Este trabalho é suportado por uma concessão do MRC de M. FS.

1. Desenvolvimento dos embriões <ol><li> Quando eles são postos, os ovos são agrupados por causa de filamentos penhora sobre o córion. Para permitir que os embriões se desenvolvem normalmente, é necessário separar os ovos. Emaranhado de filamentos e cortar anexo mantendo os filamentos anexo com duas pinças. </li><li> Depois de desagrupamento, os ovos são separados a partir de fezes e algas e transferidos para o meio do embrião fresco a uma densidade máxima de 40 ovos por seis centímetros placa de Petri. </li><li> Embriões Medaka desenvolver um pouco mais lento que o peixe-zebra a 27 ° C. O tempo de incubação é diferente entre as duas espécies; embriões medaka hatch do córion em 7 dias e iniciar imediatamente a nadar e comer, enquanto embriões zebrafish eclodem em dois dias, mas começar a nadar e comer em 5-6 dias. Desenvolvimento de medaka é encenado de acordo com a 4 Iwamatsu do teste. </li><li> O desenvolvimento de embriões medaka pode ser convenientemente ajustado para planos experimentais, selecionando a temperatura adequada. Desenvolvimento de embriões medaka pode ser interrompido a 4 ° C no início do desenvolvimento. Após a fase 24, quando começa a batida do coração, o desenvolvimento pode ser retardado com uma temperatura mínima de 18 ° C. </li><li> O tempo de aparecimento de órgãos / tecidos é um pouco diferente em comparação com medaka zebrafish, ou seja, somitogenesis medaka ocorre após o início do desenvolvimento do cérebro enquanto que em somitegenesis zebrafish precede o desenvolvimento do cérebro. </li></ol> 2. Remoção do córion Córion de medaka consiste em duas camadas de proteção com uma camada dura interna e uma superfície macia exterior. Assim, um tratamento de protease de duas etapas empregando pronase e enzima incubação é necessário eliminar essa córion. Uma vez dechorionated, os embriões devem ser mantidos em 1X BSS. Semi-estéril condições irão reforçar a cultura de embriões dechorionated sucesso, especialmente quando períodos mais longos de observação são necessários. Estes incluem o uso de soluções estéreis (por exemplo, esterilizados 1X BSS com antibióticos) e ferramentas esterilizadas com etanol 70% seguido de lavagem com 1X BSS. Como embriões dechorionated medaka são mais suaves e mais frágil do que embriões zebrafish dechorionated, cuidados extras devem ser tomados para garantir que eles não entrem em contato com o ar ou bolhas na pipeta, pois isso irá causar colapso imediato. Para garantir o mínimo dano aos embriões, um de boca larga calor pipeta de vidro polido com bomba pipeta deve ser usado para a transferência de embriões e um laço do cabelo deve ser utilizado para orientar os embriões para a observação. Pratos não aderente Petri deve ser usado para evitar embriões de fixação em superfícies. <ol><li> Antes de dechorionation deve ser verificado que os ovos foram suficientemente separados e limpos-up. </li><li> Uma vez que ambos pronase e enzimas de incubação são proteinases, eles devem ser mantidos em gelo e minimizar a exposição de embriões para estas enzimas. </li><li> Transferência de ovos para lixa (P2000 tamanho do grão, à prova d&#39;água) colocado na tampa de uma placa de Petri nove centímetros. Remova o meio de excesso, mas garantir um volume suficiente permanece como para evitar a secagem de embriões. </li><li> Rolo delicadamente embriões por cerca de 45-60 segundos para remover alguns dos cabelos superfície externa e levemente marcar a superfície do córion (Figura 1). Transferência de embriões de volta para placa de Petri original e examinar. Quando os embriões rolando no lixa usar o dedo indicador, aplicando o mínimo de pressão e manter paralelo dedo para a superfície de papel de areia. Não enrole mais de embriões 5-7 ao mesmo tempo. Esta precaução irá minimizar o risco de esmagamento embriões um embaixo do