Salários e apoiar a investigação foram fornecidos pelo United Soybean Board, e por Estado e Federal fundos apropriados para The Ohio State University Pesquisa Agropecuária / Centro de Desenvolvimento e Ohio. Esta pesquisa também foi parcialmente financiado por uma bolsa da CONACYT, México, para cmHg. Menção de marca ou produtos de propriedade não constitui uma garantia ou de garantia do produto pela OSU / OARDC e também não implica a aprovação para a exclusão de outros produtos que também pode ser adequado. Journal Article Não HCS 17/09.

A metodologia a seguir descreve um protocolo para análise de imagem da expressão gênica utilizando um sistema automatizado de recolha de imagem. Para facilitar a explicação, a abordagem geral foi dividido em quatro etapas: 1) preparação de sementes, 2) a introdução de genes utilizando bombardeamento de partículas, 3) coleção de imagens de robótica, e 4) análise de imagem. Embora esta metodologia geral pode ser usada para uma ampla gama de outras aplicações, os conjuntos de presente de protocolos são baseados no uso do gene da proteína fluorescente verde (GFP), que é um gene repórter útil para a expressão do gene de rastreamento na mesma peça de tecidos vivos ao longo do tempo. I. Preparação de Sementes <ol><li> Lima feijão (. Phaseolus lunatus cv Henderson-Bush) as sementes podem ser comprados, ou, idealmente, colhidas de plantas cultivadas em câmara de crescimento (50% de umidade relativa, 16 / 8 h luz: escuro, 25/23 ° C dia / noite). Pós-colheita de sementes de qualidade pode ser mantida por sementes armazenar a -20 ° C. </li><li> Prepare Magenta GA7 recipientes para germinar sementes. Papel de filtro vezes ou toalhas de papel para caber no fundo de caixas de Magenta. Adicionar ~ 25 ml de água deionizada para cada recipiente para umedecer toalhas de papel e despeje a água não absorvida. Autoclave papel umedecido contendo caixas por 20 min. </li><li> Usando 50 ml tubos de centrífuga descartáveis, esterilizar as sementes em uma solução de lixívia a 10% comerciais (20 sementes em 20-40 ml) por 20 min com agitação em um agitador giratório em 60 rpm. Nota: Todas as etapas subseqüentes devem ser realizados em uma capela de fluxo laminar. </li><li> Enxaguar as sementes 4-7 vezes com água deionizada estéril com agitação suave durante 30 segundos durante cada lavagem. </li><li> Coloque 5-6 sementes estéreis entre as camadas de papel dobrado localizados em cada caixa de Magenta estéril. </li><li> Incubar as sementes por 4 dias sob as seguintes condições: 25 ° C, 16 / 8 h luz: escuro e 40 μEm -2 s -1. </li></ol> II. Introdução de genes usando bombardeio de partículas <ol><li> Construir construções de gene usando seu vetor de expressão favorito com um gene repórter que pode ser monitorado em tecidos vivos. Nós projetamos uma alta de cópia vetor de expressão número útil para promotor e análises elemento promotor. Este vetor contém o gene GFP, que é usado para visualizar promotora / função promotor elemento nos tecidos transformados. </li><li> Cerca de 1-2 h antes de bombardeio, consumo cotilédones de feijão de lima germinação de mudas e remover o tegumento. Cotilédones adequado para bombardeio deve ser amarelo-luz verde, plana e livre de qualquer dano que possa interferir com análise de imagem adicional. </li><li> Cotilédones lugar na OMS meio de cultura contendo sais MS 1, vitaminas B5 2, 3% de sacarose e Gelrite 0,2% (pH 5,7) imediatamente depois de ser extirpado. </li><li> Precipitar o DNA para construir M10 partículas de tungstênio (Sylvania, Towanda, PA, EUA). Em um tubo de microcentrífuga 0,6 ml, adicionar 25 mL partículas de tungstênio (partículas são suspensas em água estéril, 100 mg ml -1, logo antes de usar), 5 mL de DNA (1 ml mg -1), 25 mL de cloreto de cálcio 2,5 M (Sigma Cat-Aldrich. C3881-500G) e 10 ml 100 mM espermidina (Cat Sigma. S-2626). Vortex brevemente para misturar todos os componentes. </li><li> Incubar a preparação de DNA em gelo por 5 min. Então, remover e descartar o sobrenadante 50 mL. </li><li> Ressuspender as partículas de DNA revestido em vórtice e remover imediatamente uma alíquota de 2 mL. Repita este passo vórtice cada vez que uma alíquota é retirada do tubo. Partículas revestidas devem ser mantidos em gelo e usado dentro de 15 min. </li><li> Através do topo de um filtro de seringa, coloque 2 l partículas revestidas no meio da tela do filtro. Coloque a unidade de filtro que contém as partículas revestido na unidade de fixação do filtro dentro da câmara de arma de partículas. </li><li> Coloque uma lima feijão lado adaxial dos cotilédones acima em um defletor e coloque o defletor na câmara de arma de partículas. O defletor, que consiste de uma tela derretida para o fundo de um copo, é usado como uma plataforma para apoio tecidos durante o bombardeio. </li><li> Bombardeiam os tecidos usando uma arma de Partículas (nesta metodologia, usamos um Inflow Gun simples e barata de Partículas 3, PIG, projetado em nosso laboratório) da seguinte forma; a) abrir a válvula que conduz à vácuo para evacuar a câmara, b) após o vácuo atinge 760 mm (30 pol) Hg, ativar o solenóide e liberar o hélio para impulsionar as partículas, c) depois do bombardeamento de partículas, fechar