Para começar, inocular uma única colônia OP50 em cinco mililitros de LB com ampicilina e anfotericina B e incubar por aproximadamente seis horas a 37 graus Celsius em um agitador bacteriano. Quando a cultura ficar turva, diluir a cultura pré-inóculo de OP50 em 1 a 2.000 em 250 mililitros de TB com ampicilina e glicerol. Em seguida, transfira a cultura líquida OP50 para um tubo de centrifugação estéril.
Centrifugue o tubo por 15 minutos a 3.100 G em uma centrífuga de mesa a quatro graus Celsius. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento OP50 em água estéril antes da recentrifugação. Após a segunda lavagem, rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento OP50 em água estéril até um volume de 50 ml.
Transfira-o para um tubo cônico de 50 mililitros pré-pesado. Centrifugue o tubo por 20 minutos para granular o OP50. No final da centrifugação, remova cuidadosamente todo o sobrenadante restante, garantindo que não haja água no tubo.
Calcule o peso do pellet subtraindo o peso do tubo de centrifugação vazio do peso do tubo de centrifugação com o pellet. Ressuspenda completamente o pellet OP50 em tampão S-completo para atingir uma concentração de 100 miligramas por mililitro. Teste a suspensão OP50 em uma placa de ágar para verificar se há contaminação.
Armazene a suspensão OP50 em buffer S-complete a quatro graus Celsius.
