Carregamento de células T CD4⁺ primárias de camundongo e revestimento de esferas magnéticas de proteína G com anticorpos para imagens locais de Ca²⁺

Para começar, pegue células T CD4-positivas isoladas de linfonodos e baço de camundongos. Centrifugue de dois a cinco milhões de células por cinco minutos a 300 g. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 480 microlitros de meio de células T contendo 10 micromolares de Fluo-4 AM e 20 micromolares de Fura Red AM. Cubra o tubo Falcon com papel alumínio e incube as células por 20 minutos em temperatura ambiente no escuro.

Em seguida, adicione dois mililitros de meio de células T às células e continue incubando por mais 30 minutos. Misture suavemente a suspensão de esferas magnéticas de proteína G e transfira 12,5 microlitros para um novo tubo. Coloque o tubo em um suporte magnético para permitir que as contas migrem para o ímã.

Pipete suavemente o buffer de armazenamento do lado oposto do ímã para removê-lo. Para remover qualquer buffer de armazenamento restante, adicione 500 microlitros de PBST e vórtice por 10 segundos. Coloque o tubo no suporte magnético novamente e remova o tampão.

Para revestir as esferas com anticorpos, ressuspenda-as em 7,5 microlitros de PBST e adicione cinco microlitros de anti-CD3 e anti-CD28. Incubar durante 30 a 60 minutos enquanto mistura continuamente à temperatura ambiente. Lave os grânulos revestidos três vezes com 500 microlitros de PBST, seguido de uma lavagem com 500 microlitros de tampão de cálcio usando o suporte magnético e, em seguida, ressuspenda os grânulos em 200 a 400 microlitros de tampão de cálcio.