A criação de animais técnicos fornecidos pela Tina Martin e David Albright é apreciadas. Esta pesquisa foi suportada por concessões T32-AI-07285 (HN), NIH R25 2GM064133 (TCL), 1R03-HD061671-01, R24-AI-059830-06 do NIH.

1. Animais X. laevis x X. Gilli híbridos LG-6 e LG-15 isogenetic clones 1 são da nossa colônia de reprodução da Universidade de Rochester (http://www.urmc.rochester.edu/smd/mbi/xenopus/index.htm). LG-6 e LG-15 compartilham o mesmo haplótipo heterozigoto MHC (a / c), mas diferem em menores de histocompatibilidade (H) loci. Progênie desses clones são produzidos por gynogenesis, em que os ovos diplóides produzido pela fêmea são ativados por UV-irradiados esperma (não há contribuição de DNA para os descendentes). O uso de luvas é facultativa. Algumas pessoas preferem não usá-los porque é mais difícil lidar com as rãs (escorregadio) e de fato parece fazer as rãs desconfortável. 2. Purificação da gp96 de 15 / 0 Tumor (expressa tanto Tumor e Menores H-Ags) Gp96 purificação foi descrito anteriormente 2, 3. Resumidamente, gp96 é purificada por fracionamento 50-70% sulfato de amônio, seguido de ConA-Sepharose e cromatografia DEAE. Cerca de 20-50 mg de proteína pode ser obtida por 1 mL de tecido do tumor. Pureza da preparação é determinado por SDS-PAGE e coloração lasca. 3. Elicitação e Colheita de Leucócitos Peritoneal (PLs) de Minor H-Ag-díspares LG-6 Frogs <ol><li> Crescer uma noite para o dia 25 mL E. Cultura coli em um tubo de 50 ml a 37 ° C com agitação. </li><li> O calor dia seguinte matar as bactérias pela fervura por 1 hora. </li><li> Centrifugar o calor matou E. Coli por 15 min a 2.000 rpm (1.500 g) a 4 ° C. </li><li> Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento de bactérias em 1 / 10 º volume da cultura original (2,5 mL) em APBS. Neste ponto, a cultura bacteriana está pronto para uso e deve ser usado dentro de 24 horas. </li><li> Injetar por via intraperitoneal (ip) 200 (para um sapo 2 polegada) ou 300 mL (para um sapo de 3 polegadas) da preparação de calor matou bacteriana por sapo usando um calibre 25 08/05 agulha. </li><li> Três dias após a injeção PLs são colhidas por lavagem intraperitoneal. </li><li> Antes da colheita PL, sapos adultos são anestesiados por imersão em uma solução aquosa de 0,1% tricaina sulfonato metano (TMS, MS-222) tamponada com bicarbonato de sódio para até 5 min até que todo o movimento cessa (duração depende do tamanho e idade). Animais acordar dentro de 10-20 min após o tratamento. </li><li> Desinfectar o abdômen do sapo com uma pequena quantidade de etanol a 70%. </li><li> Injetar 5 mL (para um sapo 2 polegadas) ou 10 mL (para um sapo de 3 polegadas) de APBS estéril pré-aquecido em temperatura ambiente para a cavidade peritoneal através de um calibre 18 1 ½ agulha. Remova a agulha e massagear suavemente o sapo por um minuto para assegurar que o buffer injetado equilibra com o líquido na cavidade do corpo. </li><li> Use um medidor de 18 novos 1 ½ agulha sem uma seringa para coletar o líquido peritoneal que vai pingar na parte de trás da agulha em um tubo limpo de 50 mL cônico. Certifique-se de recuperar o máximo de volume inicial injetado possível. Ter cuidado para evitar os vasos sanguíneos na área central da região abdominal. </li><li> Uma vez que PLs são colhidas colocar o sapo em um recipiente com água rasa até que seja acordado em que ponto ele pode ser colocado de volta em sua gaiola. </li></ol> 4. Transferência pulsante e adotiva do Lg-6 Pls Em Naive Lg-6 Destinatários <ol><li> Lavar os PLs uma vez com APBS frio e centrifugar-los a 1.000 rpm (750 g) por 10 min a 4 ° C. </li><li> Remover o sobrenadante e ressuspender o PLs em APBS. </li><li> O pulso do PL com gp96 em uma concentração de 1 mg gp96 por 5 x 10 5 PLs. </li><li> Uma vez