative to Combine Advantages of Cryo-preservation and Formalin Fixation

Morphologic assessment of formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue samples has been the gold standard for cancer diagnostics for decades due to its excellent preservation of morphology. Personalized medicine increasingly provides individually adapted and targeted therapies for characterized individual diseases enabled by combined morphological and molecular analytical technologies and diagnostics. Performance of morphologic and molecular assays from the same FFPE specimen is challenging because of the negative impact of formalin due to chemical modification and cross-linking of nucleic acids and proteins. A non-cross-linking, formalin-free tissue fixative has been recently developed to fulfil both requirements, i.e., to preserve morphology like FFPE and biomolecules like cryo-preservation. Since FISH is often required in combination with histopathology and molecular diagnostics, we tested the applicability of FISH protocols on tissues treated with this new fixative. We found that formalin post-fixation of histological sections of non-cross-linking, formalin-free and paraffin-embedded (NCFPE) breast cancer tissue generated equivalent results to those with FFPE tissue in human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) FISH analysis. This protocol describes how a FISH assay originally developed and validated for FFPE tissue can be used for NCFPE tissues by a simple post-fixation step of histological sections.

Fluorescence in-situ hybridization (FISH) is often required in combination with histopathology and molecular diagnostics for selection of therapy in personalized medicine. A novel non-cross-linking, formalin-free tissue fixative that allows high quality morphologic, molecular and FISH analyses from the same specimen by addition of a post-fixation step before FISH is presented.

Protokoll für HER2 Fischen mit nicht-Cross-linking, Formalin-freies Gewebe Fixiermittel, Vorteile der Kryokonservierung und Formalin Fixierung zu kombinieren

Morphologic assessment of formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue samples has been the gold standard for cancer diagnostics for decades due to its ...

Forschung

Krebsforschung

Looking for Driver Pathways of Acquired Resistance to Targeted Therapy: Drug Resistant Subclone Generation and Sensitivity Restoring by Gene Knock-down

The past two decades have seen a shift from cytotoxic drugs to targeted therapy in medical oncology. Although targeted therapeutic agents have shown more impressive clinical efficacy and minimized adverse effects than traditional treatments, drug resistance has become the main limitation to their benefits. Several preclinical in vitro/in vivo models of acquired resistance to targeted agents in clinical practice have been developed mainly by using two strategies: i) genetic manipulation for modeling genotypes of acquired resistance, and ii) in vitro/in vivo selection of resistant models. In the present work, we propose a unifying framework, for investigating the underlying mechanisms responsible for acquired resistance to targeted therapeutic agents, starting from the generation of drug-resistant cellular subclones to the description of silencing procedures used for restoring the sensitivity to the inhibitor. This simple time- and cost-effective approach is widely applicable, and could be easily extended to investigate resistance mechanisms to other targeted therapeutic drugs in different tumor histotypes.

This is a time- and cost-effective in vitro protocol investigating the mechanisms of acquired resistance to targeted therapeutic agents, which is a highly unmet medical need in cancer management.

Auf der Suche nach Treiber Wege erworbene Resistenz auf die gezielte Therapie: resistente Subclone Generation und Sensibilität wiederherzustellen, indem Sie Gene Knock-down-

The past two decades have seen a shift from cytotoxic drugs to targeted therapy in medical oncology. Although targeted therapeutic agents have shown more ...

Simultaneous DNA-RNA Extraction from Coastal Sediments and Quantification of 16S rRNA Genes and Transcripts by Real-time PCR

Real Time Polymerase Chain Reaction also known as quantitative PCR (q-PCR) is a widely used tool in microbial ecology to quantify gene abundances of taxonomic and functional groups in environmental samples. Used in combination with a reverse transcriptase reaction (RT-q-PCR), it can also be employed to quantify gene transcripts. q-PCR makes use of highly sensitive fluorescent detection chemistries that allow quantification of PCR amplicons during the exponential phase of the reaction. Therefore, the biases associated with &#39;end-point&#39; PCR detected in the plateau phase of the PCR reaction are avoided. A protocol to quantify bacterial 16S rRNA genes and transcripts from coastal sediments via real-time PCR is provided. First, a method for the co-extraction of DNA and RNA from coastal sediments, including the additional steps required for the preparation of DNA-free RNA, is outlined. Second, a step-by-step guide for the quantification of 16S rRNA genes and transcripts from the extracted nucleic acids via q-PCR and RT-q-PCR is outlined. This includes details for the construction of DNA and RNA standard curves. Key considerations for the use of RT-q-PCR assays in microbial ecology are included.

A protocol to quantify bacterial 16S rRNA genes and transcripts from coastal sediments via real-time PCR is provided. The methodology includes the co-extraction of DNA and RNA; preparation of DNA-free RNA; and 16S rRNA gene and transcript quantification via RT-q-PCR, including standard curve construction.

