Skidmore Faculdade Desenvolvimento Grant financiou a elaboração e publicação deste manuscrito.

1. Montagem Embriões (após a conclusão da técnica de visualização selecionado, como imunocitoquímica, hibridização in situ, etc) <ol><li> Coloque embriões num prato 35 milímetros de Petri cheia com tampão de escolha (Figura 1A). A escolha do tampão baseia-se no procedimento de marcação. Tipicamente, tampões à base de PBS, são adequados. </li><li> Sob um microscópio de dissecação, e usando uma pinça, fixar a cabeça com um par de pinças, enquanto puxa a gema de distância com o outro par (Figura 1B). Como alternativa, use um pino de inseto em um suporte inseto pin para puxar suavemente a gema. </li><li> Usando o póquer embrião (linha de pesca (0,41 mm de diâmetro) ou colado a um tubo capilar ou uma pipeta de Pasteur) mover os embriões de uma parte da placa de Petri que não tem uma grande quantidade de detritos gema (Figuras 1C-D). </li><li> Com uma pipeta Pasteur de vidro, aspirar os embriões em tão pouco líquido possível, e gSuavemente pipeta-los sobre uma lâmina (Figura 1E). </li><li> Gentilmente pavio fora o excesso de líquido usando um laboratório wipe. Evitar o contacto com os embriões. </li><li> Adicione uma gota de meio de montagem de embriões. No caso de etiquetas fluorescentes, usar um reagente Antifade de escolha. Para sinais colorimétricos, glicerol a 70% pode ser usado como um meio de montagem. </li><li> Usando o pôquer embrião, orientar os embriões em seus lados em linhas (Figura 1F). </li><li> Adicione uma &quot;bagatela&quot; de vaselina ou graxa de vácuo elevado para cada canto de uma lamela (Figura 1G). Isso evita danos de embrião de compressão excessiva. </li><li> Coloque lamela (lado vaselina para baixo) em cima de embriões (Figura 1H). </li><li> Bata suavemente na lamela em cada canto até o meio de montagem (70% de glicerol ou reagente de montagem anti-fade) está tocando a lamela (Figura 1H). </li><li> Se necessário, adicione mais mídia montagem pipetando ao lado do coverslip, usando uma pipeta, no intervalo de 20-200 ml. Ele vai pavio para baixo. </li><li> Usando um laboratório de limpar, completamente limpa ao redor da lamela. Esteja certo de não aplicar pressão sobre a lamela, pois isso irá danificar embriões. Essa área deve ser seco e não tem vaselina ou meios de montagem do mesmo. </li><li> Use unha polonês para selar em torno da borda da lamela (Figura 1I). </li></ol>

<ol>
	<li>Gribble, S. L., Nikolaus, O. B., Dorsky, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+function+of+Dbx+genes+in+the+zebrafish+spinal.">Regulation and function of Dbx genes in the zebrafish spinal.</a> Dev. Dyn. 236 (12), 3472-3483 (2007).</li><li>Bonner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midline+crossing+is+not+required+for+subsequent+pathfinding+decisions+in+commissural+neurons.">Midline crossing is not required for subsequent pathfinding decisions in commissural neurons.</a> Neural Dev. 7 (1), 18 (2012).</li><li>Ross, A. B. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+brain+development+and+organogenesis+in+zebrafish+using+immobilized+embryonic+explants.">Imaging brain development and organogenesis in zebrafish using immobilized embryonic explants.</a> Dev Dyn. 228 (3), 464-474 (2003).</li><li>Deschene, E. R., Barresi, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Targeted+Embryonic+Chimeras:+Zebrafish+Gastrula+Cell+Transplantation.">Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation.</a> J. Vis. Exp. (31), (2009).</li></ol>

Não existem interesses financeiros concorrentes para qualquer autor.