que a quantidade adequada de gp96 é adicionado ao PLS, misturá-los por pipetagem e incubar no gelo por 1 hora. </li><li> Centrifugar as células ou a 1.000 rpm por 10 min a 4 ° C ou menos 14.000 rpm por 1 min para remover qualquer unbound gp96. </li><li> Lavar os PLs 3X com APBS fria para garantir que não haja deixado gp96 residual. </li><li> Ressuspender o PLs pulsado a uma concentração de 5 x 10 5 PLs por 300 mL. </li><li> Adotivamente transferência PLs por injeção ip usando calibre 25 08/05 agulha. Injetar 300 mL de PLs pulsado (5 x 10 5 células) por animal. </li><li> Rãs precisam ser preparadas pelo menos três dias antes de continuar com enxerto de pele ou experiências desafio tumor. </li></ol> 5. Ensaio de enxerto de pele Rejeição do enxerto de pele é um ensaio bem estabelecido em Xenopus 4, 5, 6. Em Xenopus, um destinatário rejeita a pele do doador exibir 1 ou 2 desencontros haplotipo MHC dentro de 18-22 dias a 21-22 ° C. Em contraste, enxertos de pele entre a LG ea LG-6-15 clones que diferem apenas por menores H-Ags são rejeitados mais lentamente (mais que 30 dias). No entanto, essa rejeição é acelerado em receptores that foram imunizadas contra doadores menores H-Ags quer por um enxerto de pele anterior ou pela imunização com gp96 purificada do doador. Sem rejeição em todos ocorre quando o dador eo receptor são geneticamente idênticos (por exemplo, animais clonados ou totalmente puras). Portanto, esta técnica simples é muito poderosa para a caracterização in vivo respostas imunes induzidas pela gp96. <ol><li> Anestesiar sapo doador, conforme descrito em 3.7. Nota: Apenas as precauções mínimas precisam ser tomadas desde Xenopus produzir potente anti-microbial peptídeos (por exemplo, magainin) na pele que elimina a necessidade para o total de procedimentos assépticos. Na verdade, o tratamento do sapo com qualquer desinfetante seria prejudicial para a pele. Além disso, Xenopus não têm qualquer patógenos que podem ser transferidos para os seres humanos. Portanto, o uso de luvas é opcional. No entanto, todos os instrumentos usados ​​dissecção precisa ser autoclavados e todas as soluções precisam ser esterilizados. </li><li> Corte e retire uma pequena (20 mm X 5 mm) pedaço de pele ventral (pele abdominal que aparece prateado, devido à presença de irridophore células pigmentadas) de um sapo doador LG-15 com uma tesoura. </li><li> Coloque a pele em uma APBS petridish contendo e mantê-lo no gelo. Manipular o tecido da pele muito gentilmente, evite segurá-lo entre fórceps. </li><li> Usando uma navalha ou tesoura corte enxertos individuais em 5 mm X 5 peças mm. Manter os fragmentos em APBS no gelo. </li><li> Neste ponto, o sapo doador é colocado em um recipiente com água rasa até que seja acordado e, em seguida, ele é colocado em água contendo antibióticos (Penstrep na concentração de 5 mg / L). O sapo é mantido em água com antibióticos durante dois dias em que ponto ele é devolvido em água normal. A pequena ferida no local onde a pele foi removida não precisa ser costurada e cura em uma semana. </li><li> Anestesiar o destinatário sapo LG-6. </li><li> Fazer uma pequena incisão na pele (costas) dorsal do destinatário e insira os 5 mm X 5 mm de enxerto sob a pele com o lado prateado para cima. Tenha cuidado para não introduzir grandes bolhas de ar sob a pele, porque isso pode levar ao deslocamento ou mesmo perda do enxerto. </li><li> Certifique-se de observar as marcações tesoura e uma pinça na enxertos porque aqueles não são contados como rejeição do enxerto, uma vez o placar começa. </li><li> 24 horas mais tarde uma parte da pele do hospedeiro sobrepondo precisa ser removido do enxerto. </li><li> Anestesiar o destinatário sapo LG-6. Lidar com o animal, como descrito em 5.1. </li><li> Com uma tesoura