a válvula da linha de vácuo e liberar o vácuo usando a válvula de escape. A pressão de hélio usado para acelerar partículas é de 50 PSI. </li><li> Após o vácuo é liberado, abra a porta da câmara para recuperar os cotilédones bombardeados e retornar o cotilédone lado, adaxial up, a OMS meio de cultura. Nota: Para quantificação e perfil de expressão, normalmente bombardear um mínimo de três cotilédones para cada DNA construir. Um controle positivo, que é geralmente um DNAconstrução que dá um bem estudado perfil de expressão gênica, é incluído como uma referência. </li></ol> III. Coleta automatizada de imagem <ol><li> Ligue a lâmpada de mercúrio e aguardar 30 min para a lâmpada para aquecer. </li><li> Ligue as fontes de energia para o Spot-RT câmera CCD (Diagnostic Instruments Inc., Sterling Heights, MI, EUA) e da plataforma robótica controlador do motor, que impulsiona o movimento da plataforma robótica. </li><li> Definir o conjunto de filtro para detecção de GFP (GFP2 conjunto de filtros;.. Nm Ex 480/40, Em 510 LP) em um microscópio de dissecação MZFLIII (Leica, Heerbrugg, Suíça). </li><li> Esterilizar o espessamento de policarbonato tampas placa de Petri por aspersão com etanol 70%. As tampas especializado, usado para cobrir a base placa de Petri evitar a condensação durante a coleta de imagens 4. </li><li> Coloque as placas contendo cotilédones bombardeados na plataforma robótica (Arrick Robotics, Hurst, TX, EUA) do sistema automatizado de imagem coleção. A plataforma robótica é impulsionado por um conjunto motor de passo e consiste de uma mesa para fixação de 8 placas de Petri. A plataforma é construída em policarbonato, polipropileno e alumínio. Placas são fixadas na posição apertando um plástico laterais parafuso de fixação. </li><li> Abra o aplicativo de software personalizado que controla tanto a plataforma robótica e de aquisição de imagem. Além disso, abra o software controlador de interruptor de luz branca. </li><li> No &quot;movimento do motor&quot;, clique em &quot;motor ligado&quot; e &quot;motor home&quot;. Depois que o software orienta a plataforma para a posição inicial, estamos prontos para começar a introduzir posições para cada cotilédone. </li><li> No &quot;movimento do motor&quot;, selecione a primeira placa. A plataforma será a posição do centro da placa de Petri no âmbito do objectivo do microscópio. Usando os botões de distância em movimento, precisamente a posição do cotilédone primeira coleção de imagens. Com o controlador de luz branca em diante, a região de destino pode ser observado através do monitor de computador ligando o &quot;live mode&quot; recurso. </li><li> Para o cotilédone em primeiro lugar, definir o foco e ampliação (ampliação 1.6x é o preferido), utilizando os botões do manual sobre o microscópio de dissecação. Foco ajustes para os cotilédones restantes no mesmo prato são feitos por meio de três parafusos de nivelamento localizados abaixo de cada prato, sobre a plataforma robótica. </li><li> Uma vez que a região de interesse foi definida, clique no botão &quot;adicionar esta posição&quot; botão. O software irá adicionar as coordenadas da região a um arquivo de agendamento posição ea plataforma irá retornar para o centro da placa. </li><li> Conjunto de posições e foco de todas as restantes cotilédones em pratos utilizando os botões de distância em movimento e parafusos de nivelamento manual. Depois de todas as coordenadas de todos os cotilédones foram inseridos, gravar as coordenadas cronograma posição. </li><li> Inserir os parâmetros coleção de imagens. Na &quot;imagem definição&quot;, selecione o tipo de luz desejada, branco ou azul. Para a detecção de GFP, apenas a luz azul deve ser usado. Digite também a definição de exposição. Apesar de podermos modificar o tempo de exposição, independentemente de cor vermelha, azul e verde, que normalmente usam as mesmas configurações para GFP foto-documentação (20, 14 e 14 seg para o canal vermelho, verde e azul, respectivamente) o que nos permite fazer diretos e comparações consistentes entre construções de DNA diferentes. </li><li> Na &quot;imagem setting&quot; mesmo guia, especifique uma pasta vazia onde as imagens serão armazenadas. Cada série de imagens serão salvas dentro dessa pasta mestre em pastas independentes, numerados seqüencialmente de acordo com a ordem das posições são para os cotilédones. </li><li> Vá para a &quot;captura de controle de tempo&quot; guia e definir a imagem intervalo de tempo de aquisição e número total de ciclos de coleta de imagem. As imagens são geralmente coletadas a cada hora para 100 h, gerando bem definidos perfis de expressão gênica. </li><li> Iniciar a aquisição da imagem clicando em &quot;agenda correr!