Montagem lateral de embriões Zebrafish auxiliares de visualização fixa de desenvolvimento da medula espinhal. Através da remoção da gema de bola, a distância de trabalho necessária para a imagem microscópica excepcional é reduzida. Os resultados representativos foram limitados à fase 24 hpf, no entanto, esta técnica pode ser usado tão cedo quanto 18 hpf, embora embriões precoces são mais difíceis de dissecar devido ao tamanho do embrião e a fragilidade do tecido. Esta técnica é também aplicável aos embriões mais velhos do que 24 hpf. Ajudado pela claridade óptica do peixe-zebra embrionário, a capacidade de executar telas genéticos para a frente, a genética reversa e abordagens transgênicas, vários processos de desenvolvimento podem ser investigadas. Isto inclui os índices de mitose de células progenitoras neuronais com marcadores como BrdU e anti-fosfo-histona 04-06 março e padronização através da expressão de marcadores progenitoras neuronais e gliais do pax, NKX, dbx, e oligo families 1,4-6. Reagentes que relatam determinação glial e neuronal (tal como a proteína glial fibrilar ácida (GFAP) e HuC / D) 1,4,5,10 pode ser usado. Subtipo diferenciação neuronal pode ser analisado através da expressão da ilhota, VSX, engrailed e genes gata 1,4-6. E, finalmente, a análise de orientação axónio é possível por meio de anticorpos, tais como anti-tubulina acetilada, 3A10, e ZNP-1 2,11,12. Embora outros sistemas modelo de vertebrados (mouse e galinha) são usados ​​para estudar o desenvolvimento da medula espinhal, apenas o peixe-zebra permite a visualização simultânea de todos os eixos de desenvolvimento do embrião intacto. A limitação óbvia para esta abordagem é que os embriões são fixas, que se opõe a uma imagem ao vivo. De facto, a remoção do (ou dano para) os resultados de gema de morte embrionária rápida, pelo que não é possível reduzir a distância de trabalho em embriões vivos utilizando esta técnica. No entanto, a alta ampliação co espinhalrd imagem em embriões vivos é possível. A fim de preservar a gema durante a imagem ao vivo, os embriões podem ser colocados em lâminas de depressão, que proporcionam um espaço maior entre a amostra e a lamela. Alternativamente, vários 22 milímetros x 22 milímetros lamelas podem ser colados ou deslizamento de um 3 em x 1 em lâminas microscópicas. As lamelas servir como uma &quot;ponte&quot; para a lamela sobrejacente. Se os embriões são mais velhos do que 18 hpf, tricaina é usada para anestesiar os embriões para evitar o movimento. Enquanto uma distância de trabalho de 0,288 milímetros é necessário para embriões deyolked em 24 hpf, quando se trabalha com embriões vivos incorporados em agarose, com gema intacta, uma lente microscópica com uma distância de trabalho de 3,3 mm é suficiente. Alternativamente, culturas de explantes derivados de embriões deyolked pode ser visualizada utilizando uma técnica de imobilização de coágulo de plasma 13. Várias populações de células podem ser observados através da utilização de proteínas fluorescentes codificados geneticamente, tais como a GFP, mCherry, ou o photoconcorante convertíveis Kaede (para citar alguns). Além disso, as células marcadas com fluorescência dentro embriões quiméricos também pode ser visto com esta abordagem 14. A técnica de montagem consistente que é estável durante meses é uma ferramenta fundamental para os biólogos do desenvolvimento e celulares. Esta técnica simples é reprodutível, permitindo uma fácil comparação entre diferentes ensaios experimentais. Além disso, o alinhamento dos embriões em linhas prontamente permitir a identificação de embriões específicos para análise posterior.