esterilizada cortar uma janela ao redor do enxerto, para que o enxerto pode ser livremente visualizado. Tenha cuidado para não tocar a pele do doador ou para induzir o sangramento. Vamos recuperar o sapo como descrito em 5.5. </li><li> Começar a marcar o enxerto de imediato, tomando um esboço. Rejeição do enxerto de pele é determinada pela porcentagem de destruição da irridophores na pele enxertada. </li><li> Os enxertos precisam ser verificados a cada 2-3 dias, mas os animais não precisam de ser anestesiado para isso. Para visualizar os enxertos, os sapos precisam ser colocados em um petridish sob um microscópio de dissecação. </li></ol> 6. Toda montagem de imuno-histologia pele transplantada Sapo todo-mount imuno-histologia foi descrita anteriormente 6. Resumidamente, o sapo é anestesiado e colocado sob o microscópio em uma toalha de papel estéreis pré-molhada com água sapo (a área de trabalho também é preparado em condições assépticas). A pele transplantada é então retirada junto com uma pequena quantidade de pele circundante do host e é corado com anticorpos semelhante à coloração de células para análise de citometria de fluxo 6. Instrumentos autoclavados e buffers estéreis devem ser usados. Após a coloração da pele é colocada sobre uma lâmina de microscópio e delicadamente pressionado com uma lamínula. Neste ponto, a pele pode ser visualizado utilizando um microscópio de fluorescência para diferentes populações de células que se infiltraram o enxerto. Após o procedimento o sapo é mantido em água com antibióticos, como descrito na seção 5.5. e voltou em água normal. A pequena ferida esquerda, onde a pele foi removida cicatriza em uma semana. 7. Caracterização de leucócitos do sangue <ol><li> Antes de remover o sangue do sapo, é preciso preparar &quot;agulhas de vidro&quot; puxando pipetas Pasteur estéreis sobre chama. A extremidade fina da pipeta está afiada sob o estereomicroscópio. A pipeta é então ligado a um tubo de plástico aspiração. Todos os instrumentos, como a pinça e tesouras precisa ser autoclavados antes do uso. </li><li> Também preparar 10 mL de gelo frio do APBS e solução de heparina pela adição de 50 unidades de heparina por 1 mL de APBS. Mantenha a solução em gelo. Todas as soluções utilizadas devem ser estéreis. </li><li> Anestesiar sapo como descrito em 3.7, e seguir os procedimentos mesmo animal manuseio, como descrito em 5.1. . </li><li> Cortar a pele acima do pé posterior para expora veia dorsal do tarso. </li><li> Encher a pipeta Pasteur com 1-2 mL de solução APBS + heparina. </li><li> Insira o &quot;agulha de vidro&quot; na veia e começar a recolher o sangue lentamente por aspiração com a boca. É importante ter solução + APBS heparina na &quot;agulha de vidro&quot;, pois isso vai impedir a coagulação do sangue e entupimento da ponta da agulha. </li><li> 1-2 mL de sangue podem ser obtidas a partir de um sapo de tamanho médio. </li><li> A pequena incisão na perna do sapo não precisa ser costurada ea ferida cicatriza em uma semana. </li><li> Centrifugar o sangue a 1.000 rpm por 10 min a 4 ° C. </li><li> Remover o sobrenadante e lavar as células 1X com 10 mL de APBS frio. </li><li> Sobreposição de 2 mL de sangue (1-5 x 10 6 células) em 1 mL de Ficoll Histopaque 1,077 (Sigma) pré-aquecido em temperatura ambiente, a fim de separar os leucócitos do sangue a partir de células vermelhas do sangue. </li><li> Centrifugar 20 min a 1.000 rpm em temperatura ambiente, sem freio, e depois recolher a banda de leucócitos. </li><li> Lavar as células com 2X APBS por centrifugação a 1.400 rpm por 10 min a 4 ° C para remover o Ficoll residual. </li><li> Neste ponto as células estão prontas para serem coradas com anticorpos para a análise de citometria de fluxo, ou para ser usado para