Para a geração de cibridos transmitocôndriais, use as células receptoras mitocondriais que foram esgotadas para mitocôndrias pelo tratamento com Rodamina 6G e realize fusão com mitocôndrias isoladas das células doadoras de mitocôndrias. Garantir a abolição adequada da função mitocondrial em células receptoras e purificação de organelas de células doadoras, semeando um pequeno número de células tratadas com Rodamina 6G e mitocôndrias isoladas em meio de cultura completo em uma placa de seis poços. Verifique se não há células sobreviventes remanescentes nos poços após um mês de cultura.
Para prosseguir com a fusão, adicione cuidadosamente as células tratadas com Rodamina 6G à pelota de mitocôndrias isoladas. Em seguida, centrifugar a 520g por cinco minutos para permitir que as células se misturem com as mitocôndrias. Adicione 100 microlitros de polietilenoglicol a 50% e ressuspenda suavemente o pellet por 30 segundos Em seguida, deixe a suspensão descansar intocada por mais 30 segundos.
Finalmente, transfira a mistura para uma placa de seis poços com meio de cultura celular completo fresco e coloque-a na incubadora a 37 graus Celsius com dióxido de carbono a 5%. Normalmente, após cerca de uma semana, os cibrídeos transmitocondrais devem começar a crescer, dando origem a clones que podem ser selecionados individualmente ou misturados em um pool antes de sua análise. Os fragmentos de restrição obtidos a partir da análise do polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição, ou RFLP, de mitocôndrias selvagens diferiram do mutante.
A análise por RFLP das novas linhagens celulares transmitocondriais indicou que os fragmentos de restrição foram idênticos aos obtidos em seus respectivos doadores mitocondriais e diferentes daqueles gerados com as linhagens celulares receptoras. Além disso, a diferença em um perfil típico de genotipagem nuclear do DNA das duas linhagens celulares usadas no processo de hibridização também poderia ser usada para confirmar a pureza do DNA nuclear.
