Para começar, cultivar as células em meio completo DMEM contendo 10% FBS e 5% penicilina-estreptomicina em uma placa de seis poços. Incubar a cultura durante uma noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. No dia seguinte, co-cultivar as células com 10 nanomolares nanomolares de polilisina modificada por óxido de ferro ou IONPs, e incubar a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 12 horas.
Após a incubação, adicione 0,5 mililitros de tripsina por poço por três minutos para digerir as células. Em seguida, adicione um mililitro de Meio Completo por poço para interromper a digestão. Centrifugar a suspensão celular a 1.000 g durante cinco minutos e eliminar o sobrenadante antes de voltar a suspender o pellet em PBS.
Em seguida, ressuspenda o pellet em oito mililitros de solução hipotônica recém-preparada por 15 minutos. Transfira a suspensão celular para um tubo de ensaio de vidro e, usando um homogeneizador de vidro, aplique 20 choques a 1.000 RPM para liberar as organelas. Após homogeneização, transferir um mililitro da suspensão celular para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.
Coloque o tubo em um separador magnético por uma hora para separar completamente os endossomos carregados com IONP de outras organelas e detritos celulares. Para coletar endossomos, descarte o líquido do tubo e adicione três mililitros de PBS para ressuspender os endossomos. Em seguida, use uma pistola de pipeta para soprar novamente para ressuspender as pelotas marrons encontradas na superfície de contato do tubo ao lado da estrutura magnética.
Para homogeneização de alta velocidade, transfira a solução endossomal para um tubo centrífugo de 15 mililitros. Coloque a caixa de gelo sob o tubo e, em seguida, coloque o tubo no homogeneizador de alta velocidade. Coloque a sonda de 10 mililitros no tubo sem tocar no fundo.
Na tela do homogeneizador, ajuste a velocidade para 140 g e defina o tempo para cinco minutos. Pressione o botão OK seguido pelo botão Iniciar. Após homogeneização em alta velocidade, transfira a suspensão da nanovesícula para um tubo de 1,5 mililitro e coloque o tubo em um separador magnético por uma hora.
Finalmente, colete o líquido contendo as imitações ou EMs do exossomo necessários sem perturbar a superfície próxima ao quadro magnético. A morfologia das BMSC-MEs analisadas por NTA e MET mostrou uma estrutura vesícula típica em forma de tigela, delimitada por uma bicamada lipídica. Tanto os BMSC-MEs quanto os 293T-EMs apresentaram diâmetro hidrodinâmico semelhante aos EVs nativos.
Os resultados de Western blotting mostraram que os BMSC-EMs contêm os mesmos biomarcadores proteicos que os EVs, e quase não tiveram contaminação da membrana plasmática. O rendimento de EMS foi significativamente maior do que os EVs nativos preparados por ultracentrifugação. Os MEs apresentaram composição proteica semelhante aos EVs nativos.