Detecção de microdomínios de Ca²⁺ em nível subcelular em células T murinas primárias usando microscopia de fluorescência

Para começar, coloque 10 microlitros das células CD4+ carregadas na lâmina preparada e deixe-as prender por três a cinco minutos. Adicione suavemente 80 microlitros de tampão de medição de cálcio à lâmina. Selecione a lente de imersão em óleo 100X.

Aplique uma pequena gota de óleo de imersão e coloque a lâmina no microscópio stage. Em seguida, ajuste o foco no modo de campo claro. Selecione um campo de visão com até 10 células que não estejam em contato umas com as outras e adquira uma imagem.

Em seguida, adicione 10 microlitros de esferas revestidas com anticorpos ou estimulante após um minuto e meça por um total de três minutos usando 40 quadros por segundo ou a taxa de quadros máxima possível. Use o controle deslizante para identificar o tempo de contato entre uma conta e uma célula de interesse. No menu Opções no lado direito, selecione o contato do cordão:x, y, t.

Selecione o ponto no lado esquerdo da imagem onde a célula e a conta fazem contato. Selecione Escolher célula clicando em um ponto dentro. Clique na célula estimulada por esta conta, de preferência no centro.

Clique em ADICIONAR contato do cordão. Depois que todos os contatos do grânulo estiverem definidos, clique no botão Continuar e prossiga com arquivos adicionais As células do tipo selvagem exibiram a rápida formação de microdomínio de cálcio no primeiro segundo após a estimulação, que se expandiu por toda a célula nos 15 segundos subsequentes. Por outro lado, as células mutantes P2x4 e P2x7 mostraram diminuição da formação de microdomínio de cálcio, com as células mutantes P2x4 também apresentando um nível basal mais baixo antes da estimulação.

Como as células T murinas, microdomínios de cálcio foram observados no local de contato do grânulo em células T CD4 + humanas.