&quot; botão localizado na &quot;posição cronograma&quot; guia. </li><li> No final da coleção de imagens 100 h, a transferência de todas as imagens do computador que controla o robô para qualquer unidade de grande capacidade de disco rígido ou computador para análise de imagem adicional. Imagens de alta resolução (1600 x 1200 pixels) são coletadas como TIF arquivos medição ~ 5 Mb cada. </li></ol> IV. Análise de Imagem <ol><li> Montar o 100 imagens seqüenciais de cada pasta usando o Adobe ImageReady. <ol><li> Abra ImageReady e importar todas as imagens seqüenciais que compõem uma série de quadros. </li><li> Redimensionar imagens originais de 800 x 600 pixels. Imagens coletadas são de alta resolução, que gera arquivos grandes que podem tornar o processamento de imagem lento. </li><li> Percorrer as imagens e encontrar um ponto (s) visível na maioria das imagens. </li><li> Zoom de até 300% no local selecionado (s). Alinhamento de imagens usando maior ampliação permite um registro mais preciso. </li><li> Inserir uma camada em cima de todas as imagens e certifique-se visível em todos os quadros. Marcar o ponto de localização (s) usando o &quot;pincel&quot; ferramenta. </li><li> Começar a alinhar todos os quadros utilizando o &quot;move&quot; ferramenta e tendo as marcas sobre a camada como uma referência. </li><li> Quando o alinhamento for concluído, delete a camada usada como referência e guardar as imagens como um único arquivo &quot;PSD&quot;. Além disso, exportar todos os quadros como &quot;mov&quot; único arquivo utilizando a mais alta resolução. Alinhamento manual de cada série de imagens leva ~ 10 min. </li></ol></li><li> Realizar a quantificação da expressão gênica usando ImageJ. <ol><li> Abra o software ImageJ e abrir o &quot;mov&quot; arquivo salvo anteriormente no ImageReady. </li><li> Usando a ferramenta de selecionar, escolher uma área de 400 x 300 pixel e recortar a imagem. Este novo arquivo deve ser salvo como um &quot;avi&quot; arquivo. </li><li> Separe as imagens seqüenciais, localizado no &quot;avi&quot; novo arquivo em canais vermelho, azul e verde, clicando em &quot;imagem&quot;, &quot;cor&quot; e &quot;split RGB&quot; no ImageJ. </li><li> Subtrair a fluorescência de fundo de todas as imagens nos canais verde e vermelho. Usando a série de canal verde da imagem, selecionar uma área de 20 x 20 pixels de uma região com os não-células que expressam e registrar sua localização no &quot;Gerenciador de ROI&quot; ferramenta, para que a mesma área serão selecionados em ambos os canais. Com os 20 x 20 pixel quadrado ativo no canal verde, vá para o comando &quot;plugins&quot; localizado na barra de tarefas do ImageJ e depois clique em &quot;subtrair ROI medido para cada fatia&quot; plugin-ferramenta. </li><li> No ImageJ, clique em &quot;Imagem&quot;, &quot;ajustar&quot; e então &quot;limite&quot; para definir o segmento ou expressando GFP-pixels. Ajustar os níveis de threshold arrastando a barra na janela do limite para obter um tamanho de ponto média de 20-30 pixels. </li><li> Determinar a expressão GFP usando um plugin que nós projetamos para medir a média em tons de cinza por pixel valor eo número total de GFP-expressando pixels. </li><li> Copiar a saída em tons de cinza significa valores em ImageJ e cole em Microsoft Office Excel. Calcular a expressão GFP para cada canal (vermelho e verde) através da multiplicação da média em tons de cinza por pixel valor pelo número total de GFP-expressando pixels para cada canal. A soma dos valores de expressão para ambos os canais dá a expressão GFP. Valores podem ser usados ​​para ilustrar perfis de expressão gênica e fazer comparações diretas. Lapso de tempo animações também podem ser gerados usando &quot;mov&quot; ou &quot;avi&quot; arquivos, proporcionando uma visualização única e clara do perfil de expressão gênica. </li></ol></li></ol> Representante Resultados V. A coleta e análise de imagem robótica procedimento (Fig. 1) relataram aqui permite a aquisição de uma grande quantidade de dados quantitativos sobre a expressão do gene em um curto período de tempo. Para a caracterização de plantas promotor usando o gene GFP, esta metodologia não só é útil para criar perfis de expressão transitória (Fig. 2), mas também a pista em uma expressão de GFP maneira detalhada em transitoriamente e tecidos da planta estavelmente transformada 5,6. Curto lapso de tempo animações geradas com as imagens coletadas seqüenciais são uma ferramenta valiosa para análises em profundidade da expressão gênica ao longo do tempo nos tecidos vegetais. Esta metodologia também tem grande aplicação para avaliar os fatores que afetam diretamente a expressão do gene. Por exemplo, a expressão GFP transitória sob a presença de supressores diferentes de silenciamento de origem viral tem sido estudada com sucesso usando nossa coleção de imagens automatizadas e sistema de análise de 7,8. <img src="/files/ftp_upload/1733/1733fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Procedimento de análise de imagem consiste em quatro etapas principais. (A) Aquisição de série de imagens usando o sistema de coleta de robótica imagem, (B) a separação das imagens em canais vermelho, azul e verde, (C) segmentação dos pixels expressar ajustando os níveis de limiar, e (D) a obtenção dos resultados de saída contendo os tons de cinza e os valores expressando GFP-contagem foco. <img src="/files/ftp_upload/1733/1733fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Gráfico mostrando diferentes perfis de expressão transitória impulsionada pelos promotores de plantas fundido a GFP. Os dados foram coletados através do nosso sistema de coleta de robótica imagem e analisados ​​com ImageReady e software ImageJ.