Gleichzeitige DNA-RNA-Extraktion aus Küstensedimenten und Quantifizierung von 16S rRNA-Gene und Transkripte von Real-time PCR

Real Time Polymerase Chain Reaction also known as quantitative PCR (q-PCR) is a widely used tool in microbial ecology to quantify gene abundances of ...

Umwelt

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process including development1, apoptosis2, and cell cycle regulation3. MiRNAs are estimated to regulate the expression of 30% to 90% of human genes4 by binding to their target messenger RNAs (mRNAs)5. Widespread dysregulation of miRNAs has been reported in various diseases and cancer subtypes6. Due to their prevalence and unique structure, these small molecules are likely to be the next generation of biomarkers, therapeutic agents and/or targets.
Methods used to investigate miRNA expression include SYBR green I dye- based as well as Taqman-probe based qPCR. If miRNAs are to be effectively used in the clinical setting, it is imperative that their detection in fresh and/or archived clinical samples be accurate, reproducible, and specific. qPCR has been widely used for validating expression of miRNAs in whole genome analyses such as microarray studies7. The samples used in this protocol were from patients who underwent radical prostatectomy for clinically localized prostate cancer; however other tissues and cell lines can be substituted in. Prostate specimens were snap-frozen in liquid nitrogen after resection. Clinical variables and follow-up information for each patient were collected for subsequent analysis8.
Quantification of miRNA levels in prostate tumor samples. The main steps in qPCR analysis of tumors are: Total RNA extraction, cDNA synthesis, and detection of qPCR products using miRNA-specific primers. Total RNA, which includes mRNA, miRNA, and other small RNAs were extracted from specimens using TRIzol reagent. Qiagen's miScript System was used to synthesize cDNA and perform qPCR (Figure 1). Endogenous miRNAs are not polyadenylated, therefore during the reverse transcription process, a poly(A) polymerase polyadenylates the miRNA. The miRNA is used as a template to synthesize cDNA using oligo-dT and Reverse Transcriptase. A universal tag sequence on the 5' end of oligo-dT primers facilitates the amplification of cDNA in the PCR step. PCR product amplification is detected by the level of fluorescence emitted by SYBR Green, a dye which intercalates into double stranded DNA. Specific miRNA primers, along with a Universal Primer that binds to the universal tag sequence will amplify specific miRNA sequences. 
The miScript Primer Assays are available for over a thousand human-specific miRNAs, and hundreds of murine-specific miRNAs. Relative quantification method was used here to quantify the expression of miRNAs. To correct for variability amongst different samples, expression levels of a target miRNA is normalized to the expression levels of a reference gene. The choice of a gene on which to normalize the expression of targets is critical in relative quantification method of analysis. Examples of reference genes typically used in this capacity are the small RNAs RNU6B, RNU44, and RNU48 as they are considered to be stably expressed across most samples. In this protocol, RNU6B is used as the reference gene.

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR

Quantitative Real Time polymerase chain reaction (qPCR) is a rapid and sensitive method to investigate the expression levels of various microRNA (miRNA) molecules in tumor samples. Using this method expression of hundreds of different miRNA molecules can be amplified, quantified, and analyzed from the same cDNA template.

MicroRNA-Detektion in Prostatatumoren durch quantitative real-time PCR (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process ...

Medizin

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their translational repression. Changes in miRNA expression have been shown to be involved in the development of all major complex diseases. Furthermore, recent findings showed that miRNAs can be secreted to the extracellular environment and enter the bloodstream and other body fluids where they can circulate with high stability. The function of such circulating miRNAs remains largely elusive, but systematic high throughput approaches, such as miRNA profiling arrays, have lead to the identification of miRNA signatures in several pathological conditions, including neurodegenerative disorders and several types of cancers. In this context, the identification of miRNA expression profile in the cerebrospinal fluid, as reported in our recent study, makes miRNAs attractive candidates for biomarker analysis.
There are several tools available for profiling microRNAs, such as microarrays, quantitative real-time PCR (qPCR), and deep sequencing. Here, we describe a sensitive method to profile microRNAs in cerebrospinal fluids by quantitative real-time PCR. We used the Exiqon microRNA ready-to-use PCR human panels I and II V2.R, which allows detection of 742 unique human microRNAs. We performed the arrays in triplicate runs and we processed and analyzed data using the GenEx Professional 5 software.
Using this protocol, we have successfully profiled microRNAs in various types of cell lines and primary cells, CSF, plasma, and formalin-fixed paraffin-embedded tissues.

We describe a protocol of real time PCR to profile microRNAs in the cerebrospinal fluid (CSF). With the exception of RNA extraction protocols, the procedure can be extended to RNA extracted from other body fluids, cultured cells, or tissue specimens.