ensaios em cultura in vitro. </li></ol> 8. Ensaio de Transplante de tumor <ol><li> Cerca de uma semana antes do degelo experimentar um novo lote de 15 / 0 células tumorais e certifique-se que as células começam a crescer também. Meio de cultura é descrito sucintamente na próxima seção e com mais detalhes em 3. </li><li> Expandir as células 15 / 0 tumor. </li><li> No dia do experimento, a contagem de células e determinar a morte celular por exclusão do azul Trypan. Morte celular deve ser inferior a 5%. Lave as células em 1X APBS frio, e centrifugar a 1.000 rpm a 4 ° C por 10 min. </li><li> Ressuspender as células em meio de cultura tumor com uma densidade de 5 x 10 5 15 / 0 células por 300 ml. </li><li> Transplante de 5 x 10 5 células em 300 mL de volume por rã por injeção subcutânea utilizando um calibre 25 08/05 agulha em um lado do lado (back) dorsal do animal. </li><li> O crescimento do tumor vai começar dentro de 2-3 semanas após o desafio tumor. O aparecimento do tumor inicial deve ser observado e que o volume do tumor deve ser registrada a cada 2-3 dias. Volume tumoral (altura, comprimento X largura X) é medido com paquímetro. </li><li> Uma vez que o tumor cresce a 3.500 mm 3 ou o sapo começa a olhar letárgico, ele precisa ser sacrificado para evitar desconforto. </li></ol> 9. Reagentes necessários: <ul><li> Anfíbios Tampão fosfato salino (APBS): 6,6 g / L NaCl, 1,15 g / L Na 2 HPO 4, 0,2 g / L KH 2 PO. pH para 7,5 utilizando NaOH 10N e filtro esterilizado 0,2 m através do filtro. </li><li> Tricaina Sulfonato de Metano (TMS, MS-222) (Crescent Pesquisa Química CAS # 886-86-2). </li><li> Bicarbonato de sódio (Fisher Scientific-S 233-500). </li><li> Histopaque-1077 (Sigma-Aldrich 10771-100 mL) </li><li> Heparina sal de sódio (Sigma-Aldrich H3149-50KU) </li><li> Meio de cultura para Xenopus 15 / 0 tumores [ver 3 para mais detalhes]: 1 L de meio DMEM Iscove basal (Gibco-Invitrogen 11965) com 10 mL de insulina, 10 mL não-aminoácidos essenciais, 10 mL de penicilina-estreptomicina, 10 mg / mL de canamicina, 3 mL de primatone (Sheffield Divisão de Produtos), 1 mL de β2-mercaptoetanol, e 3,02 g NaHCO 3 em água (pH 7,0). Este meio é diluído para osmolaridade anfíbios, adicionando 30% de água bidestilada, e suplementada com 5% de soro fetal bovino, superantant 20% a partir de uma linha A6 Xenopus rim celular, e 0,25% do normal Xenopus soro. </li></ul> 10. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/2026/2026fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Análise estereoscópica de rejeição do enxerto de pele 12 dias pós-transplante. LG-6 sapo clonado recebeu um enxerto de pele de ambos (A) um MHC-idênticos LG-6 (não mostra rejeição) ou (B) um doador de MHC-díspares outbred (80% de rejeição). Setas mostra células pigmentadas iridophore prateado marcação saudável do tecido (não rejeitada) enxertados. (*) Marcos de não pinças, devido à rejeição. <img src="/files/ftp_upload/2026/2026fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Gp96 facilita a apresentação cruzada de antígenos de tumor em Xenopus. LG-15 PLs (5 x 10 5) foram pulsado de 1 hora no gelo ou com APBS (controle negativo), 1 mg de recombinante gp96 purificada a partir de um E. Cultura coli, ou 1 ou 0,5 mg de gp96 purificada a partir de 15 / 0 tecido tumoral. Após 3 lavagens, as células foram transferidos para destinatários adotivamente LG-15 para adultos (1 x 10 6 individual /). Três dias depois, ao vivo 15 / 0 células tumorais (5 x 10 5) foramtransplantado por injeção sc. Cada curva representa a cinética de crescimento do tumor em um sapo. Dias após o desafio, quando apareceu pela primeira vez tumores foram monitorados, eo tamanho do tumor foi determinada periodicamente com um (comprimento x largura x espessura) paquímetro.