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	<li>Murashige, T., Skoog, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+revised+medium+for+rapid+growth+and+bioassays+with+tobacco+tissue+cultures.">A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures.</a> Physiol Plant. 15, 473-497 (1962).</li><li>Gamborg, O. L., Miller, R. A., Ojima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutrient+requirements+of+suspension+cultures+of+soybean+root+cells.">Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells.</a> Exp Cell Res. 50, 150-158 (1968).</li><li>Finer, J. J., Vain, P., Jones, M. W., McMullen, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+particle+inflow+gun+for+DNA+delivery+to+plant+cells.">Development of the particle inflow gun for DNA delivery to plant cells.</a> Plant Cell Rep. 11, 232-238 (1992).</li><li>Finer, J. E., Finer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+reducing+moisture+condensation+on+Petri+dish+lids.">A simple method for reducing moisture condensation on Petri dish lids.</a> Plant Cell Tiss Org. 91, 299-304 (2007).</li><li>Buenrostro-Nava, M. T., Ling, P. P., Finer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+35S+and+Lectin+promoters+in+transgenic+soybean+tissue+using+an+automated+image+acquisition+system+and+image+analysis.">Comparative analysis of 35S and Lectin promoters in transgenic soybean tissue using an automated image acquisition system and image analysis.</a> Plant Cell Rep. 25, 290-296 (2006).</li><li>Chiera, J. M., Bouchard, R. A., Dorsey, S. L., Park, E. H., Buenrostro-Nava, M. T., Ling, P. P., Finer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+two+highly+active+soybean+(Glycine+max+(L.)+Merr.)+promoters+and+their+characterization+using+a+new+automated+image+collection+and+analysis+system.">Isolation of two highly active soybean (Glycine max (L.) Merr.) promoters and their characterization using a new automated image collection and analysis system.</a> Plant Cell Rep. 26, 1501-1509 (2007).</li><li>Chiera, J. M., Lindbo, J. A., Finer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+and+extension+of+transient+GFP+expression+by+the+co-introduction+of+a+suppressor+of+silencing.">Quantification and extension of transient GFP expression by the co-introduction of a suppressor of silencing.</a> Transgenic Res. 17, 1143-1154 (2008).</li><li>Dhillon, T., Chiera, J. M., Lindbo, J. A., Finer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+evaluation+of+six+different+viral+suppressors+of+silencing+using+image+analysis+of+transient+GFP+expression.">Quantitative evaluation of six different viral suppressors of silencing using image analysis of transient GFP expression.</a> Plant Cell Rep. 28, 639-647 (2009).</li></ol>