A visualização da medula espinal no peixe-zebra é inibida por um número de factores. Devido à espessura de somitos sobrepostas e o local interno da medula espinal, a uma distância consideravelmente longo trabalho é necessário para alta resolução celular. A bola gema (que ainda está presente durante os primeiros estágios de neurogênese) aumenta ainda mais a distância de trabalho necessário, e é facilmente danificado pela pressão de uma lamela. Além disso, os restos de gema danificada proíbe clara visualização do tecido. Embora sejam possíveis cortes transversais no eixo dorso-ventral (DV), eles não são facilmente permitir a visualização simultânea no ântero-posterior (AP) Eixo 1. Para superar esses obstáculos, os embriões são dissecados e montados em lâminas. Este procedimento proporciona vários benefícios. Primeiro, os embriões de peixe-zebra prontamente se deitar com a lateral voltada para cima, o que facilita a visualização do eixo AP. Em segundo lugar, a remoção da gema ball diminui a distância de trabalho necessário, e limita detritos. Em terceiro lugar, este processo de montagem permite tanto fluorescente e a microscopia de campo claro. Em quarto lugar, os embriões montados são estáveis ​​durante meses a 4 ° C, permitindo a visualização exemplar prolongada. Finalmente, a progressão do desenvolvimento ocorre em que segmentos anteriores são mais maduros do que os segmentos posteriores. A fim de assegurar que encenadas hemisegments espinhais combinados são comparados entre os embriões, que recobre tecido somito é utilizado como um guia. Por exemplo, a décima somito mais posterior sobrepõe hemisegmento espinal décimo, o que é equivalente desenvolvente em embriões combinado da fase. Este procedimento de montagem de embriões intactos permite uma fácil identificação de somitos. Usamos genética e genes tecnologias knock-down para estudar os mecanismos de orientação do axônio na medula espinhal em desenvolvimento. Em particular, nós determinamos que robo2, robo3, e DCC são necessários para comissural primária Ascending (COPA) pathfinding axônio. Usando o procedimento de montagem descrito aqui, fomos capazes de examinar o crescimento ventral, cruzamento da linha média, a largura da comissura, dorsal e 2,3 crescimento anterior. Este processo de montagem pode também ser aplicado para DV ou AP padronização da medula espinhal. Temos utilizado este procedimento para determinar os papéis díspares de efetores Wnt a jusante padronização DV da medula espinhal. Usando esta montagem, fomos capazes de obter resolução de marcadores DV no nível da célula única, e determinar mudanças padronização minutos como resultado da alteração da recepção do sinal Wnt 4,5. Este procedimento também permite a montagem para o cálculo do índice mitótico através de anti-phosphohistone 3 ou rotulagem BrdU (proliferação progenitor) diferenciação 5.

<table><tbody><tr><td>&lt;p&gt;Petri dishes 35 mm x 10 mm&lt;/p&gt;</td><td>VWR</td><td>&lt;p&gt;25373-041&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Dumont Forceps #3&lt;/p&gt; </td><td>Fisher Scientific</td><td>&lt;p&gt;NC9839169&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Cover glass&lt;/p&gt; </td><td>Fisher Scientific</td><td>&lt;p&gt;12-541-B22X22-1.5&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Slides&lt;/p&gt; </td><td>Fisher Scientific</td><td>&lt;p&gt;12-550-343&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;SlowFade Gold&lt;/p&gt; </td><td>Fisher Scientific</td><td>&lt;p&gt;S36936&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;ProLong Gold&lt;/p&gt; </td><td>Life Technologies</td><td>&lt;p&gt;P36934&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Petroleum Jelly&lt;/p&gt; </td><td>any grocery store</td><td>&lt;p&gt; &lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Loop Holders&lt;/p&gt; </td><td>VWR</td><td>&lt;p&gt;80094-482&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Insect Pins&lt;/p&gt; </td><td>Fine Science Tools</td><td>&lt;p&gt;26002-10&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Nickel Plated Pin Holders&lt;/p&gt; </td><td>Fine Science Tools</td><td>&lt;p&gt;26016-12&lt;/p&gt; &lt;p&gt; &lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;p&gt;Olympus Stereomicroscope&lt;/p&gt;</td><td>Olympus</td><td>&lt;p&gt;SZ61&lt;/p&gt;</td><td></td></tr></tbody></table>

dissection and lateral mounting of zebrafish embryos: analysis of spinal cord development