Liquor microRNA Profiling mittels quantitativer Real-Time PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

Hochdurchsatz-quantitative Echtzeit-RT-PCR-Assay zur Bestimmung Expressionsprofile der Typen I und III Interferon-Formationsglieder

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Immunologie und Infektion

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower detection limit compared to other methods of gene expression profiling while using smaller amounts of input for each assay.  Automated qPCR setup has improved this field by allowing for greater reproducibility.  Its convenient and rapid setup allows for high-throughput experiments, enabling the profiling of many different genes simultaneously in each experiment.  This method along with internal plate controls also reduces experimental variables common to other techniques.  
We recently developed a qPCR assay for profiling of pre-microRNAs  (pre-miRNAs) using a set of 186 primer pairs.  MicroRNAs have emerged as a novel class of small, non-coding RNAs with the ability to regulate many mRNA targets at the post-transcriptional level.  These small RNAs are first transcribed by RNA polymerase II as a primary miRNA (pri-miRNA) transcript, which is then cleaved into the precursor miRNA (pre-miRNA).  Pre-miRNAs are exported to the cytoplasm where Dicer cleaves the hairpin loop to yield mature miRNAs.  Increases in miRNA levels can be observed at both the precursor and mature miRNA levels and profiling of both of these forms can be useful.  There are several commercially available assays for mature miRNAs; however, their high cost may deter researchers from this profiling technique.  Here, we discuss a cost-effective, reliable, SYBR-based qPCR method of profiling pre-miRNAs.  Changes in pre-miRNA levels often reflect mature miRNA changes and can be a useful indicator of mature miRNA expression.  However, simultaneous profiling of both pre-miRNAs and mature miRNAs may be optimal as they can contribute nonredundant information and provide insight into microRNA processing.  Furthermore, the technique described here can be expanded to encompass the profiling of other library sets for specific pathways or pathogens.

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

We will demonstrate the setup and analysis of pre-microRNA 96-well arrays for QPCR using a robot as well as by hand with a Thermo Scientific Matrix multichannel pipette.

Profiling von Pre-micro RNAs und microRNAs mittels quantitativer real-time PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

Biologie

Quantitative PCR of T7 Bacteriophage from Biopanning

This protocol describes the use of quantitative PCR (qPCR) to enumerate T7 phages from phage selection experiments (i.e., &#34;biopanning&#34;). qPCR is a fluorescence-based approach to quantify DNA, and here, it is adapted to quantify phage genomes as a proxy for phage particles. In this protocol, a facile phage DNA preparation method is described using high-temperature heating without additional DNA purification. The method only needs small volumes of heat-treated phages and small volumes of the qPCR reaction. qPCR is high-throughput and fast, able to process and obtain data from a 96-well plate of reactions in 2&#8211;4 h. Compared to other phage enumeration approaches, qPCR is more time-efficient. Here, qPCR is used to enumerate T7 phages identified from biopanning against in vitro cystic fibrosis-like mucus model. The qPCR method can be extended to quantify T7 phages from other experiments, including other types of biopanning (e.g.,&#160;immobilized protein binding, in vivo phage screening) and other sources (e.g., water systems or body fluids). In summary, this protocol can be modified to quantify any DNA-encapsulated viruses.

A reproducible, accurate, and time efficient quantitative PCR (qPCR) method to enumerate T7 bacteriophage is described here. The protocol clearly describes phage genomic DNA preparation, PCR reaction preparation, qPCR cycling conditions, and qPCR data analysis.

Quantitative PCR von Bakteriophagen T7 aus Biopanning

This protocol describes the use of quantitative PCR (qPCR) to enumerate T7 phages from phage selection experiments (i.e., &#34;biopanning&#34;). qPCR is a ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that provides an accurate and reproducible analysis. Probe-based chemistry offers the least background fluorescence as compared to other (dye-based) chemistries. Presently, there are several platforms available that use probe-based chemistry to quantitate transcript abundance. qPCR in a 96 well plate is the most routinely used method, however only a maximum of 96 samples or miRNAs can be tested in a single run. This is time-consuming and tedious if a large number of samples/miRNAs are to be analyzed. High-throughput probe-based platforms such as microfluidics (e.g. TaqMan Array Card) and nanofluidics arrays (e.g. OpenArray) offer ease to reproducibly and efficiently detect the abundance of multiple microRNAs in a large number of samples in a short time. Here, we demonstrate the experimental setup and protocol for miRNA quantitation from serum or plasma-EDTA samples, using probe-based chemistry and three different platforms (96 well plate, microfluidics and nanofluidics arrays) offering increasing levels of throughput.

Circulating microRNAs have recently emerged as promising and novel biomarkers for various cancers and other diseases. The goal of this article is to discuss three different probe-based real-time PCR platforms and methods that are available to quantify and determine the abundance of circulating microRNAs.

Sonde-basierte Echtzeit-PCR Ansätze zur quantitativen Messung von microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

qPCRTag Analyse - ein hoher Durchsatz, Echtzeit-PCR-Assay für Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...