Para começar, coloque o corte de medula espinhal preparado na câmara de gravação. Em seguida, coloque o ânodo do sistema de micromanipulação próximo à linha média dorsal no cátodo próximo à zona de entrada da raiz dorsal para o posicionamento adequado do estimulador medular. Agora mude para uma lente objetiva de 60X para identificar um neurônio saudável com uma superfície lisa e brilhante sem núcleos visíveis.
Diminua ligeiramente a intensidade do infravermelho, ligue a fonte de luz fluorescente e ajuste o filtro de luz para a opção de excitação ultravioleta de banda larga. Agora, selecione um neurônio motor Fluoro-Gold-positivo apropriado e abaixe gradualmente o eletrodo até que ele esteja perto do neurônio. À medida que a pipeta entra em contato com sua superfície, procure um pequeno recuo de membrana no nível da ponta e libere a pressão positiva aplicada anteriormente.
Em seguida, aplique pressão negativa na pipeta usando uma seringa e aguarde até que o valor da resistência suba para gigaohms na interface do software. Aperte o potencial de membrana a menos 70 milivolts. Pressione o botão de compensação rápida de capacitância na interface de software do amplificador, aplique uma breve pressão negativa para romper a membrana celular e pressione o botão de compensação de capacitância lenta na interface de software do amplificador.
Aplicar a estimulação medular por um a dois segundos mantendo a amplitude entre um e 10 miliamperes. Determinar o limiar motor aumentando gradualmente a amplitude de estimulação até que o primeiro potencial de ação seja observado. Distinguir neurônios motores de disparo retardado e imediato usando uma injeção de corrente despolarizante de cinco segundos ao redor da reobase no modo de pinça atual.
Depois de desligar a estimulação medular, continue registrando os potenciais de membrana para capturar o disparo dos potenciais de ação espontânea. Quando a amplitude de estimulação medular foi elevada, o potencial de membrana foi aumentado, e os potenciais de ação foram acionados a cada 10 a 20 pulsos. Após o desligamento da estimulação medular, o neurônio disparou uma série de potenciais de ação espontânea por um curto período de tempo.
Em seguida, o potencial de membrana de repouso retornou a menos 65 milivolts.