outro. </li><li> Substituir médio do ovo no prato com pronase 20mg/ml e embriões incubar por 40-60 minutos a 27 ° C. Garantir os embriões são suficientemente cobertos pela pronase e uma tampa está presente no prato. Pronase não utilizados devem ser mantidos em gelo durante esta etapa para minimizar auto-digestão e pode ser reutilizado até que a atividade é perdido (cerca de 1-2 semanas). </li><li> Recuperar pronase para reutilização e embriões lavar 5X em meio embrião para remover traços de pronase como isso irá inativar a enzima incubação a ser adicionado. </li><li> Remova o meio de embriões e embriões cobrir com a enzima incubação, garantindo embriões sentar-se como uma monocamada no prato. Se os ovos se sentar em cima da outra no prato, aqueles na parte inferior será esmagado como o córion se dissolve. Mantenha enzima incubação não utilizados no gelo. </li><li> Incubar os embriões a 27 ° C e após 15 minutos verificar periodicamente o progresso da incubação utilizando um estereomicroscópio. Será visto que uma série de cratera lunar, como os buracos começam a aparecer na camada interna do córion, que logo se dissolve após esta deixando a camada externa macia do córion facilmente removido manually. Todo o processo de incubação pode levar 15-60 minutos. </li><li> Assim que os embriões saem do córion, a transferência de embriões para uma placa de Petri contendo 1X BSS. Garantir a não transferir para a incubação da enzima 1X BSS tocando a ponta da pipeta na superfície do BSS permitindo que os embriões gentilmente roll out. </li><li> Uma vez que todos os embriões são transferidos de incubação da enzima, fazer uma transferência definitiva para outro prato de doce de 1X BSS. Isso garante embriões não estão expostas a quaisquer vestígios de incubação da enzima, pois isso irá danificar embriões expostos. Uma vez neste prato final de qualquer embrião ainda possuir a camada externa do córion podem ser liberados manualmente usando micro-pinças esterilizadas sob o estereomicroscópio. Se os embriões precisam ser desenvolvidos dechorionation seguintes, de penicilina / estreptomicina deve ser adicionado ao BSS para prevenir o crescimento bacteriano. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2055/2055fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Comparação de embriões laminados e desenrolou durante dechorionation. Observar como os embriões rolou no painel B falta os cabelos visto na embriões desenrolou no painel A. 3. Montagem embriões dechorionated Incorporação de agarose é útil para longos períodos de imagem (por exemplo, imagem em tempo-lapso) para embriões vivos, bem como para observações detalhadas dos embriões fixo. Durante a gastrulação e organogênese inicial (fase 14 para estágio 28), os embriões medaka apresentam ondas de movimentos rítmicos contrátil do outro lado da periderme, uma camada de tecido que cobre tanto embrião do desenvolvimento e da gema 5. Embriões são tratados com 3,5 mm 1-heptanol para parar os movimentos contráteis 6. Para interromper a circulação de embriões após a etapa 28 (64hpf), os embriões são anestesiados pela adição de gotas de tricaina mesilato (TMS), antes de incorporação. TMS também é adicionado à agarose (adicione apenas uma quantidade mínima, esta dose precisa ser otimizado, cerca de uma diluição de 1:25). <ol><li> Descongelar uma pequena quantidade de 3% de baixa temperatura de gelificação agarose (em 1X BSS) por aquecimento a 37 ° C e mantida a esta temperatura. </li><li> Os seguintes passos precisam ser realizadas rapidamente para garantir que a agarose não se solidifica antes de orientar o embrião. Usando um de boca larga transferência pipeta de vidro agarose derretida suficiente para preencher a depressão tampa de um tubo Eppendorf. </li><li> Transferência de um embrião dechorionated à depressão cap minimizando transportando mais de BSS com o embrião. Imediatamente a captação do