Para começar, pegue o pellet das GFP-HUVECs cultivadas a um nível de confluência de 80 a 100% e ressuspenda as células em um volume apropriado de meio basal para atingir uma concentração de uma vez 10 a sétima células por mililitro de solução estoque. Preparar tubos de centrífuga cônica de 50 mililitros contendo o volume necessário de meio basal suplementado com os respectivos fatores de crescimento. Adicionar as GFP-HUVECs da solução-mãe numa diluição de um a 66,67 para atingir uma concentração de 1,5 vezes 10 à quinta células por microlitro.
Em seguida, aspirar o meio da placa contendo a monocultura estromal e adicionar 200 microlitros por poço da suspensão GFP-HUVECs preparada. Incubar a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono em uma atmosfera umedecida, trocando o meio a cada três ou quatro dias. Monitorar o desenvolvimento da cultura por microscopia de campo claro e fluorescência usando uma objetiva de cinco vezes.
Diferenças entre as culturas puderam ser observadas a partir das imagens de campo claro e fluorescência mostrando apenas as GFP-HUVECs. As culturas mostraram-se menos desenvolvidas, sem qualquer fator de crescimento, porém, observou-se desenvolvimento mais rápido na presença do FGF-2. Em contraste, as imagens de campo claro mostraram as culturas mais densas na presença de BMP-2.
No entanto, redes vasculares semelhantes formaram-se em ambas as condições contendo fator de crescimento e as redes mais extensas e interconectadas foram formadas com FGF-2.
