Prepare-se para a imunomarcação dissecando a estria vascular do camundongo e adicione o tecido a uma placa de 24 poços contendo 200 microlitros de paraformaldeído a 4% em PBS 1X. Incubar o tecido durante 20 minutos à temperatura ambiente. realizar duas lavagens curtas de 1X PBS em um agitador orbital a baixas RPM.
Remova o PBS e, em seguida, realize a permeabilização e o bloqueio por um período mínimo de uma hora à temperatura ambiente em 300 microlitros de solução de PBST. Em seguida, manchar o tecido com o anticorpo primário durante a noite a quatro graus Celsius. Em seguida, adicione um anticorpo secundário e incube por duas horas à temperatura ambiente em um agitador orbital a baixas RPM.
Cubra a placa para proteger o anticorpo secundário marcado fluorescentemente da luz. Em seguida, prepare uma microlâmina maior colocando duas pequenas faixas de cola ao longo do eixo de 25 mm, um pouco menor do que a tampa de vidro de 18 por 18 milímetros. Coloque uma gota de reagente de montagem entre as estrias de cola.
Usando pinça número 55, coloque o mínimo de tecido possível em uma das extremidades da VS e transfira-o do PBS para o reagente de montagem. Coloque uma extremidade da tampa deslizante na lâmina onde foi colocada uma faixa de cola. Em seguida, solte suavemente a tampa para evitar a criação de bolhas de ar.
Sele o suporte passando uma gota de esmalte transparente em cada canto do suporte. Rotule o espécime na tampa de vidro, longe do campo de visualização. Visualize o tecido SV sob um microscópio de dissecção para garantir que ele esteja deitado e não perto de bolhas de ar.
Se o tecido do SV não estiver orientado corretamente, tente empurrar as bolhas de ar ou remova cuidadosamente a tampa de vidro menor e reposicione o SV. Uma montagem inteira de VS de camundongo P30 foi preparada e imagens confocais foram realizadas. A expressão de ZsGreen foi observada nas células intermediárias, as células endoteliais marcadas com GSIB4 e os núcleos marcados com DAPI.