A medula espinhal peixe-zebra é um modelo de investigação eficaz para investigação do sistema nervoso por várias razões. Primeiro, genética, transgénicos e de genes abordagens de knockdown pode ser utilizado para examinar os mecanismos moleculares subjacentes ao desenvolvimento do sistema nervoso. Em segundo lugar, as grandes garras de embriões developmentally sincronizados fornecem grandes amostras experimentais. Em terceiro lugar, a claridade óptica do embrião zebrafish permite aos pesquisadores visualizar progenitor, glial, e as populações neuronais. Apesar de embriões de peixe-zebra são transparentes, espessura da amostra pode impedir a visualização microscópica eficaz. Uma razão para isso é o desenvolvimento conjunto do tecido da medula espinal e somito sobrejacente. Outra razão é a grande bola de gema, que ainda está presente durante os períodos de neurogênese cedo. Neste artigo, demonstramos microdissecção e remoção da gema em embriões fixos, que permite a visualização microscópica do tecido circundante, preservando somito. Nós also demonstrar montagem semipermanente de embriões de peixe-zebra. Isto permite a observação de neurodesenvolvimento nos eixos dorso-ventral e ântero-posterior, uma vez que preserva a tridimensionalidade do tecido.

Quando elucidar os mecanismos subjacentes a vários eventos de desenvolvimento, tais como padrões celular, diferenciação, e a orientação do axónio, é importante ser capaz de visualizar as células dentro do contexto do seu tecido. Defeitos padronização dorsoventral tipicamente apresentam-se como uma mudança ventral ou dorsal no domínio de fatores de transcrição expressão na pax, NKX ou famílias dbx 4. Às vezes, as mudanças podem ser sutis, compreendendo apenas alguns diâmetros celulares 4. Estudo transversal permite que este tipo de análise. No entanto, os reagentes com sinais mais fracos, ou secções transversais que não são perpendiculares ao eixo do AP pode limitar interpretação. Além disso, a análise transversal não facilmente levar em conta se as mudanças persistem no eixo AP, e baseia-se na disponibilidade de um criostato. Essa limitação é contornada por visualizações laterais da medula espinhal. Como pode ser visto na Figura 2B, nkx6.1 ARNm é distributed em aproximadamente a metade ventral da medula espinhal às 24 horas pós-fecundação (hpf), dentro do domínio progenitor. As células progenitoras são distinguíveis das células pós-mitóticas, devido à presença da placa de piso, que se encontra na parte mediana da medula espinal. Visualizado com DIC óptica, as células individuais são claramente distinguíveis, e um limite definido entre expressar e nonexpressing células é evidente. Saída do ciclo de células progenitoras é acompanhada por alterações na expressão de genes. Por exemplo, todos os neurônios pós-mitóticas expressar HuC / D que é detectável com imunocitoquímica 1,5. sondas de mRNA para ilhota, gata, e as famílias VSX rotular neurônios pós-mitóticas específicas de posição consistente e número dentro de cada hemisegmento medula espinhal 6. Além disso, os receptores de orientação do axónio, tais como aqueles na família robo são expressos em populações restritas de neurónios pós-mitóticos (Figura 2C) <sup&gt; 2,7,8. Montagem lateral de embriões permite contagens precisas de neurônios pós-mitóticas. Do mesmo modo, células progenitoras, que continuam a dividir pode ser quantificada com anti-fosfo-histona 3 imunocitoquímica, bem como a rotulagem BrdU. Além disso, a morte celular pode ser avaliada com TUNEL rotulagem 4-6. Aos 24 hpf, os axônios dos neurônios pós-mitóticas seguintes podem ser visualizados com vários métodos, e são distinguíveis no nível da célula única: Dorsal Lateral Ascendente (Dola), comissural primária Ascendente (COPA), comissural Secundária Ascendente (CoSA), Ventral Longitudinal Decrescente (estepe), Kolmer-Agdur (KA), bifurcando comissural / longitudinais (COB / L), circunferencial Crescente (CIA), circunferencial Descendente (CID), e Unipolar comissural Descendente (UCoD), Rohon-Barba (RB), neurônios motores ( M) 9. Os axônios estendem-se desde esses neurônios no dorsal, ventral, anterior e posterior direções. Eles ramo, cruzar a linha média, e sair tanto o dorsale medula espinal ventral. Quando combinado com microscopia confocal a laser, estes comportamentos celulares variadas são evidentes em embriões lateralmente montados, utilizando imunocitoquímica e proteínas fluorescentes geneticamente codificados como GFP 2. Na Figura 2D, ZNP-1 imunocitoquímica foi usado para rotular motoneurons desenvolvimento. Os motoneurónios sair da espinal medula ventral a inervam a musculatura desenvolver circundante. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50703/50703fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50703/50703fig1.jpg" width="500px" /> Figura 1. Dissecção e laterais montagem de embriões de peixe-zebra. (A) Após o processamento para imunofluorescência, hibridização in situ, etc, os embriões são colocados em um prato de 35 milímetros Petri cheia de PBT (PBS com 0,5% de Triton X-100) ou PTW (PBS com 0,1% de Tween-20). A gemabola (YB) é evidente. (B) A gema é removido por fixar a cabeça do embrião seguido de dissecção cuidadosa. (C) Um embrião de póquer (linha de pesca colada a uma pipeta de Pasteur) é usada para separar os embriões e os restos da gema (D). Embriões limpos são pipetadas para uma lâmina de microscópio, (E) e alinhados (F). Gelatina (G) de petróleo é aplicada aos cantos da lamela. (H) A lamela é colocada delicadamente em cima dos embriões em meio de montagem. (I) Nail polonês é usado para selar as bordas da lamela. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50703/50703fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 2" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50703/50703fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50703/50703fig2.jpg" width="500px" /> &lt;<html> strong&gt; Figura 2. Análise dos padrões de expressão gênica e axônio pathfinding em (A) Desenho de um embrião de peixe-zebra em 24 hpf lateralmente montado embriões de peixe-zebra.. Em BD, aproximadamente quatro hemisegments acima da extensão saco vitelino são visualizados (área de box). (B) nkx6.1 é expresso na medula espinal ventral, incluindo a placa de piso (FP). (C) robo3 é expresso em neurónios pós-mitóticos (PMN). A zona de placa de piso e progenitor não é evidente neste plano focal mais lateral. Em B, C, a espinal medula é delimitado por um suporte, no lado esquerdo da imagem. (D) confocal microscopia foi utilizado para a imagem ZNP-1 de imunofluorescência, que rotula axónios motores que saem da medula espinal ventral. Em todas as imagens, é anterior à esquerda e dorsal é para cima. A 40X distância de trabalho longa, imersão em água (NA 0,8) lente foi usada (3,3 mm).oad/50703/50703fig2highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Clique aqui para ver imagem ampliada.