O uso da robótica tem aplicações enormes em diferentes aspectos da vida humana, especificamente, os robôs foram efetivamente utilizados para realizar atividades em ambientes perigosos, para automatizar as atividades tedioso e complexo, e para realizar tarefas de forma mais precisa. Em biologia molecular e, especificamente, as análises de expressão gênica, os robôs podem ajudar a controlar não apenas as características dos genes, mas também o crescimento de tecido e desenvolvimento ao longo do tempo. Muitos fenômenos biológicos ocorrem de forma dinâmica, que pode ser difícil de seguir por meio de observações único ponto do tempo. O uso do gene GFP para estudos de expressão traz vantagens adicionais para observar a resposta tecidual e crescimento. Para os nossos procedimentos experimentais, GFP nos permite acompanhar a expressão do gene na mesma peça de tecido ao longo do tempo como detecção de GFP é um não-destrutivo. Além disso, a nossa versão da proteína GFP é suficientemente estável para permitir a detecção, mas também mostra algumas volume de negócios para minimizar a acumulação nos tecidos da planta, permitindo-nos acompanhar a ascensão e queda da expressão gênica. Nós já utilizaram nosso colecção de imagens robótica e sistema de análise para uma ampla gama de aplicações. Prevemos um elevado potencial para muitas aplicações biológicas, onde uma compreensão da dinâmica de um fenômeno é desejada. Por exemplo, o crescimento eo desenvolvimento dos tecidos vegetais podem ser rastreados usando o nosso sistema dando insights valiosos / informação sobre estes processos. Além disso, a dinâmica do transporte de proteínas usando genes repórter como GFP, pode ser facilmente visualizado utilizando lapso de tempo animações. A metodologia descrita neste relatório é tecnicamente complexo, mas conceitualmente simples. Nossos resultados são robustos e novas aplicações estão continuamente a ser descoberto.