<ol>
	<li>Kobel, H. R., Pasquier, D. u., L, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperdiploid+species+hybrids+for+gene+mapping+in+Xenopus.">Hyperdiploid species hybrids for gene mapping in Xenopus.</a> Nature. 279, 157-158 (1979).</li><li>Robert, J., Menoret, A., Basu, S., Cohen, N., Srivastava, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+conservation+of+the+molecular+and+immunological+properties+of+the+chaperones+gp96+and+hsp70.">Phylogenetic conservation of the molecular and immunological properties of the chaperones gp96 and hsp70.</a> Eur J Immunol. 31, 186-195 (2001).</li><li>Robert, J., Gantress, J., Cohen, N., Maniero, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+as+an+experimental+model+for+studying+evolution+of+hsp--immune+system+interactions.">Xenopus as an experimental model for studying evolution of hsp--immune system interactions.</a> Methods. 32, 42-53 (2004).</li><li>Chardonnens, X., Pasquier, D. u., L, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+skin+allograft+tolerance+during+metamorphosis+of+the+toad+Xenopus+laevis:+a+possible+model+for+studying+generation+of+self+tolerance+to+histocompatibility+antigens.">Induction of skin allograft tolerance during metamorphosis of the toad Xenopus laevis: a possible model for studying generation of self tolerance to histocompatibility antigens.</a> Eur J Immunol. 3, 569-573 (1973).</li><li>Du Pasquier, L., Bernard, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+suppression+of+the+allogeneic+histocompatibility+reactions+during+the+metamorphosis+of+the+clawed+toad+Xenopus.">Active suppression of the allogeneic histocompatibility reactions during the metamorphosis of the clawed toad Xenopus.</a> Differentiation. 16, 1-7 (1980).</li><li>Ramanayake, T., Simon, D. A., Frelinger, J. G., Lord, E. M., Robert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+study+of+T-cell+responses+to+skin+alloantigens+in+Xenopus+using+a+novel+whole-mount+immunohistology+method.">In vivo study of T-cell responses to skin alloantigens in Xenopus using a novel whole-mount immunohistology method.</a> Transplantation. 83, 159-166 (2007).</li><li>Robert, J., Ramanayake, T., Maniero, G. D., Morales, H., Chida, A. S., S, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+conservation+of+glycoprotein+96+ability+to+interact+with+CD91+and+facilitate+antigen+cross-presentation.">Phylogenetic conservation of glycoprotein 96 ability to interact with CD91 and facilitate antigen cross-presentation.</a> J Immunol. 180, 3176-3182 (2008).</li><li>Robert, J., Gantress, J., Rau, L., Bell, A., Cohen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minor+histocompatibility+antigen-specific+MHC-restricted+CD8+T+cell+responses+elicited+by+heat+shock+proteins.">Minor histocompatibility antigen-specific MHC-restricted CD8 T cell responses elicited by heat shock proteins.</a> J Immunol. 168, 1697-1703 (2002).</li><li>Morales, H., Robert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+and+in+vitro+techniques+for+comparative+study+of+antiviral+T-cell+responses+in+the+amphibian+Xenopus.">In vivo and in vitro techniques for comparative study of antiviral T-cell responses in the amphibian Xenopus.</a> Biol Proced Online. 10, 1-8 (2008).</li><li>Maniero, G. D., Robert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+conservation+of+gp96-mediated+antigen-specific+cellular+immunity:+new+evidence+from+adoptive+cell+transfer+in+xenopus.">Phylogenetic conservation of gp96-mediated antigen-specific cellular immunity: new evidence from adoptive cell transfer in xenopus.</a> Transplantation. 78, 1415-1421 (2004).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O anfíbio Xenopus é um exclusivo modelo de não-mamíferos versátil para estudar a imunidade. Sua ampla utilização na pesquisa biomédica e imunológicos rendeu em muitas ferramentas de pesquisa importantes, como os clones MHC definido LG-6 e LG-15, bem como linhas de células diferentes e anticorpos monoclonais. Usando essas ferramentas nós estabelecemos diferentes in vitro e em ensaios in vivo para estudar a capacidade das proteínas de choque térmico, como gp96 para mediar p...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Reagents needed:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Amphibian Phosphate Buffered Saline (APBS): </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NaCl, 1.15 g/L </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Na2HPO4, 0.2 g/L </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>KH2PO </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10N NaOH </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tricaine Methane Sulfonate (TMS, MS-222) </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Crescent Research Chemicals </td>
<td>CAS#886-86-2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium bicarbonate </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific </td>
<td>S-233-500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Histopaque-1077</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>10771</td>
<td>100ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Heparin Sodium Salt </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich </td>
<td>H3149-50KU</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Culture medium for Xenopus 15/0 tumors [see 3 for more details]:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Iscove DMEM basal medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco-Invitrogen </td>
<td>11965</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Insulin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Non-essential amino acids</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin-streptomycin </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Kanamycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Primatone</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sheffield Products Division</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>&beta;2-mercaptoethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NaHCO3 </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>30% double distilled water </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>5% featal bovine serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>20% superantant from a Xenopus kidney cell line A6 </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.25% of normal Xenopus serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Materials and Equipment:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>50 and 15 ml conical centrifuge tubes (sterile)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>25 gauge 5/8 Precision Glide sterile needles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>18 gauge 1&frac12; Precision Glide sterile needles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1 ml Tuberculin Slip Tip Syringe sterile</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10 ml Slip Tip Syringe sterile</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1.5 ml MicroCentrifuge tubes (sterile)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>60 X 15 mm Polystyrene Petri Dishes sterile</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Falcon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Razor blades</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>25 X 75 mm X 1 mm Premium Microscope Slides </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10 cm glass petri dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>9" Pasteur Pipetes Durex Borosilicate Glass Cotton Plugged Disposable</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tygon tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Two # 5 Swiss Jeweler&#x2019;s Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Miltex Inc.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micro Dissecting Spring Scissors McPherson-Vannas straight cutting edge 6 mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roboz</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Helios calipers </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissecting microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>High intensity illuminator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hemacytometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Un-bunsen burner</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>37&deg;C shaking incubator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Centrifuge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

