Para começar, coloque os reagentes necessários para a preparação da eletroforese em gel em uma plataforma de trabalho. Adicione Tris / Borato / EDTA, ou TBE, à agarose e aqueça a solução no micro-ondas. Em seguida, despeje o 0,4-0,5% de agarose em uma bandeja de fundição para preparar um gel de agarose de primeira dimensão e deixe solidificar por uma hora.
Após a solidificação, carregue a escada nos primeiros 3 centímetros em relação à borda mais à esquerda do gel. Em seguida, carregue as amostras de DNA digeridas com enzimas de restrição, garantindo uma distância de 3 centímetros entre cada par. Execute o gel em TBE por 19-24 horas a 0,85 volts por centímetro para separar os intermediários por tamanho.
No dia seguinte, remova o gel do tampão. Extirpar os primeiros 3 centímetros do gel que contém a escada. Manchar o segmento de gel em TBE contendo 0,3 microgramas por mililitro de brometo de etídio por 10-15 minutos.
Em seguida, visualize a escada usando um sistema de documentação de gel. No gel de agarose, adicione 1,3 centímetros ao local estimado, produzindo um valor de A.Em seguida, subtraia 7,5 centímetros do valor A, produzindo o valor B.Alinhe a régua contra o gel de primeira dimensão e corte horizontalmente nos valores A e B.Em seguida, corte verticalmente o espaço de 3 centímetros reservado para cada amostra. Em uma nova bandeja de fundição, gire os segmentos no sentido horário e coloque-os na posição dos poços de amostra.
Prepare o gel de agarose de segunda dimensão a uma concentração de 1-1,3% em TBE com 0,3 microgramas por mililitro de brometo de etídio. Aqueça o gel e, ao esfriar a aproximadamente 55 graus Celsius, despeje-o sobre os segmentos girados da primeira dimensão. Deixe o gel solidificar por uma hora.
Após a solidificação, transferir o gel para uma câmara contendo TBE a 0,3 microgramas por mililitro de brometo de etídio e deixá-lo em equilíbrio durante 30 minutos. Cubra o gel e deixe funcionar por 9 a 10 horas a 4,23 volts por centímetro a 4 graus Celsius. Remova o gel de segunda dimensão da câmara e depurine os fragmentos de DNA por 10 minutos em uma solução de ácido clorídrico 0,24 molar com balanço suave.
Enxágue o gel com água deionizada e mergulhe-o em hidróxido de sódio 0,4 molar por 10-15 minutos. Em seguida, dobre duas folhas compridas de papel para cromatografia perpendicularmente ao longo da folha de vidro, estendendo-se para dentro do recipiente. Para montar o southern blot, encha um recipiente com 1 litro de hidróxido de sódio 0,4 molar.
Alinhe uma longa folha de vidro ao longo do recipiente. Molhe a parte superior do papel com hidróxido de sódio e remova cuidadosamente quaisquer bolhas de ar sob sua superfície. Mergulhe três folhas de papel de cromatografia com hidróxido de sódio e coloque-as sobre o papel de pasta.
Remova todas as bolhas de ar. Vire o gel de segunda dimensão de cabeça para baixo e coloque-o sobre os papéis de cromatografia. Molhe uma membrana de nylon carregada positivamente com água deionizada e coloque-a sobre o gel.
Em seguida, coloque três folhas de cromatografia úmidas com água deionizada sobre a membrana. Cubra qualquer hidróxido de sódio exposto no recipiente com filme plástico para evitar a evaporação. Coloque uma pilha de guardanapos ou toalhas de papel de 0,3 a 0,5 metros de altura sobre a mancha.
Comprima todo o blot com um peso para facilitar a ação capilar firme e deixe-o por dois dias para transferência de DNA para a membrana.