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		<div>
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		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>ImageJ</td>
<td>Software</td>
<td>U. S. National Institutes of Health</td>
<td>&nbsp;</td>
<td><a href="http://www.rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a></td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

robotics and dynamic image analysis for studies of gene expression in plant tissues

Expressão de genes em tecidos vegetais é tipicamente estudada por extração destrutiva de compostos de tecidos de plantas para<em&gt; In vitro</em&gt; Análises. Os métodos aqui apresentados utilizam a proteína verde fluorescente (<em&gt; Gfp</em&gt;) Gene para o monitoramento contínuo de expressão gênica em as mesmas peças de tecidos, ao longo do tempo. O<em&gt; Gfp</emGene&gt; foi colocado sob controlo regulamentar dos diferentes promotores e introduzido nos tecidos lima feijão cotiledonar via bombardeamento de partículas. Cotilédones foram então colocados em um sistema robótico imagem coleção, que consistia de um microscópio de fluorescência de dissecação com uma câmera digital e um 2-dimensional plataforma robótica de design personalizado para permitir uma fixação segura de pratos da cultura. As imagens foram coletadas de tecidos cotiledonares a cada hora para 100 horas para gerar perfis de expressão de cada promotor. Cada série de 100 imagens coletadas foi submetido ao alinhamento da imagem manual usando ImageReady a certeza de que expressando GFP-focos foram consistentemente mantida dentro de campos selecionados de análise. Regiões específicas da série medindo 300 x 400 pixels, foram selecionados para análise mais aprofundada para fornecer medições GFP Intensidade usando o software ImageJ. Imagens lote foram separados para os canais vermelho, verde e azul e expressando GFP-áreas foram identificadas usando o recurso de limite de ImageJ. Depois de subtrair a fluorescência de fundo (subtração de valores de cinza de não expressar pixels de cada pixel) em respectivos canais vermelho e verde, a intensidade da GFP foi calculado multiplicando o valor médio em tons de cinza por pixel pelo número total de GFP-expressando pixels em cada canal, e então adicionar esses valores para ambos os canais vermelho e verde. Valores de intensidade GFP foram coletadas para todos os 100 pontos de tempo para produzir perfis de expressão. Variações nos perfis de expressão GFP resultou de diferenças em fatores como força promotora, a presença de um supressor de silenciamento, ou a natureza do promotor. Além de quantificação de intensidade GFP, a série de imagens também foram utilizados para gerar lapso de tempo animações usando ImageReady. Lapso de tempo animações revelou que a clara maioria das células mostrou um aumento relativamente rápido da expressão GFP, seguido por um declínio lento. Algumas células ocasionalmente exibido uma súbita perda de fluorescência, que pode ser associada à morte celular rápida. Aparente de transporte de GFP através da membrana e da parede celular de células adjacentes também foi observada. Lapso de tempo animações forneceu informações adicionais que não poderiam ser obtidos através de perfis GFP Intensidade ou única vez coleções de imagens ponto.

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Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

Apresentamos um método para a introdução, acompanhamento e análise quantitativa de expressão GFP em células vegetais. Este método utiliza um design personalizado sistema de robótica para semi-contínua coleção de imagens de um grande número de amostras, ao longo do tempo. Nós também demonstrar o uso de ImageJ e ImageReady para análise de séries de imagens.

Robótica e Análise de Imagem Dinâmica de Estudos de Expressão Gênica em Tecidos Vegetais

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods ...

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Research

JoVE Journal

Biology

12.4K visualizações.  The Ohio State University. Apresentamos um método para a introdução, acompanhamento e análise quantitativa de expressão GFP em células vegetais. Este método utiliza um design personalizado sistema de robótica para semi-contínua coleção de imagens de um grande número de amostras, ao longo do tempo. Nós também demonstrar o uso de ImageJ e ImageReady para análise de séries de imagens.

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The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Elaboração de culturas de células primárias hematopoéticas de medula óssea de camundongos para Eletroporação

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Biologia

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA regulators: microRNAs, which are produced from non-protein coding genes and short interfering RNAs (siRNAs). Plants use RNAi to control transposons and to exert tight control over developmental processes such as flower organ formation and leaf development2,3,4. Plants also use RNAi to defend themselves against infection by viruses. Consequently, many viruses have evolved suppressors of gene silencing to allow their successful colonization of their host5.
Virus-induced gene silencing (VIGS) is a method that takes advantage of the plant RNAi-mediated antiviral defense mechanism. In plants infected with unmodified viruses the mechanism is specifically targeted against the viral genome. However, with virus vectors carrying sequences derived from host genes, the process can be additionally targeted against the corresponding host mRNAs. VIGS has been adapted for high-throughput functional genomics in plants by using the plant pathogen Agrobacterium tumefaciens to deliver, via its Ti plasmid, a recombinant virus carrying the entire or part of the gene sequence targeted for silencing. Systemic virus spread and the endogenous plant RNAi machinery take care of the rest. dsRNAs corresponding to the target gene are produced and then cleaved by the ribonuclease Dicer into siRNAs of 21 to 24 nucleotides in length. These siRNAs ultimately guide the RNA-induced silencing complex (RISC) to degrade the target transcript2.
Different vectors have been employed in VIGS and one of the most frequently used is based on tobacco rattle virus (TRV). TRV is a bipartite virus and, as such, two different A. tumefaciens strains are used for VIGS. One carries pTRV1, which encodes the replication and movement viral functions while the other, pTRV2, harbors the coat protein and the sequence used for VIGS6,7. Inoculation of Nicotiana benthamiana and tomato seedlings with a mixture of both strains results in gene silencing. Silencing of the endogenous phytoene desaturase (PDS) gene, which causes photobleaching, is used as a control for VIGS efficiency. It should be noted, however, that silencing in tomato is usually less efficient than in N. benthamiana. RNA transcript abundance of the gene of interest should always be measured to ensure that the target gene has efficiently been down-regulated. Nevertheless, heterologous gene sequences from N. benthamiana can be used to silence their respective orthologs in tomato and vice versa8.

