Injete de um a três miligramas de anticorpo CD45 anti-camundongo conjugado com fluoróforo diluído em 100 mililitros de solução salina normal por via intravenosa em cada camundongo anestesiado. Comece colocando quatro mililitros de tampão HEPES gelado preparado em um tubo dissociador de tecido especializado no gelo para cada camundongo. Após a eutanásia do camundongo, coloque os pulmões ressecados em seu respectivo tubo dissociador de tecido, resfriado em gelo.
Coloque os tubos no dissociador de tecido automatizado e execute o primeiro programa predefinido para o tecido pulmonar. Em seguida, adicione 500 microlitros de solução estoque de liberase e 500 microlitros de solução estoque de aminoguanidina a cada tubo contendo o tecido pulmonar dissociado. Incube-o em um misturador de nutação por 30 minutos a 37 graus Celsius.
Em seguida, coloque os tubos de volta no dissociador e execute o segundo programa predefinido para o tecido pulmonar. Agora despeje a suspensão de célula única do tubo dissociador de tecido através de um filtro de células de 100 micrômetros em um tubo cônico de 50 mililitros. Enxágue o tubo dissociador de tecido com cinco mililitros de EHAA completo e passe pelo filtro para o tubo de 50 mililitros.
Após remover o filtro, aumente o volume da suspensão celular para 50 mililitros com EHAA completo. Em vez de usar tubos dissociadores de tecidos especializados, coloque os pulmões ressecados em seus respectivos tubos de microcentrífugas de 1,5 mililitro resfriados em gelo. Depois que todos os pulmões forem colhidos, transfira cada pulmão para um novo tubo de microcentrífuga sem nenhum meio celular.
Usando uma tesoura, corte os pulmões em pequenos fragmentos dentro do tubo de microcentrífuga. Adicione um mililitro de coquetel de digestão liberase TM e DNase I a cada tubo. Incube por 30 minutos a 37 graus Celsius em banho-maria.
Em seguida, despeje a amostra sobre um filtro de células de 100 micrômetros colocado em cima de um tubo cônico de 50 mililitros. Pipetar a amostra restante para o filtro. Amasse o tecido contra a malha com a extremidade de borracha do êmbolo de uma seringa estéril de um mililitro.
Enxágue o filtro com tampão classificador frio, coletando um volume final de sete mililitros no tubo. Seja usando o método de dissociação automatizado ou manual, centrifugue a suspensão celular obtida. Aspire cuidadosamente o sobrenadante, deixando para trás aproximadamente 100 microlitros de sobrenadante e o pellet celular.
Finalmente, adicione aproximadamente 100 microlitros de solução de bloco Fc para elevar o volume total para 200 microlitros e vórtice vigorosamente para ressuspender o pellet.