A geração cibernética ainda é o protocolo de última geração para entender o papel patogênico de qualquer nova mutação de DNA mitocondrial e correlacionar a porcentagem de atriplasmia com a gravidade da doença. Esta técnica permite a realização de investigação bioquímica em um sistema nuclear homogêneo, no qual a contribuição do fundo nuclear do paciente está ausente. Esta técnica permite validar a patogenicidade de uma mutação do DNA mitocondrial.
e torna possível estudar seu impacto a nível bioquímico Lavar os pratos de 35 milímetros contendo os fibroblastos duas vezes usando dois mililitros de 1X PBS sem cálcio e magnésio. Limpe a superfície externa dos pratos com 70% de etanol, e espere até que o álcool evapore. Retire as tampas dos pratos e as tampas dos parafusos das garrafas.
Coloque cada prato sem a tampa de cabeça para baixo na parte inferior de cada garrafa centrífuga de 250 mililitros. Adicione lentamente 32 mililitros de um meio de nucleação a cada garrafa permitindo que o meio entre no prato e entre em contato com as células. Remova todas as bolhas dos pratos usando uma pipeta de pastagem de vidro longa, curvando a ponta em uma chama bunsen.
Feche cada garrafa com a tampa do parafuso e transfira-as para a centrífuga. Centrifugar por 20 minutos a 37 graus Celsius e 8.000 x G.Aspire o meio das garrafas e descarte-o. Retire os pratos invertendo as garrafas em uma gaze estéril previamente pulverizada com 70% de etanol.
Limpe a superfície externa dos pratos e suas tampas com 70% de etanol, e feche os pratos depois que o etanol evaporar. Antes de prosseguir, verifique se há formação de citoplastia usando um microscópio invertido para células vivas. Procure por fibroblastos extremamente alongados devido à extrusão de seus núcleos induzidos por citochalasina.
A cada prato de 35 milímetros adicione 1.000, 143 células de linha zero. Re suspendido em dois mililitros de cultura médio suplementado com 5%FBS. Deixe os pratos por três horas em uma incubadora de dióxido de carbono umidificado para resolver as 143 células da linha zero nos fantasmas.
Após três horas de incubação, aspire e descarte o meio. Lave as células de adesão duas vezes com dois mililitros de DMEM de alto meio de glicose sem soro ou MEM, depois aspire e descarte o meio. Adicione 500 microliters de solução de polietileno glicol às células e incubar por exatamente um minuto.
Aspire e descarte a solução de polietileno glicol. Lave as células três vezes com dois mililitros de DMEM de alta glicose sem soro ou com MEM. Adicione dois mililitros de meio de fusão, e incubar durante a noite na incubadora a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.
Trypsinize as células nos pratos de cultura restantes Conte-as e semee-as em uma ou mais placas de Petri Adicione 50 a 100 células por prato na cultura suplementada até que os clones apareçam. Então deixe-os crescer por vários dias. Usando um microscópio estéreo, pegue os clones da placa de Petri com cilindros de clonagem ou uma ponta de pipeta.
Tente evitar a junção de diferentes clones e transfira-os para uma placa de 96 poços, cada um contendo 200 microliters de meio de cultura suplementar. Cibrids foram gerados a partir de fibroblastos derivados de um paciente portador do M2343A2G heteroplasmático Uma das mutações de DNA mitocondrial mais comuns associadas à miopatia mitocondrial, acidose lacótica encefalopatia e episódios semelhantes a derrame. A análise de um número variável de repetições tandem mostrou que o DNA cibernético é idêntico às células da linha zero confirmando a substituição do DNA cibernético do paciente pelo genoma de 143 B.
O polimorfismo de comprimento do fragmento de restrição, ou análises de sequenciamento, pode ser usado para avaliar a presença da mutação do DNA mitocondrial e a porcentagem de heteroplasma. Ao tentar este protocolo é importante verificar o ativo genético correto do DNA nucleon e mitocondrial, bem como a quantidade de DNA mitocondrial nos cibridos repovoados.