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Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development

Processos de desenvolvimento, tais como a proliferação, a modelagem, diferenciação, e a orientação do axónio pode ser facilmente modelada na medula espinal do peixe-zebra. Neste artigo, nós descrevemos um procedimento de montagem para os embriões de peixe-zebra, que otimiza a visualização destes eventos.

Dissecção e montagem lateral de embriões Zebrafish: Análise de Desenvolvimento da Medula Espinhal

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene ...

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Research

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13.8K visualizações.  Skidmore College.  Processos de desenvolvimento, tais como a proliferação, a modelagem, diferenciação, e a orientação do axónio pode ser facilmente modelada na medula espinal do peixe-zebra. Neste artigo, nós descrevemos um procedimento de montagem para os embriões de peixe-zebra, que otimiza a visualização destes eventos. 

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Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method described here allows time-lapse analysis of normal and impaired kidney development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope equipped for structured illumination and z-stack acquisition. To visualize nephrogenesis, transgenic zebrafish (Tg(wt1b:GFP)) with fluorescently labeled kidney structures were used. Renal defects were triggered by injection of an antisense morpholino oligonucleotide against the Wilms tumor gene wt1a, a factor known to be crucial for kidney development.
The advantage of the experimental setup is the combination of a zoom microscope with simple strategies for re-adjusting movements in x, y or z direction without additional equipment. To circumvent focal drift that is induced by temperature variations and mechanical vibrations, an autofocus strategy was applied instead of utilizing a usually required environmental chamber. In order to re-adjust the positional changes due to a xy-drift, imaging chambers with imprinted relocation grids were employed.
In comparison to more complex setups for time-lapse recording with optical sectioning such as confocal laser scanning&#160;or light sheet microscopes, a zoom microscope is easy to handle. Besides, it offers dissecting microscope-specific benefits such as high depth of field and an extended working distance.
The method to study organogenesis presented here can also be used with fluorescence stereo microscopes not capable of optical sectioning. Although limited for high-throughput, this technique offers an alternative to more complex equipment that is normally used for time-lapse recording of developing tissues and organ dynamics.

