Para começar, obtenha as células HEK293T que expressam RapR-Shp2 e realize a imunoprecipitação com a proteína G-Sepharose. Após a imunoprecipitação, lave a sepharose duas vezes cada uma com 0,5 mililitros de tampão de lise, seguido por 0,5 mililitros de tampão de lavagem. Remova o máximo de buffer possível após a rodada final.
Em seguida, adicione 40 microlitros da fosfo-paxilina na mistura tampão imidazol a cada amostra com ou sem uma rapamicina micromolar. Agite o tubo suavemente e coloque-o imediatamente no agitador de aquecimento por 40 minutos a 32 graus Celsius. Ajuste o agitador de aquecimento para 1000 rotações por minuto para garantir a agitação total da amostra.
Para interromper a reação, adicione 40 microlitros de tampão 2X Laemmli a cada amostra e incube-os a 95 a 100 graus Celsius por cinco minutos. Depois que as amostras esfriarem, carregue 15 microlitros de cada amostra em um gel de poliacrilamida SDS de quatro a 15% de gradiente. Execute um protocolo padrão de Western blot usando membranas de PVDF.
Finalmente, blot usando anticorpo anti-FLAG para detectar a construção RapR-Shp2 e anti-fosfo-paxilina para detectar paxilina fosforilada nas amostras. O RapR-Shp2 ativo não apresentou fosfo-paxilina, semelhante ao Shp2 constitutivamente ativo, indicando atividade total retida. RapR-Shp2 inativo e Shp2 negativo dominante mostraram níveis semelhantes de fosfo-paxilina, indicando nenhuma atividade quando inativo.
