Uma vez que cerca de 25 milhões de células doadoras de mitocôndrias são obtidas no sétimo dia, colher as células exponencialmente cultivadas em um tubo de 50 mililitros e coletá-las por centrifugação à temperatura ambiente e 520g por cinco minutos. Lavar as células com solução salina tamponada com fosfato frio e sedimentá-las por centrifugação à temperatura ambiente em 520g por cinco minutos. Agora em diante, realizar toda a extração mitocondrial a quatro graus Celsius usando reagentes frios e manter as células ou mitocôndrias no gelo.
Após a terceira centrifugação, descartar o sobrenadante por aspiração com pipeta de vidro acoplada a bomba de vácuo e ressuspender as células do empacotamento em um volume de tampão hipotônico igual a sete vezes o volume da pastilha celular. Em seguida, transfira a suspensão celular para um tubo homogeneizador e deixe as células incharem incubando-as no gelo por dois minutos. Quebrar as membranas celulares realizando 8 a 10 golpes no homogeneizador acoplado a um pilão acionado por motor girando a 600 rotações por minuto.
No homogeneizado celular, adicionar o tampão hipotônico igual a sete vezes o volume da pastilha inicial para gerar um ambiente isotônico. Transfira o homogeneizado para um tubo de 15 mililitros e centrifuga-o em um rotor fixo a 1.000g e quatro graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, colete apenas 3/4 do sobrenadante, deixando uma grande margem do pellet para evitar contaminação com núcleos ou células intactas e transfira-o para outro tubo.
Depois de repetir o processo duas vezes, transfira o sobrenadante contendo a fração mitocondrial para tubos de 1,5 mililitro. Centrifugar os tubos à velocidade máxima de 18.000g durante dois minutos a quatro graus Celsius. Descarte o sobrenadante e lave o pellet enriquecido com mitocôndrias com tampão A.Combine o conteúdo dos dois tubos em um e centrífugo como demonstrado anteriormente.
Repita o processo até que todo o material esteja em apenas um tubo. Lavar o pellet obtido da última centrifugação usando 300 microlitros de tampão A.Quantificar a concentração de proteína mitocondrial usando o ensaio de Bradford. Antes da fusão com a linhagem celular receptora mitocondrial, avaliar-se a ausência de núcleos contaminantes na fração mitocondrial por imunodetecção de proteínas nucleares.
Alternativamente, realizar reação em cadeia da polimerase quantitativa ou amplificação por QPCR de um gene nuclear.