The method described here allows time-lapse analysis of organ development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope capable of performing optical sectioning and simple strategies of readjustment to correct focal and planar drift.

Análise de Desenvolvimento de rim Zebrafish com imagem Time-lapse Usando um microscópio de dissecação Equipado para Seccionamento Optical

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Biologia do Desenvolvimento

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. In particular, posterior body elongation is an essential process in embryonic development by which multiple tissue deformations act together to direct the formation of a large part of the body axis. In order to observe this process by long-term time-lapse imaging it is necessary to utilize a mounting technique that allows sufficient support to maintain samples in the correct orientation during transfer to the microscope and acquisition. In addition, the mounting must also provide sufficient freedom of movement for the outgrowth of the posterior body region without affecting its normal development. Finally, there must be a certain degree in versatility of the mounting method to allow imaging on diverse imaging set-ups. Here, we present a mounting technique for imaging the development of posterior body elongation in the zebrafish D. rerio. This technique involves mounting embryos such that the head and yolk sac regions are almost entirely included in agarose, while leaving out the posterior body region to elongate and develop normally. We will show how this can be adapted for upright, inverted and vertical light-sheet microscopy set-ups. While this protocol focuses on mounting embryos for imaging for the posterior body, it could easily be adapted for the live imaging of multiple aspects of zebrafish development.

Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

Um método de montagem versátil para Long Term Imagens de Desenvolvimento Zebrafish

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

Vivem de imagem do cérebro Zebrafish embrionárias por microscopia confocal

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Biologia

Surgical Size Reduction of Zebrafish for the Study of Embryonic Pattern Scaling

In the developmental process, embryos exhibit a remarkable ability to match their body pattern to their body size; their body proportion is maintained even in embryos that are larger or smaller, within certain limits. Although this phenomenon of scaling has attracted attention for over a century, understanding the underlying mechanisms has been limited, owing in part to a lack of quantitative description of developmental dynamics in embryos of varied sizes. To overcome this limitation, we developed a new technique to surgically reduce the size of zebrafish embryos, which have great advantages for in vivo live imaging. We demonstrate that after balanced removal of cells and yolk at the blastula stage in separate steps, embryos can quickly recover under the right conditions and develop into smaller but otherwise normal embryos. Since this technique does not require special equipment, it is easily adaptable, and can be used to study a wide range of scaling problems, including robustness of morphogen mediated patterning.&#160;

Here, we describe a method for reducing the size of zebrafish embryos without disrupting normal developmental processes. This technique enables the study of pattern scaling and developmental robustness against size change.

Redução cirúrgica do tamanho do zebrafish para o estudo da escala padrão embrionária

In the developmental process, embryos exhibit a remarkable ability to match their body pattern to their body size; their body proportion is maintained ...

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues or cells. A difficulty with imaging whole embryo development is that zebrafish embryos grow substantially in length. When mounted as regularly done in 0.3-1% low melt agarose, the agarose imposes growth restriction, leading to distortions in the soft embryo body. Yet, to perform confocal time-lapse microscopy, the embryo must be immobilized. This article describes a layered mounting method for zebrafish embryos that restrict the motility of the embryos while allowing for the unrestricted growth. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations. To demonstrate the usability of this method, whole embryo vascular, neuronal and muscle development was imaged in transgenic fish for 55 consecutive hours. This mounting method can be used for easy, low-cost imaging of whole zebrafish embryos using inverted microscopes without requirements of molds or special equipment.

This article describes a method to mount fragile zebrafish embryos for extended time-lapse confocal microscopy. This low-cost method is easy to perform using regular glass-bottom microscopy dishes for imaging on any inverted microscope. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations.

Um método de montagem em camadas para a microscopia confocal de lapso de tempo prolongado de embriões zebrafish inteiros

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability to reinitiate spinal neurogenesis. However, some anamniotes including the zebrafish Danio rerio exhibit both sensory and functional recovery even after complete transection of the spinal cord. The adult zebrafish is an established model organism for studying regeneration following spinal cord injury, with sensory and motor recovery by 6&#160;weeks post-injury. To take advantage of in vivo analysis of the regenerative process available in the transparent larval zebrafish as well as genetic tools not accessible in the adult, we use the larval zebrafish to study regeneration after spinal cord transection. Here we demonstrate a method for reproducibly and verifiably transecting the larval spinal cord. After transection, our data shows sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury (dpi), with the C-bend movement detectable by 3 dpi and resumption of free swimming by 5 dpi. Thus we propose the larval zebrafish as a companion tool to the adult zebrafish for the study of recovery after spinal cord injury.

After spinal transection, adult zebrafish have functional recovery by six weeks post-injury. To take advantage of larval transparency and faster recovery, we present a method for transecting the larval spinal cord. After transection, we observe sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury, and C-bend movement by 3 days post-injury.

Transecção medular nos larval Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

Neurociência

A 3-D Tail Explant Culture to Study Vertebrate Segmentation in Zebrafish

Vertebrate embryos pattern their major body axis as repetitive somites, the precursors of vertebrae, muscle, and skin. Somites progressively segment from the presomitic mesoderm (PSM) as the tail end of the embryo elongates posteriorly. Somites form with regular periodicity and scale in size. Zebrafish is a popular model organism as it is genetically tractable and has transparent embryos that allow for live imaging. Nevertheless, during somitogenesis, fish embryos are wrapped around a large, rounding yolk. This geometry limits live imaging of PSM tissue in zebrafish embryos, particularly at higher resolutions that require a close objective working distance. Here, we present a flattened 3-D tissue culture method for live imaging of zebrafish tail explants. Tail explants mimic intact embryos by displaying a proportional slowdown of axis elongation and shortening of rostrocaudal somite lengths. We are further able to stall axis elongation speed through explant culture. This, for the first time, enables us to untangle the chemical input of signaling gradients from the mechanistic input of axial elongation. In future studies, this method can be combined with a microfluidic setup to allow time-controlled pharmaceutical perturbations or screening of vertebrate segmentation without any drug penetration concerns.

Here, we present the protocol for 3-D tissue culture of the zebrafish posterior body axis, enabling live study of vertebrate segmentation. This explant model provides control over axis elongation, alteration of morphogen sources, and subcellular resolution tissue-level live imaging.

Uma cultura de explanta de cauda 3D para estudar segmentação de vertebrados em zebrafish

Vertebrate embryos pattern their major body axis as repetitive somites, the precursors of vertebrae, muscle, and skin. Somites progressively segment from ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing organisms, combined with the embryonic optical clarity, served as initial compelling attributes of this model. Over the past two decades, the success of this model has been further propelled by its amenability to large-scale mutagenesis screens and by the ease of transgenesis. More recently, gene-editing approaches have extended the power of the model.
For neurodevelopmental studies, the zebrafish embryo and larva provide a model to which multiple methods can be applied. Here, we focus on methods that allow the study of an essential property of neurons, electrical excitability. Our preparation for the electrophysiological study of zebrafish spinal neurons involves the use of veterinarian suture glue to secure the preparation to a recording chamber. Alternative methods for recording from zebrafish embryos and larvae involve the attachment of the preparation to the chamber using a fine tungsten pin1,2,3,4,5. A tungsten pin is most often used to mount the preparation in a lateral orientation, although it has been used to mount larvae dorsal-side up4. The suture glue has been used to mount embryos and larvae in both orientations. Using the glue, a minimal dissection can be performed, allowing access to spinal neurons without the use of an enzymatic treatment, thereby avoiding any resultant damage. However, for larvae, it is necessary to apply a brief enzyme treatment to remove the muscle tissue surrounding the spinal cord. The methods described here have been used to study the intrinsic electrical properties of motor neurons, interneurons, and sensory neurons at several developmental stages6,7,8,9.

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

This manuscript describes methods for electrophysiological recordings from spinal neurons of zebrafish embryos and larvae. The preparation maintains neurons in situ and often involves minimum dissection. These methods allow for the electrophysiological study of a variety of spinal neurons, from the initial electrical excitability acquisition through the early larval stages.

zebrafish<em&gt; In Situ</em&gt; Spinal Cord Preparação para gravações eletrofisiológicas da Spinal Sensorial e Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo. The small size and relative transparency of zebrafish embryos make them particularly useful for the visual examination of processes such as heart and vascular development. In several recent studies transgenic zebrafish that express EGFP in vascular endothelial cells were used to image and analyze complex vascular networks in the brain and retina, using confocal microscopy. Descriptions are provided to prepare, treat and image zebrafish embryos that express enhanced green fluorescent protein (EGFP), and then generate comprehensive 3D renderings of the cerebrovascular system. Protocols include the treatment of embryos, confocal imaging, and fixation protocols that preserve EGFP fluorescence. Further, useful tips on obtaining high-quality images of cerebrovascular structures, such as removal the eye without damaging nearby neural tissue are provided. Potential pitfalls with confocal imaging are discussed, along with the steps necessary to generate 3D reconstructions from confocal image stacks using freely available open source software.

Imaging of cerebrovascular development in larval zebrafish is described. Techniques to facilitate 3D imaging and modify cerebrovascular development using chemical treatments are also provided.

Imagem e Reconstrução 3D de Estruturas cerebrovasculares em Embryonic Zebrafish

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo.  The small size and relative transparency of zebrafish embryos make ...

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

The zebrafish embryo is now commonly used for basic and biomedical research to investigate the genetic control of developmental processes and to model congenital abnormalities. During the first day of life, the zebrafish embryo progresses through many developmental stages including fertilization, cleavage, gastrulation, segmentation, and the organogenesis of structures such as the kidney, heart, and central nervous system. The anatomy of a young zebrafish embryo presents several challenges for the visualization and analysis of the tissues involved in many of these events because the embryo develops in association with a round yolk mass. Thus, for accurate analysis and imaging of experimental phenotypes in fixed embryonic specimens between the tailbud and 20 somite stage (10 and 19 hours post fertilization (hpf), respectively), such as those stained using whole mount in situ hybridization (WISH), it is often desirable to remove the embryo from the yolk ball and to position it flat on a glass slide. However, performing a flat mount procedure can be tedious. Therefore, successful and efficient flat mount preparation is greatly facilitated through the visual demonstration of the dissection technique, and also helped by using reagents that assist in optimal tissue handling. Here, we provide our WISH protocol for one or two-color detection of gene expression in the zebrafish embryo, and demonstrate how the flat mounting procedure can be performed on this example of a stained fixed specimen. This flat mounting protocol is broadly applicable to the study of many embryonic structures that emerge during early zebrafish development, and can be implemented in conjunction with other staining methods performed on fixed embryo samples.

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

The zebrafish embryo is an excellent model for developmental biology research. During embryogenesis, zebrafish develop with a yolk mass, which presents three-dimensional challenges for sample observation and analysis. This protocol describes how to create two-dimensional flat mount preparations of whole mount in situ (WISH) stained zebrafish embryo specimens.

Monte Preparação Plano de observação e análise de amostras de embriões Zebrafish manchado por inteiro Monte<em&gt; Em situ</em&gt; Hibridização

The zebrafish embryo is now commonly used for basic and biomedical research to investigate the genetic control of developmental processes and to model ...

Dissecção e montagem lateral de embriões Zebrafish: Análise de Desenvolvimento da Medula Espinhal

Resumo

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