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

Description of a virus-induced gene silencing (VIGS) method for knock-down of gene expression in Nicotiana benthamiana and tomato.

Induzida por vírus silenciamento gênico (VIGS) em Nicotiana benthamiana Tomate e

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

Spinal Cord Electrophysiology

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord dissection and preparation of recording bath artificial cerebrospinal fluid used for locomotor studies. Once dissected, the spinal cord ventral nerve roots can be attached to a recording electrode to record the electrophysiologic signals of the central pattern generating circuitry within the lumbar cord.

A demonstration of the isolation of neonatal mouse spinal cord for electrophysiologic studies.

Spinal Cord Eletrofisiologia

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Usando o Sistema de Eletroporação Gene Pulser MXcell para transfectar pilhas com Alta Eficiência

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

Usando um contador de células automatizadas para simplificar Estudos da Expressão Gênica: Knockdown siRNA de Expressão IL-4 Gene Dependente em células NAMALWA

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Seções incluído em parafina e congelados de Drosophila Músculos Adulto

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

Na reconstituição in vitro da atividade T. Telomerase castaneum

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene expression in these tissues. Thus, to analyze cell-specific gene expression profiles from Drosophila tissues, it may be necessary to isolate specific cell types with high purity and at sufficient yields for downstream applications such as transcriptional profiling and chromatin immunoprecipitation. However, the irregular cellular morphology in tissues such as the central nervous system, coupled with the rare population of specific cell types in these tissues, can pose challenges for traditional methods of cell isolation such as laser microdissection and fluorescence-activated cell sorting (FACS). Here, an alternative approach to characterizing cell-specific gene expression profiles using affinity-based isolation of tagged nuclei, rather than whole cells, is described. Nuclei in the specific cell type of interest are genetically labeled with a nuclear envelope-localized EGFP tag using the Gal4/UAS binary expression system. These EGFP-tagged nuclei can be isolated using antibodies against GFP that are coupled to magnetic beads. The approach described in this protocol enables consistent isolation of nuclei from specific cell types in the Drosophila larval central nervous system at high purity and at sufficient levels for expression analysis, even when these cell types comprise less than 2% of the total cell population in the tissue. This approach can be used to isolate nuclei from a wide variety of Drosophila embryonic and larval cell types using specific Gal4 drivers, and may be useful for isolating nuclei from cell types that are not suitable for FACS or laser microdissection.

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila tissues often contain a heterogeneous mixture of cell types.&#160;To examine gene expression in specific cell types from a particular tissue, nuclei can be genetically tagged and subsequently isolated using an affinity-based approach. Isolated nuclei can be used for downstream applications such as gene expression analysis and chromatin immunoprecipitation.

Isolamento à base de Afinidade de Tagged Núcleos de<em&gt; Drosophila</em&gt; Tecidos para Análise de Expressão Gênica

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Análise da Global RNA Síntese no nível da célula única seguinte hipóxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ imaging data is time consuming and subject to bias. Automated signal analysis algorithms based on region of interest (ROI) detection have been implemented for one-dimensional line scan measurements, but there is no current algorithm which integrates optimized identification and analysis of ROIs in two-dimensional image sequences. Here an algorithm for rapid acquisition and analysis of ROIs in image sequences is described. It utilizes ellipses fit to noise filtered signals in order to determine optimal ROI placement, and computes Ca2+ signal parameters of amplitude, duration and spatial spread. This algorithm was implemented as a freely available plugin for ImageJ (NIH) software. Together with analysis scripts written for the open source statistical processing software R, this approach provides a high-capacity pipeline for performing quick statistical analysis of experimental output. The authors suggest that use of this analysis protocol will lead to a more complete and unbiased characterization of physiologic Ca2+ signaling.

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Here a novel region of interest analysis protocol based on sorting best-fit ellipses assigned to regions of positive signal within two-dimensional time lapse image sequences is demonstrated. This algorithm may enable investigators to comprehensively analyze physiological Ca2+ signals with minimal user input and bias.

Automated Análise de Ca dinâmico<sup&gt; 2 +</sup&gt; Sinais em seqüências de imagens

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ ...