Agradecemos Radek Sindelka por seu auxílio, e Cas Bresilla para ajudar com a criação de sapo e preparação embrião. Este trabalho foi financiado pelo NIH através do R01DE021109 concessão para HLS Laura Jacox foi financiado pelo Herschel Smith Graduate Fellowship na Universidade de Harvard e uma subvenção F30 indivíduo comunhão F30DE022989-01 através do NIDCR.

1. Reagentes Preparar <ol><li> 10x MBS: Preparar 1 L de 10x Modificado solução 17 de Barth Saline (MBS). Consulte a Tabela 1, Reagentes, ingredientes e instruções. Use água destilada para todas as soluções. Misture em uma proveta, utilizando uma barra de agitação, até a dissolução completa. Todas as soluções devem ser feitas à temperatura ambiente. </li><li> 1x MBS: Diluir 100 ml da solução de MBS 10x em 900 ml de água destilada para fazer 1 L de 1x MBS. Adicionar 0,7 ml de 1 M de solução de CaCl 2. </li><li> 0.1x MBS: diluir 1x MBS para preparar 1 L de solução 0,5 x MBS e 2 L de 0,1 x MBS solução. Para 1 L de 0,1 x MBS solução, adicionar 1 ml de 10 mg / ml solução de gentamicina. A solução de MBS 0,1 x com gentamicina será utilizado para a cultura de embriões de longo prazo. </li><li> Ficoll / MBS: Adicione 15 gramas de Ficoll 400 a 500 ml de solução de 0,5 x MBS. Misture vigorosamente. Adicionar uma barra de agitação e misturar até estar completamente dissolvido de Ficoll (várias horas). </li><li> Etanol a 70%: Diluir 100% de etanol para 70% de etanol usandoágua destilada. </li></ol> 2. Preparando vidro Ferramentas Operacionais <ol><li> Preparação da agulha: Carga tubos capilares em um extrator de agulha. <ol><li> Puxe as agulhas de acordo com as configurações mostradas na Tabela 2: Configurações do extrator de agulhas. As definições são para um extractor de micropipeta Sutter Instrument Co. Modelo P-80/PC e tubos capilares, como descrito na Tabela de reagentes e equipamentos específicos. No entanto, essas configurações são específicas para a agulha extrator Sutter, e terá de ser ajustado para outras máquinas. As configurações podem ser determinados utilizando um teste de rampa, conforme especificado pelo fabricante da máquina. </li><li> Puxe 4-6 agulhas em preparação para o procedimento. As agulhas devem ser quebradas de tal modo que a porção de cabelo como flexível da ponta de vidro é completamente removido, o que é tipicamente de 2-3 mm de comprimento. A ponta tem de ser relativamente rígido, mas ainda suficientemente estreita para ser utilizado como uma ferramenta de corte. Veja a foto de uma agulha ideal na Figura 1A. </li&gt; <li> Armazenar as agulhas numa placa de Petri com uma tira de barro para baixo do centro. Pressione o eixo de cada agulha na argila, para segurá-la no lugar e manter a ponta afiada frágil longe do fundo e os lados. </li></ol></li><li> Para ferramentas adicionais, obter lamínulas de vidro, um par de pinças longas padrão teste padrão, um bico de Bunsen, e 3-4 pipetas Pasteur de vidro (tamanho 5 ¾ in). </li><li> Ferramenta Pipeta: Para fazer uma ferramenta de pipeta, acender o queimador de Bunsen e colocar a ponta de uma pipeta de Pasteur de vidro para a parte azul da chama durante a rotação dele, de tal modo que a ponta se derrete e o furo completamente vedações, formando uma, extremidade arredondada fechada . A ponta arredondada está selado posteriormente usada para fazer depressões na louça de barro que detém os embriões durante a operação. Ver Figura 1B. </li><li> Pontes de vidro: fazer pontes de vidro, utilize uma pinça de padrão longo padrão de quebrar cuidadosamente off 3 mm x 3 milímetros pedaços de vidro tampa de deslizamento. Com o pedaço de lamínula com tweezers, coloque o vidro da chama até que todas as quatro bordas amaciar e curva descendente, formando uma pequena cúpula de vidro. As bordas não devem mais ser afiada. Ver Figura 1C. </li><li> Guarde as pontes deslizamento tampa de vidro, inserindo-os, bordas para baixo, em massa de modelar, que reveste a parte inferior de uma placa de Petri. Inserir as pontes de tal modo que a parte superior da ponte permanece acima da superfície da argila. Não muito difícil empurrar de tal modo que os intervalos de ponte, e não incorporar completamente a ponte para a argila, uma vez que pode ser difícil de remover. Após a esterilização com uma chama ou etanol a 70%, as pontes podem ser reutilizados de experiência para experiência. </li></ol> 3. Preparação para a Operação Embryo <ol><li> Forre uma pequena 60 milímetros de plástico placa de Petri com massa de modelar. Entre as utilizações, a superfície do prato e argila é cuidadosamente lavado com água destilada e em seguida com etanol a 70%. NOTA: Use vermelho, branco ou amarelo, Van Aken Plastalina massa de modelar, que podem ser comprados em um local paray ou loja de arte. Barro preto não é recomendado porque ele libera um resíduo. </li><li> Encha o prato com 3% de solução Ficoll 0.5x MBS. A concentração mais elevada de sal previne a dissociao de tecido, e o polissacárido de Ficoll ajuda a engrossar a solução, o que ajuda a segurar o rosto em posição. </li><li> Use a ferramenta pipeta Pasteur inflamado (ver Figura 1) para fazer rasas, 2-3 mm depressões na argila, sobre a profundidade de um corpo embrião estágio 20. Faça 20-30 depressões, 1-2 mm, de cada lado do prato, para que haja um total de 40-60 depressões. Rotular um lado LOF / GOF, eo outro tipo selvagem lado, pela escultura iniciais no barro com uma pinça. </li></ol> 4. Preparação pré-operação Embryo <ol><li> Obtenha e cultura de Xenopus laevis embriões usando métodos padrão 17. Para uma descrição detalhada da criação de sapo, consulte Sive et al. 17 <ol><li> Quarenta e oito horas antes do ensaio obtaem ovos de rãs fêmeas e realizar a fertilização in vitro. </li><li> Injetar 0,5-1 ng de membrana tampado GFP mRNA, além de qualquer mRNA desejado ou anti-senso oligonucleotídeos antisense modificados por morpholino (&quot;morpholinos&quot;) na fase de uma célula ou em duas células na fase 2 celular. A certa altura da célula dura aproximadamente 70-90 min. Injetar um volume total de 1-3 nl. Em lugar de codificação de RNA para uma proteína fluorescente (GFP, tal como ARN ou RFP), pode-se injectar com FITC etiquetado morfolino ou dextrano marcado por fluorescência. A fluorescência é importante para determinar se a cura do tecido transplantado e permanece na cabeça. </li><li> Tampado ARNm pode ser preparado a partir de um plasmídeo linearizado usando uma SP6 mMessage mMachine ou kit T7. Morpholinos pode ser projetado e encomendado através Gene Ferramentas LLC. A quantidade de morfolino necessária para um efeito desejado deve ser determinada para cada gene 18. </li><li> Armazenar os embriões injectados a 15 ° C durante 48 horas, até que atinjam a fase de 19-20. (Fou todas as etapas subseqüentes, embriões em estágio de acordo com a tabela normal de Xenopus laevis por Nieuwkoop and Faber 19.) NOTA: No dia da cirurgia, os dois embriões receptores e doadores devem estar dentro de um estágio de cada um para os transplantes de trabalhar de forma otimizada. No entanto, os embriões injetados com morpholinos (&quot;morphants&quot;), por vezes, desenvolver mais lentamente do que o tipo selvagem ou controlar embriões morphant, tornando-se necessário coordenar as experiências para que ambos morphant e embriões tipo selvagem estão no mesmo estágio. Morphants pode necessitar de ser mantido a uma temperatura mais elevada durante 12-24 horas antes do procedimento. Para aumentar a probabilidade de que os embriões podem ser encontrados nas fases correspondentes, os embriões podem ser mantido a várias temperaturas. Vinte e quatro horas antes do ensaio, deve-se dividir os embriões em um vários pratos e coloque morphants a 18-20 ° C e embriões tipo selvagem em 15-18 ° C. </li></ol></li><li> No dia da experiência transplante, remove os embriões de the15 ° C incubadora e encenar los de acordo com Nieuwkoop and Faber 19. Se eles são mais jovens do que neurula tarde (fase 19), deixá-los em temperatura ambiente por 1-2 horas, até atingirem o estágio 19. </li><li> Peneirar os embriões injectados sob um microscópio fluorescente. Selecione embriões que mostram uniforme, fluorescência brilhante para o experimento. </li><li> Remover a desordem e possíveis contaminantes perto da área de operação. Limpe a superfície de operação, microscópio estereoscópico e todas as ferramentas com etanol 70%. </li><li> Uma vez que os embriões estão em fase 19, retire a membrana vitelina usando # 5/45 fórceps Dumont sob microscópio estereoscópico. <ol><li> Retirar a membrana vitelina de 20-30 de cada um dos dadores e embriões hospedeiros. </li><li> Para os primeiros experimentos de transplante de face, deve-se praticar com alguns embriões para cada condição. O método é difícil e requer a prática cuidadoso antes que ele possa ser utilizado numa escala maior, mais rapidamente e com sucesso. Pode-se trabalhar up para fazer 20 transplantes / experimentais. </li></ol></li><li> Mover embriões hospedeiros para o prato de funcionamento utilizando uma pipeta de transferência de plástico graduado com a ponta cortada de tal forma que a abertura é muito mais ampla do que um embrião (pelo menos alguns milímetros). Tenha cuidado para evitar tocar embriões de bolhas ou a superfície da água, como embriões vai explodir na tensão superficial. </li><li> Use # 5/45 fórceps para inserir os embriões para as depressões de argila, com a posterior do embrião na argila. Feche a argila em torno das bases do embrião utilizando a pinça, deixando o quarto superior do embrião, a cabeça, que se projeta da depressão. </li><li> Uma vez que todos os embriões hospedeiros são fixadas nas suas depressões, mover-se para o outro lado da placa e começa a inserir os embriões de dadores nas suas depressões. Repita o processo de obtenção de embriões em seus poços. </li></ol> 5. Realização de Transplante Cirurgia Crânio-Facial <ol><li> Faca de corte: Como uma faca de corte para remoçãode tecido de doador de EAD, usar uma agulha capilar de vidro apropriadamente dividido (ver passo 2.3 e Figura 1). NOTA: Pode-se realizar diretamente o capilar entre os dedos (isso funciona bem para as pessoas com mãos pequenas) ou pode-se montar a agulha em um suporte inseto pin. Agulhas de tungsténio Electrosharpened 17 carregados num suporte de pino pode ser utilizado em vez de uma agulha do tubo capilar. Por favor, veja retentores de pinos sugeridas e agulhas de tungstênio na Tabela de reagentes específicos e Equipamentos. </li><li> Sob um microscópio estereoscópico, inserir a agulha na cabeça do embrião à esquerda da glândula de cimento. A agulha deve ser inserida profundamente, de modo que passa a partir do lado de fora do embrião, através da cabeça, e para o intestino anterior. Para transplante de toda a EAD, cortes deve estender-se desde o exterior do embrião para o intestino anterior. Para transplantes somente ectoderma, os cortes devem ser mais raso e estender apenas através do ectoderma. <ol><li> Flick a agulha da esquerda para o lado direito dacabeça, ao longo de toda a largura da glândula cimento. O movimento súbito é importante, pois o movimento dá um corte limpo. Consulte a Figura 2A para um resumo da técnica e figura 2B para uma demonstração dos cortes. A glândula de cimento e os olhos são marcos importantes para os cortes. A ordem dos cortes não afetam o resultado e pode variar de acordo com a preferência do usuário ou lateralidade. </li></ol></li><li> Coloque a agulha no início do corte anterior, na margem esquerda da glândula de cimento, e agite a agulha para cima, até atingir o fundo do olho esquerdo. Isto irá criar um corte vertical da margem esquerda da glândula de cimento para o fundo do olho esquerdo. </li><li> Coloque a agulha na borda direita da glândula de cimento, e agite a agulha para cima até que ele atinja o fundo do olho direito. Isto irá criar um corte vertical da margem direita da glândula de cimento para a parte inferior do olho direito. </li><li> A ressecção total do tecido, flick a agulha a partir da parte inferior do olho esquerdo para o fundo do olho direito, a criação de um corte horizontal que vai libertar o tecido. Os cortes podem estender-se desde o exterior do embrião para o intestino anterior, incluindo tanto ectoderme e endoderme no explante EAD. Como alternativa, cortes superficiais pode ser usado para ectoderma somente transplantes EAD. Uma vez que o tecido é removido EAD, deve haver um furo rectangular, a partir do exterior do embrião dentro do intestino anterior, estendendo-se a partir da glândula cimento até um pouco abaixo dos olhos (de cima para baixo). O buraco deve se estender a partir da fronteira para dentro do olho esquerdo até a fronteira interior do olho direito (lado a lado). Veja a figura 2bb. </li><li> Com cuidado, empurre o tecido retirado na ponta da agulha, e levantá-lo através do buffer para a parte do prato contendo embriões de acolhimento. Não exponha o tecido ao ar na superfície ou ele vai ficar danificado. </li><li> Excisar o mesmo tecido a partir do embrião hospedeiro, como para o dador. Descarte o explante EAD host ou salvá-lo para insert para o rosto do doador, para transplantes recíprocos. </li><li> Insira o explante doador para o buraco anfitrião resultante usando # 5/45 fórceps. </li><li> Uma vez que o tecido do doador está corretamente posicionado e totalmente inserido, coloque cuidadosamente uma ponte de vidro (veja a Figura 1 e Figura 2BC) sobre o rosto do embrião para realizar o transplante no lugar. As extremidades da ponte deve inserir no barro, segurando-o no lugar. A ponte deve aplicar uma pressão suave para o tecido transplantado, de tal forma que o transplante se encontra alinhada com a cabeça de acolhimento, sem que saindo da cabeça ou deitado no fundo da cabeça. A cabeça pode ser ligeiramente achatado pela lamínula, mas tenha cuidado para não danificar o embrião com muita pressão. Transplantes deve ser realizada no prazo de 5 minutos. NOTA: Um investigador experiente pode realizar cerca de vinte transplantes por experiência, mais de 2-3 horas. Durante este período, os embriões vai avançar a partir da fase 20-22. Completando o transplante de rostos na fase 21 ou 22 não afeta os resultados. Transplantes posteriores (em estágios 22-26) pode ser feito, mas são mais difíceis como a região da linha média EAD o livre-crista é estreitada como movimentos da crista neural cranial para o rosto. Consistência entre os transplantes é crítica. </li></ol> 6. Transplante de rosto recuperação pós-operação <ol><li> Cura normalmente leva 2-3 horas. Deixe os embriões em temperatura ambiente sem ser perturbado em suas depressões de argila com as pontes de vidro segurando o tecido do doador no lugar. </li><li> Uma vez que os transplantes de ter curado, retire cuidadosamente as pontes de vidro, remova o barro em torno da base dos embriões, usando uma pinça, e use um plástico formado transferência pipeta para aspirar suavemente os embriões de suas depressões. </li><li> Coloque os embriões em uma placa de Petri devidamente rotulados, metade cheia de MBS 0,1 x limpas com gentamicina. </li><li> Crescer os embriões a 15 ° C ou 18 ° C durante vários dias, até alcançarem a alimentação fase de girino na fase 40, wgalinha fenótipos faciais podem ser pontuadas. <ol><li> A solução MBS 0,1 x com gentamicina deve ser trocada diariamente, e quaisquer embriões mortos devem ser removidos imediatamente para evitar a contaminação e morte de outros embriões. </li><li> A boca abre na fase 40. Na fase 40-41, deve-se verificar se o tecido transplantado permanece curada no lugar, visualizando sua fluorescência. Transplantes ocasionalmente cair, por isso é preciso garantir que todos os embriões marcados têm o tecido do doador no lugar. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Gorlin, R. J., Cohen, M., Levin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Syndromes of the head and neck. , (1990).</li><li>Trainor, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Craniofacial+birth+defects:+The+role+of+neural+crest+cells+in+the+etiology+and+pathogenesis+of+Treacher+Collins+syndrome+and+the+potential+for+prevention.">Craniofacial birth defects: The role of neural crest cells in the etiology and pathogenesis of Treacher Collins syndrome and the potential for prevention.</a> Am. J. Med. Gen. A. 152, 2984-2994 (2010).</li><li>Dickinson, A. J., Sive, H. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Wnt+antagonists+Frzb-1+and+Crescent+locally+regulate+basement+membrane+dissolution+in+the+developing+primary+mouth.">The Wnt antagonists Frzb-1 and Crescent locally regulate basement membrane dissolution in the developing primary mouth.</a> Dev. 136, 1071-1081 (2009).</li><li>Gilbert, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Developmental Biology. , (2010).</li><li>Borchers, A., Epperlein, H. H., Wedlich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+assay+system+to+study+migratory+behavior+of+cranial+neural+crest+cells+in+Xenopus.">An assay system to study migratory behavior of cranial neural crest cells in Xenopus.</a> Dev. Genes Evol. 210, 217-222 (2000).</li><li>Grunz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homoiogenetic+neural+inducing+activity+of+the+presumptive+neural+plate+of+Xenopus+laevis.">Homoiogenetic neural inducing activity of the presumptive neural plate of Xenopus laevis.</a> Dev. Growth Differ. 32, 583-589 (1990).</li><li>Servetnick, M., Grainger, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+neural+and+lens+competence+in+Xenopus+ectoderm:+evidence+for+an+autonomous+developmental+timer.">Changes in neural and lens competence in Xenopus ectoderm: evidence for an autonomous developmental timer.</a> Dev. Bio. 112, 177-188 (1991).</li><li>Servetnick, M., Grainger, R. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+the+early+neural+primordium+in+quail-chick+chimeras+:+I.">Mapping of the early neural primordium in quail-chick chimeras : I.</a> Developmental relationships between placodes, facial ectoderm. 110, 422-439 (1985).</li><li>Couly, G. F., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+the+early+neural+primordium+in+quail-chick+chimeras+II.+The+prosencephalic+neural+plate+and+neural+folds:+Implications+for+the+genesis+of+cephalic+human+congenital+abnormalities.">Mapping of the early neural primordium in quail-chick chimeras II. The prosencephalic neural plate and neural folds: Implications for the genesis of cephalic human congenital abnormalities.</a> Dev. Bio. 120, 198-214 (1987).</li><li>Lievre, A. L., Le Douarin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+early+development+of+cranial+sensory+ganglia+and+the+potentialities+of+their+component+cells+studied+in+quail-chick+chimeras.">The early development of cranial sensory ganglia and the potentialities of their component cells studied in quail-chick chimeras.</a> Dev. Bio. 94, 291-310 (1982).</li><li>Kennedy, A., Dickinson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Median+facial+clefts+in+Xenopus+laevis:+roles+of+retinoic+acid+signaling+and+homeobox+genes.">Median facial clefts in Xenopus laevis: roles of retinoic acid signaling and homeobox genes.</a> Dev. Bio. 365, 229-240 (2012).</li><li>Trainor, P., Tam, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cranial+paraxial+mesoderm+and+neural+crest+of+the+mouse+embryo-+codistribution+in+the+craniofacial+mesenchyme+but+distinct+segregation+in+the+branchial+arches.">Cranial paraxial mesoderm and neural crest of the mouse embryo- codistribution in the craniofacial mesenchyme but distinct segregation in the branchial arches.</a> Dev. 121, 2569-2582 (1995).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Early Development of Xenopus laevis. , (2000).</li><li>Tandon, P., Showell, C., Christine, K., Conlon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morpholino+injection+in+Xenopus.">Morpholino injection in Xenopus.</a> Methods Mol. Biol. 843, 29-46 (2012).</li><li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , (1994).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Etapas críticas e limitações: O procedimento de transplante de rosto EAD é tempo e trabalho intensivo. Requer prática, mãos firmes, e destreza para aperfeiçoar. O protocolo de transplante de rosto depende da capacidade do pesquisador para remover de forma eficiente e tecidos para transplante. Se alguém leva muito tempo para inserir o transplante no rosto do anfitrião, o rosto de acolhimento começará a se contrair e curar. Pinça pode ser utilizado para expandir delicadamente a região facial. No entant...

Para entender os mecanismos subjacentes defeitos craniofaciais congênitos 1-2, tecidos importantes e suas contribuições de sinalização durante o desenvolvimento craniofacial devem ser identificados. No sapo Xenopus laevis, parte do rosto, incluindo a boca e as narinas forma do &quot;Extreme Anterior Domain&quot; (EAD), onde ectoderma e endoderma estão diretamente justapostas 3-4. A EAD também actua como um centro de sinalização para influenciar os tecidos circundantes, incluindo a crista neural craniano, que forma as mandíbulas e outras regiões da face 5. Para identificar genes que contribuem para a função de EAD, uma técnica de &quot;transplante de face &#39;foi desenvolvido, em que o tecido transplantado de um dador para um embrião hospedeiro, após a remoção da região do hospedeiro correspondente. Seguindo o transplante, resultando desenvolvimento facial é avaliada. Assim, os efeitos da perda de função (LOF) ou ganho de função (GOF) de um gene específico em EAD são analisadas localmente, onde o restante do head e corpo é formado por um tecido do tipo selvagem. O transplante recíproco pode ser realizado, em que o tecido do tipo selvagem é transplantado em embriões com LOF mundial ou GOF em genes específicos. Transplante tem sido frequentemente usado em Xenopus e pintainho estuda 6. Por exemplo, o transplante de Xenopus abordou indução homogenetic neural, lente e competência neural, e migração da crista neural 7-10. Quail-chick enxerto quimérico analisou o desenvolvimento da placa neural anterior, cume neural anterior, crista neural, e os ossos cranianos 11-14. Esta é a primeira técnica de transplante para o estudo do desenvolvimento craniofacial em Xenopus. Esta técnica tem demonstrado um novo papel para os inibidores de Wnt Frzb1 e crescentes na regulação da formação de membrana basal na boca presuntivo 5. Xenopus laevis é um modelo ideal para o estudo do desenvolvimento craniofacial como embriões são grandes, desenvolver externamente, umand o rosto é facilmente visível, permitindo micromanipulação e imagem do desenvolvimento. Mecanismos subjacentes ao desenvolvimento facial aparecem conservado, indicando que as descobertas feitas no sapo fornecer uma visão sobre o desenvolvimento humano 4,15-16.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="559">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:195px;">Pasteur pipette</td>
			<td rowspan="3" style="width:101px;">VWR</td>
			<td rowspan="3" style="width:136px;">14672-400</td>
			<td style="width:128px;">Lime Glass&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:195px;">Size 5 3/4&#8217;&#8217;</td>
			<td style="width:128px;">Cotton Plugged</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;"></td>
			<td style="width:128px;">Disposable</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="41" rowspan="2" style="height:41px;width:195px;">Graduated Transfer Pipette</td>
			<td rowspan="2" style="width:101px;">VWR</td>
			<td rowspan="2" style="width:136px;">16001-180</td>
			<td style="width:128px;">Disposable&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Polyethylene</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="100" rowspan="2" style="height:100px;width:195px;">#5/45 forceps</td>
			<td rowspan="2" style="width:101px;">Fine Science Tools by Dupont medical</td>
			<td rowspan="2" style="width:136px;">11251-35</td>
			<td rowspan="2" style="width:128px;">Angled 45 degrees</td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="81" rowspan="3" style="height:81px;width:195px;">Standard Pattern Forceps</td>
			<td rowspan="3" style="width:101px;">Fine Science Tools</td>
			<td rowspan="3" style="width:136px;">11000-20</td>
			<td style="width:128px;">Straight; serrated tip</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:128px;">Stainless Steel;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">20cm long</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="81" rowspan="2" style="height:81px;width:195px;">Capillary Tubing (for needles)</td>
			<td rowspan="2" style="width:101px;">FHC</td>
			<td rowspan="2" style="width:136px;">30-30-1</td>
			<td style="width:128px;">Borosil 1.0mm OD x 0.5mm ID/Fiber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">100mm each</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:195px;">Cover slip&#160;</td>
			<td rowspan="4" style="width:101px;">VWR</td>
			<td style="width:136px;">48393 252&#160;</td>
			<td style="width:128px;">24x60mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:195px;">micro cover glass</td>
			<td style="width:136px;">or&#160;</td>
			<td style="width:128px;">or&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:195px;">(for glass bridges)</td>
			<td style="width:136px;">48393 230</td>
			<td style="width:128px;">24x40mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">No.1.5</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:128px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:195px;">Ficoll 400</td>
			<td style="width:101px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">F9378</td>
			<td style="width:128px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:195px;">Needle Puller&#160;</td>
			<td style="width:101px;">Sutter Instrument Co</td>
			<td rowspan="3" style="width:136px;">Needle Puller: discontinued Filament: FB300B</td>
			<td rowspan="3" style="width:128px;">The most similar, currently available&#160; needle puller is the P-97. For filaments, use Sutter 3.00mm square box filaments, 3.0mm wide.</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:195px;">Model P-80</td>
			<td style="width:101px;">Flaming / Brown micropipette puller</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">(discontinued)</td>
			<td style="width:101px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:195px;">Stereomicroscope</td>
			<td rowspan="2" style="width:101px;">Zeiss</td>
			<td rowspan="2" style="width:136px;"></td>
			<td rowspan="2" style="width:128px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Zeiss Stemi 1000</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:195px;">Stereomicroscope Lighting by Fostec</td>
			<td style="width:101px;">Fostec</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:128px;">Use a light box with 2 fiberoptic arms.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="81" rowspan="2" style="height:81px;width:195px;">Nickel Plated Pin Holder</td>
			<td rowspan="2" style="width:101px;">Fine Science Tools</td>
			<td rowspan="2" style="width:136px;">26018-17</td>
			<td style="width:128px;">Jaw Opening Diameter: 0 to 1mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Length: 17cm</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="101" rowspan="3" style="height:101px;width:195px;">Moria Nickel Plated Pin Holder</td>
			<td rowspan="3" style="width:101px;">Fine Science Tools</td>
			<td rowspan="3" style="width:136px;">26016-12</td>
			<td style="width:128px;">Jaw opening Diameter: 0 to 1mm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:128px;">Length: 12cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="60" rowspan="2" style="height:60px;width:195px;">Tungsten Needles</td>
			<td rowspan="2" style="width:101px;">Fine Science Tools</td>
			<td rowspan="2" style="width:136px;">10130-05</td>
			<td rowspan="2" style="width:128px;">0.125mm Rod diameter</td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:195px;">Van Aken Plastalina</td>
			<td rowspan="2" style="width:101px;">Blick&#160;</td>
			<td rowspan="2" style="width:136px;">#33268-2981</td>
			<td rowspan="2" style="width:128px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:195px;">Modeling Clay- white, red or yellow</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:195px;">mMessage mMashine SP6 or T7 Kit</td>
			<td style="width:101px;">Ambion</td>
			<td style="width:136px;">AM1340</td>
			<td style="width:128px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

facial transplants in xenopus laevis embryos

Defeitos congênitos craniofaciais ocorrer em 1 em cada 700 nascidos vivos, mas etiologia raramente é conhecido devido à compreensão limitada do desenvolvimento craniofacial. Para identificar onde vias de sinalização e tecidos agir durante padronização do rosto em desenvolvimento, a técnica &quot;transplante de face&quot; foi desenvolvido em embriões de rã Xenopus laevis. Uma região de tecido facial presuntivo (o &quot;extremo anterior Domain&quot; (EAD)) é removido a partir de um embrião dador na fase tailbud, e transplantado para um embrião hospedeiro da mesma fase, a partir do qual a região equivalente foi removido. Isto pode ser usado para gerar uma cara quimérico onde o tecido do hospedeiro ou de doadores tem uma perda ou ganho de função no gene, e / ou inclui um rótulo linhagem. Após a cura, o resultado do desenvolvimento é monitorizada, e indica os papéis da via de sinalização dentro do doador ou tecidos hospedeiros circundantes. Xenopus é um modelo útil para o desenvolvimento de cara, tal como a região facial é grande e prontamente umccessible para micromanipulação. Muitos embriões podem ser analisadas, durante um curto período de tempo já que o desenvolvimento ocorre rapidamente. Constatações do sapo são relevantes para o desenvolvimento humano, uma vez que os processos craniofaciais aparecer conservadas entre Xenopus e mamíferos.

Tecido transplantado deve ser totalmente inserida na cabeça hospedeiro após o transplante, conforme mostrado na Figura 3A, e tem uma ponte de vidro apropriadamente colocado na face do embrião, como mostrado na Figura 2bc. O tecido do doador transplantadas devem ser corretamente dimensionado para a abertura de acolhimento, para o transplante seja bem sucedido. O tecido EAD não devem sobressair a partir da cabeça, de forma alguma, como pode ser visto nas Figuras 3B e...

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Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Uma técnica para o transplante &quot;Extreme Anterior Domain&quot; tecido facial entre embriões de Xenopus laevis foi desenvolvido. Tecidos podem ser movidos de um gene de expressão fundo em outra, permitindo o estudo das necessidades locais para o desenvolvimento craniofacial e sinalização para as interações entre as regiões faciais.

Transplantes faciais em<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Os embriões

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

facial-transplants-in-xenopus-laevis-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

10.2K visualizações.  Harvard University.  Uma técnica para o transplante "Extreme Anterior Domain" tecido facial entre embriões de Xenopus laevis foi desenvolvido. Tecidos podem ser movidos de um gene de expressão fundo em outra, permitindo o estudo das necessidades locais para o desenvolvimento craniofacial e sinalização para as interações entre as regiões faciais. 

Vídeo: Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Dissection of Organizer and Animal Pole Explants from Xenopus laevis Embryos and Assembly of a Cell Adhesion Assay

This video demonstrates the technique used for preparation of organizer and animal pole explants from Xenopus laevis embryos, including the use of the eyebrow knife - a specialized dissection tool made of one's eyebrow. The protocol for assembling an adhesion assay is also given, which probes for the presence of key adhesion molecules present on the surface organizer or animal pole cells that are critical for proper development.

Dissecção do Organizador e Explantes Pólo animal a partir de embriões Xenopus laevis e Montagem de um ensaio de Adesão Celular

Biologia

Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

Plastic sections maintain true tissue morphology in thin sections of tissue that can be immunostained with fluorescent secondary antibodies, making this method more useful than paraffin-embedded or frozen sections for many types of tissue. The method for staining, plastic embedding, and sectioning is demonstrated in this video.

Incorporação de plástico e secção de embriões Xenopus laevis

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

Obtenção de ovos de Xenopus laevis fêmeas

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Preparação e fracionamento de Xenopus laevis Egg Extractos

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic transport. Because of its large nucleus and high density of nuclear pore complexes (NPCs), nuclear transport can be easily visualized in the Xenopus oocyte. Much insight into the mechanisms of nuclear import and export has been gained through use of this system (reviewed by Pant&eacute;, 2006). In addition, we have used microinjection of Xenopus oocytes to dissect the nuclear import pathways of several viruses that replicate in the host nucleus. 
Here we demonstrate the cytoplasmic microinjection of Xenopus oocytes with a nuclear import substrate. We also show preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning EM, including dissection, dehydration, and embedding of the oocytes into an epoxy embedding resin. Finally, we provide representative results for oocytes that have been microinjected with the capsid of the baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) or the parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), and discuss potential applications of the technique.

Here we demonstrate cytoplasmic microinjection of Xenopus laevis oocytes with a nuclear import substrate, as well as preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning electron microscopy.

Microinjeção de Oócitos Xenopus laevis

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development of a larger region of the embryo. This makes defining its role in a particular tissue difficult to analyze. For example, noggin overexpression in Xenopus laevis embryos causes the expansion of the entire anterior region, including the eye1,2. From this result, it is not known if Noggin plays a direct role in eye determination or that by causing an expansion of neural tissue, Noggin indirectly affects eye formation. Having this complex phenotype makes studying its eye-specific role in cell fate determination difficult to analyze. We have developed an assay that overcomes this problem. Taking advantage of the pluripotent nature of the Xenopus laevis animal cap 3, we have developed an assay to test the ability of gene product(s), like noggin or the eye field transcription factors (EFTFs), to transform caps into particular tissue or cell types by transplanting this tissue onto the side of the embryo 4. While we have found either Noggin protein treatment or a collection of transcription factors can determine retinal cell fate in animal caps, this procedure could be used to identify gene product(s) involved in specifying other tissues as well.

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Animal caps overexpressing gene product(s) are transplanted to the flank of developing Xenopus laevis embryos in order to establish whether tissue is determined.

Determinação tecido Usando o Transplante Cap Animal (ACT) em Ensaio Xenopus laevis</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Em células vivas, Imagem e Análise Quantitativa de células embrionárias epiteliais em Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later stages of embryonic development, and to define how enhancers and promoters regulate gene expression within the embryo. The protocol demonstrated here can be used to efficiently produce transgenic Xenopus laevis embryos. This transgenesis approach involves three parts: 1. Sperm nuclei are isolated from adult X. laevis testis by treatment with lysolecithin, which permeabilizes the sperm plasma membrane. 2. Egg extract is prepared by low speed centrifugation, addition of calcium to cause the extract to progress to interphase of the cell cycle, and a high-speed centrifugation to isolate interphase cytosol. 3. Nuclear transplantation: the nuclei and extract are combined with the linearized plasmid DNA to be introduced as the transgene and a small amount of restriction enzyme. During a short reaction, egg extract partially decondenses the sperm chromatin and the restriction enzyme generates chromosomal breaks that promote recombination of the transgene into the genome. The treated sperm nuclei are then transplanted into unfertilized eggs. Integration of the transgene usually occurs prior to the first embryonic cleavage such that the resulting embryos are not chimeric. These embryos can be analyzed without any need to breed to the next generation, allowing for efficient and rapid generation of transgenic embryos for analyses of promoter and gene function. Adult X. laevis resulting from this procedure also propagate the transgene through the germline and can be used to generate lines of transgenic animals for multiple purposes.

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

This video protocol demonstrates a method for generating transgenic Xenopus laevis by introduction of transgenes into sperm nuclei followed by nuclear transplantation into unfertilized eggs.

Produção de transgênicos Xenopus laevis Por Restrição Integração Mediada por Enzima e Transplante Nuclear

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of neurulation, migrates extensively towards various organs, and differentiates into many types of derivatives (neurons, glia, cartilage and bone, pigmented and endocrine cells). In this protocol, we describe how to dissect the premigratory cranial NC from Xenopus laevis embryos, in order to study NC development in vivo and in vitro. The frog model offers many advantages to study early development; abundant batches are available, embryos develop rapidly, in vivo gain and loss of function strategies allow manipulation of gene expression prior to NC dissection in donor and/or host embryos. The NC explants can be plated on fibronectin and used for in vitro studies. They can be cultured for several days in a serum-free defined medium. We also describe how to graft NC explants back into host embryos for studying NC migration and differentiation in vivo.

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

This protocol describes how to dissect premigratory cranial neural crest (NC) from Xenopus laevis neurulas. These explants can be plated on fibronectin and cultured in vitro, or grafted back into host embryos. This technique allows studying the mechanisms of NC epithelium-to-mesenchyme transition, migration, and differentiation.

Dissecção<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Crista neural para<em&gt; In vitro</em&gt; Cultura Explant ou<em&gt; In vivo</em&gt; Transplante

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of ...

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and widely-utilized +TIPs for analyzing MT dynamics is the End-Binding protein, EB1, which binds all growing MT plus-ends, and thus, is a marker for MT polymerization1. Many studies of EB1 behavior within growth cones have used time-consuming and biased computer-assisted, hand-tracking methods to analyze individual MTs1-3. Our approach is to quantify global parameters of MT dynamics using the software package, plusTipTracker4, following the acquisition of high-resolution, live images of tagged EB1 in cultured embryonic growth cones5. This software is a MATLAB-based, open-source, user-friendly package that combines automated detection, tracking, visualization, and analysis for movies of fluorescently-labeled +TIPs. Here, we present the protocol for using plusTipTracker for the analysis of fluorescently-labeled +TIP comets in cultured Xenopus laevis growth cones. However, this software can also be used to characterize MT dynamics in various cell types6-8.

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

The MATLAB-based, open source software package, plusTipTracker, can be used to analyze image series of fluorescently-labeled +TIPs to quantify microtubule dynamics.

Usando plusTipTracker software para medir Microtubule Dynamics em<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Cones de Crescimento

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...