comparative in vivo study of gp96 adjuvanticity in the frog xenopus laevis

Temos desenvolvido no Xenopus laevis anfíbios um modelo não-mamíferos única de estudar a capacidade das proteínas de choque térmico certos (HSPs) como gp96 para facilitar a apresentação cruzada de antígenos chaperoned e provocar inata e adaptativa respostas de células T. Xenopus rejeição do enxerto de pele fornece uma excelente plataforma para estudar a capacidade de gp96 para provocar clássicos MHC de classe Ia (classe IA) restringiu as respostas das células T. Além disso, o sistema modelo de Xenopus também oferece uma alternativa atraente aos ratos para explorar a capacidade de gerar respostas gp96 contra tumores que têm baixo-regulado suas moléculas de classe Ia escapando desta forma de vigilância imunológica. Recentemente, desenvolvemos um ensaio transferência adotiva de células em Xenopus clones usando leucócitos peritoneal como células apresentadoras de antígenos (APCs), e mostrou que pode gp96 prime T CD8 respostas de células in vivo contra antígenos de histocompatibilidade menores da pele, bem como contra o tumor do timo Xenopus 15 / 0 que não expressam moléculas Ia classe. Descrevemos aqui a metodologia envolvida para realizar essas análises, incluindo a transferência de elicitação pulsante, e adotivos de leucócitos peritoneal, bem como o enxerto de pele e ensaios transplante tumor. Além disso também estamos descrevendo a colheita e separação de leucócitos do sangue periférico utilizado para a citometria de fluxo e ensaios de proliferação que permitem uma melhor caracterização das populações efetoras envolvidas na rejeição da pele e anti-tumor respostas.

Watch this Scientific Journal Video about Comparative in vivo Study of gp96 Adjuvanticity in the Frog Xenopus laevis at JoVE.com

Comparative in vivo Study of gp96 Adjuvanticity in the Frog Xenopus laevis

O sapo<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Oferece um atraente modelo de não-mamíferos alternativa para explorar a capacidade da proteína de choque térmico, tais como para promover a gp96 antígeno-específica de células T CD8 respostas. Nós apresentamos métodos para o estudo<em&gt; In vivo</em&gt; Facilitação de apresentação cruzada de antígenos de tumor de pele e gp96.

Comparativo In vivo Estudo da gp96 adjuvante no Sapo Xenopus laevis</em

We have developed in the amphibian Xenopus laevis a unique non-mammalian model to study the ability of certain heat shock proteins (hsps) such as gp96 to ...

comparative-vivo-study-gp96-adjuvanticity-frog-xenopus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Comparative in vivo Study of gp96 Adjuvanticity in the Frog Xenopus laevis

10.5K visualizações.  University of Rochester. O sapo Xenopus laevis Oferece um atraente modelo de não-mamíferos alternativa para explorar a capacidade da proteína de choque térmico, tais como para promover a gp96 antígeno-específica de células T CD8 respostas. Nós apresentamos métodos para o estudo In vivo Facilitação de apresentação cruzada de antígenos de tumor de pele e gp96.

Vídeo: Comparative in vivo Study of gp96 Adjuvanticity in the Frog Xenopus laevis

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most common forms of disease are visceral leishmaniasis (VL) and cutaneous leishmaniasis (CL). Mouse models of leishmaniasis are widely used, but quantification of parasite burdens during murine disease requires mice to be euthanized at various times after infection. Parasite loads are then measured either by microscopy, limiting dilution assay, or qPCR amplification of parasite DNA. The in vivo imaging system (IVIS) has an integrated software package that allows the detection of a bioluminescent signal associated with cells in living organisms. Both to minimize animal usage and to follow infection longitudinally in individuals, in vivo models for imaging Leishmania spp. causing VL or CL were established. Parasites were engineered to express luciferase, and these were introduced into mice either intradermally or intravenously. Quantitative measurements of the luciferase driving bioluminescence of the transgenic Leishmania parasites within the mouse were made using IVIS. Individual mice can be imaged multiple times during longitudinal studies, allowing us to assess the inter-animal variation in the initial experimental parasite inocula, and to assess the multiplication of parasites in mouse tissues. Parasites are detected with high sensitivity in cutaneous locations. Although it is very likely that the signal (photons/second/parasite) is lower in deeper visceral organs than the skin, but quantitative comparisons of signals in superficial versus deep sites have not been done. It is possible that parasite numbers between body sites cannot be directly compared, although parasite loads in the same tissues can be compared between mice. Examples of one visceralizing species (L. infantum chagasi) and one species causing cutaneous leishmaniasis (L. mexicana) are shown. The IVIS procedure can be used for monitoring and analyzing small animal models of a wide variety of Leishmania species causing the different forms of human leishmaniasis.

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

An in vivo imaging system is used to generate quantitative measurements of murine infection with the Trypanosomatid protozoan Leishmania. This is a non-invasive and non-lethal method for detecting parasites expressing luciferase within many tissues throughout the course of chronic Leishmania spp. infection.

In vivo de imagens de parasitas Leishmania transgênicas em um host ao vivo

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

Imunologia e Infecção

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Não-invasiva por imagem do Homing leucócitos e Migração In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Cutaneous Leishmaniasis in the Dorsal Skin of Hamsters: a Useful Model for the Screening of Antileishmanial Drugs

Traditionally, hamsters are experimentally inoculated in the snout or the footpad. However in these sites an ulcer not always occurs, measurement of lesion size is a hard procedure and animals show difficulty to eat, breathe and move because of the lesion. In order to optimize the hamster model for cutaneous leishmaniasis, young adult male and female golden hamsters (Mesocricetus auratus) were injected intradermally at the dorsal skin with 1 to 1.5 x l07 promastigotes of Leishmania species and progression of subsequent lesions were evaluated for up to 16 weeks post infection. The golden hamster was selected because it is considered the adequate bio-model to evaluate drugs against Leishmania as they are susceptible to infection by different species. Cutaneous infection of hamsters results in chronic but controlled lesions, and a clinical evolution with signs similar to those observed in humans. Therefore, the establishment of the extent of infection by measuring the size of the lesion according to the area of indurations and ulcers is feasible. This approach has proven its versatility and easy management during inoculation, follow up and characterization of typical lesions (ulcers), application of treatments through different ways and obtaining of clinical samples after different treatments. By using this method the quality of animal life regarding locomotion, search for food and water, play and social activities is also preserved.

Optimization of the experimental hamster model for cutaneous leishmaniasis by intradermal injection of Leishmania promastigotes at the dorsal skin. This approach is useful during inoculation, follow-up, characterization of lesions, application of treatments and obtaining of clinical samples. Locomotion, search for food and water, play and social activities are preserved.

Leishmaniose cutânea na pele do dorso de Hamsters: um modelo útil para o rastreamento de drogas leishmanicidas

Traditionally, hamsters are experimentally inoculated in the snout or the footpad. However in these sites an ulcer not always occurs, measurement of ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and pathological processes such as CNS maturation in development, multiple sclerosis, and spinal cord injury. Microglia can be activated and recruited to action by neuronal injury or stimulation, such as axonal damage seen in MS or ischemic brain trauma resulting from stroke. These immunocompetent members of the CNS are also thought to have roles in synaptic plasticity under non-pathological conditions. We employ protocols for culturing microglia from the neonatal and adult tissues that are aimed to maximize the viable cell numbers while minimizing confounding variables, such as the presence of other CNS cell types and cell culture debris. We utilize large and easily discernable CNS components (e.g. cortex, spinal cord segments), which makes the entire process feasible and reproducible. The use of adult cells is a suitable alternative to the use of neonatal brain microglia, as many pathologies studied mainly affect the postnatal spinal cord. These culture systems are also useful for directly testing the effect of compounds that may either inhibit or promote microglial activation. Since microglial activation can shape the outcomes of disease in the adult CNS, there is a need for in vitro systems in which neonatal and adult microglia can be cultured and studied.

We outline methods for the efficient and quick isolation/culture of viable microglia from the neonatal cerebral cortex and adult spinal cord. The dissection and plating of cortical microglia can be accomplished within 90 minutes, with the subsequent microglial harvest taking place ~ 10 days following the initial dissection.

Microglia cultura do Sistema Nervoso Central Neonatal e Adulto

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the shear stress of flowing blood.
To identify the bacterial and host factors that contribute to vascular adhesion of microorganisms, appropriate models that study these interactions under physiological shear conditions are needed. Here, we describe an in vitro flow chamber model that allows to investigate bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells, and an intravital microscopy model that was developed to directly visualize the initial adhesion of bacteria to the splanchnic circulation in vivo. These methods can be used to identify the bacterial and host factors required for the adhesion of bacteria under flow. We illustrate the relevance of shear stress and the role of von Willebrand factor for the adhesion of Staphylococcus aureus using both the in vitro and in vivo model.

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

In Vitro e In Vivo modelo para estudar a adesão bacteriana para o Vaso de parede em condições de escoamento

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is imperative to design experiments using human cells and tissues. An advantage of organ culture is maintenance of three-dimensional (3D) structural organization and extracellular matrix. The goal of the method described here is successful establishment of ex vivo human gestational tissue organ cultures and their healthy culture maintenance for 72-96 hr. The protocol details the immediate processing of research-consented, placental and decidual specimens fresh from the operating suite. These are abundant specimens that would otherwise be discarded. Detailed instructions on the sterile collection of these samples, including morphologic details on how to select appropriate tissues to establish 3D organ cultures, is provided. Placental villous and decidual tissues are microdissected into 2-3 mm3 pieces and placed separately on matrix-lined transwell filters and cultured for several days. Villous and decidual organ cultures are well suited for the study of human host-pathogen interaction. As compared to other model organisms, these human cultures are particularly advantageous to examine mechanism of infection for pathogens that demonstrate variable patterns of host specificity. As an example, we demonstrate infection of placental and decidual organ cultures with the clinically relevant, facultative intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes.

A simple method to establish primary human placental (villous) and decidual organ cultures is described. Villous and decidual organ cultures are invaluable tools for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface. Infection with the facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes is demonstrated.

Culturas placentária e Decidual órgão humano para estudar Infecções na interface materno-fetal

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents autoimmunity. Many approaches involving different model organisms have been utilized to understand the mechanisms controlling helper T cell development and function. However, studies using mouse models have proven to be highly informative due to the availability of genetic, cellular, and biochemical systems. One genetic approach in mice used by many labs involves retroviral transduction of primary helper T cells. This is a powerful approach due to its relative ease, making it accessible to almost any laboratory with basic skills in molecular biology and immunology. Therefore, multiple genes in wild type or mutant forms can readily be tested for function in helper T cells to understand their importance and mechanisms of action. We have optimized this approach and describe here the protocols for production of high titer retroviruses, isolation of primary murine helper T cells, and their transduction by retroviruses and differentiation toward the different helper subsets. Finally, the use of this approach is described in uncovering mechanisms utilized by microRNAs (miRNAs) to regulate pathways controlling helper T cell development and function.

Many experimental systems have been utilized to understand the mechanisms regulating T cell development and function in an immune response. Here a genetic approach using retroviral transduction is described, which is economic, time efficient, and most importantly, highly informative in identifying regulatory pathways.

Transdução retroviral de células T helper como uma abordagem genética para estudar mecanismos que controlam a sua diferenciação e função

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the analysis of immune mediators in fluid eluates for the study of the airway topical immune signature, without the need for stimulation procedures (often used by other techniques). The mucosal lining fluid is sampled on a strip of filter paper placed at the anterior part of the inferior turbinate and left for 2 min of absorption. Analytes are eluted from the filter papers, and the extracted protein-based eluates are analyzed by an electrochemiluminescence-based immunoassay, allowing for the high-sensitivity quantification of low- and high-level analytes in the same sample. We measured the in vivo levels of 20 preselected immune mediators related to specific immune signaling pathways in the upper airway mucosa, but the technique is not limited to that specific panel or sampling site. The technique was first implemented in 7-year-old children from the Copenhagen Prospective Studies on Asthma in Childhood2000 (COPSAC2000) cohort with allergic rhinitis. It was thereafter used in the longitudinal COPSAC2010 birth cohort, sampled at 1 month, 2 years, and 6 years of age and at instances of acute respiratory symptoms. We successfully obtained and analyzed samples from 620 (89%) of 700 1-month-old children; a few samples were below the assay detection limit (reported as the median (Inter-Quartile Range (IQR)). The number of samples below the detection limit (i.e.&#160;from 0 to the set point for the lower limit of detection) for each mediator was 29 (7.25 - 119.5). This technique enables the quantification of the in vivo airway mucosal immune profile from birth, can be applied longitudinally, and can be applied to studies on the effect of genetics and early-life environmental exposures, pathophysiology, endotyping, and monitoring of respiratory diseases, and development and evaluation of novel therapeutics.

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

This protocol describes a noninvasive technique for the sampling of undisturbed mucosal lining fluid from the upper airways. It can be used to perform the quantification of in vivo levels of protein mediators, such as cytokines and chemokines, in subjects of all ages.

Amostragem não-invasiva de mucosa líquido para a quantificação dos níveis de imune-mediador na Vivo das vias aéreas superiores

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and temporal specificity2. Chemotaxis is a critical function of lymphocytes and other immune cells that can be quantitatively assessed in vitro. This manuscript describes methods that permit the evaluation of chemotaxis, both in vitro and in vivo, for diverse cell types including cell lines and native cells. The in vitro, plate-based format permits the comparison of several conditions simultaneously in real-time, and can be completed within 1-4 h. In vitro assay conditions can be manipulated to introduce agonists and antagonists, as well as differentiate chemotaxis from chemokinesis, which is random movement. For in vivo trafficking assessments, immune cells can be labeled with multiple fluorescent dyes and used for adoptive transfer. The differential labeling of cells allows for mixed cell populations to be introduced into the same animal, thereby decreasing variance and reducing the number of animals required for an adequately powered experiment. Migration into lymphoid tissue occurs in as little as 1 h, and multiple tissue compartments can be sampled. Flow cytometry following tissue harvest allows for a rapid and quantitative analysis of the migratory patterns of multiple cell types.

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Protocols for quantitative assessment of lymphocyte chemotaxis and migration are important tools for immunology research. Here, an in vitro protocol is described that permits real-time, multiplexed evaluation of cell migration, as well as a complementary in vivo technique enabling tracking of native cells to spleen.

Quantificar o humano Monocyte Chemotaxis In Vitro e linfócitos murino tráfico Vivo

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.