Para iniciar o rejeito G/I, prepare uma mistura de 20 microlitros no gelo com RNA total, mistura de tampão de cauda e mistura de enzimas de cauda. Incubar a 37 graus Celsius por 60 minutos em um termociclador. Em seguida, adicione a solução tail stop e mantenha no gelo por dois minutos.
Realizar transcrição reversa e amplificação por PCR. Após eletroforese em gel de alta resolução dos produtos de PCR, acesse os dados utilizando o software. Abra o arquivo XAD e selecione nomes de amostra ou escada no painel Exibição em árvore.
Aumente e diminua o zoom de eletroferogramas e imagens em forma de gel para exibição detalhada. Para obter os tamanhos dos picos, abra o eletroferograma de uma amostra selecionada. Clique com o botão direito do mouse no eletroferograma e selecione a integração manual para selecionar manualmente os picos arrastando a linha horizontal.
Observe os valores de pico na tabela de pico e identifique o pico com a maior altura de pico. Ative o ícone Mostrar/Ocultar Setpoints no menu superior. Um novo painel aparecerá no lado direito.
Selecione Avançado, role para baixo até Executar análise de esfregaço e marque a caixa de seleção. Isso adicionará a tabela Região à guia Eletroferograma. Em seguida, selecione um eletroferograma e vá para a tabela Região.
No menu Do Par de Base e Para Par de Base, defina o par de base inicial e final clicando com o botão direito do mouse no eletroferograma e selecionando uma região a ser adicionada. Clique com o botão direito do mouse em qualquer célula na tabela Região e selecione Modificar Regiões para criar uma pequena nova janela pop-up para definir regiões personalizadas. Use esta equação para calcular o comprimento da cauda poli(A) no mRNA de interesse.
Em seguida, na guia Eletroferograma, marque Mostrar tamanhos para converter automaticamente a tabela Região do par base em tempo de execução. Abra o arquivo CSV e selecione os valores obtidos para tempo de execução para gerar um gráfico. Usando este protocolo, os comprimentos poli(A)caudais dos genes Dscam1 e GAPDH de cérebros de larvas de Drosophila foram analisados, enquanto os produtos de PCR de pares de primers específicos para genes mostraram uma única banda.
Os produtos de PCR dos pares de primers universais específicos para genes mostraram padrões distintos de esfregaços, indicando poli(A)comprimento diferencial dos RNAm. Os comprimentos médios de poli(A)cauda foram obtidos por meio de esfregaços. E a amplitude dos comprimentos da cauda foi representada por eletroferogramas.
Similarmente, a análise do comprimento da cauda poli(A) em células S2 mostrou comprimentos diferenciais da cauda poli(A) para os genes UTR e GAPDH SV43.