agarose e embrião da depressão tampa e transfira para uma câmara de cultura de Petri. A placa de Petri 3,5 centímetros com uma janela de vidro no fundo é usado. Para geração de imagens usando um microscópio invertido, os embriões são viradas para baixo do corpo orientado e colocou perto da tampa de vidro. Para geração de imagens usando um microscópio na posição vertical, a espessura da agarose é minimizado. </li><li> Transferir a placa de Petri 3,5 centímetros em um prato de 14 centímetros de diâmetro Petri contendo gelo e água (água cheio até cerca de 1 / 3 da profundidade total de prato grande). Enquanto segura a câmara com firmeza na parte inferior da placa de Petri 14 centímetros, use um laço do cabelo suavemente para orientar o embrião como desejado na agarose derretida e mantenha o embrião até a agarose solidifica suavemente levantar e abaixar o prato menor para sua posição original na água gelada. </li></ol> 4. O transplante de células em embriões medaka O objetivo deste procedimento é determinar se o gene de interesse atos células autonomamente (dentro de uma célula) ou não de células-autônoma (entre as células). Células do doador podem ser rotulados com um corante como traçador rodamina-dextran antes do transplante (como descrito em &#39;microinjeção de embriões Medaka &quot;o protocolo JOVE de acompanhamento) ou uma cepa transgênica com a expressão GFP pode ser utilizada, permitindo avaliação de transplante. Uma combinação de duas técnicas de rotulagem é frequentemente útil para superar auto-fluorescência, que pode ser encontrado. Por lapso de tempo de estudos após o transplante, a expressão GFP é particularmente útil. Use uma pipeta de vidro de boca larga com uma pipeta bomba de todo este procedimento e esterilizar todos os instrumentos (incluindo slides) de antemão com EtOH 70% seguido de enxaguamento com estéril 1X BSS. Embriões destinatário são normalmente desenvolvidas para cerca de estágio 12 como o que permite a discriminação dos pólos ventral e dorsal ao realizar o transplante. <ol><li> Início dechorionating embriões 1,5 horas antes do transplante e aparelhos de injeção de instalação durante as incubações enzima. </li><li> Coloque uma lâmina de microscópio cavidade em um prato de nove centímetros de diâmetro Petri. </li&gt; <li> Adicionar uma pequena quantidade de metilcelulose de 3% para o centro do slide cavidade usando uma ponteira de pipeta estéril e espalhada pouco. </li><li> Metilcelulose secar por cerca de 1-2 minutos. </li><li> Adicionar 350μl de 1X estéril BSS para preencher a depressão slide. </li><li> Transferência de um embrião doador e até quatro embriões destinatário para o slide com uma pipeta de vidro. </li><li> Embriões orientar usando um loop para que o cabelo blastoderma do embrião é voltado para cima. Embriões podem ser inclinou-se uns contra os outros para aumentar a estabilidade adicional. </li><li> Insira cuidadosamente o micro-agulha em blastoderma doador e, lentamente, a captação 10-20 células. </li><li> Suavemente inserir a agulha em área necessária de blastoderma embrião destinatário e expelir as células lentamente. Grande cuidado deve ser tomado quando da inserção de células no blastoderma destinatário de forma a não perturbar a célula-yolk sac fronteira como isso irá resultar em morte do embrião. </li><li> Despeje esterilizados 1X BSS em placa de Petri. Com cuidado, despeje o BSS no prato o mais próximo possível do lado do prato possível, de modo a não perturbar os embriões. Nunca despeje o BSS diretamente sobre os embriões e adicione BSS suficiente para que o slide e embriões são imersos. </li><li> Adicionar 100μl de penicilina estreptomicina / para o prato e cubra. Transferir cuidadosamente para um prato de 27 ° C incubadora para permitir o desenvolvimento normal. </li><li> Embriões podem ser observados periodicamente, conforme desejado. Ao usar o transplante para a realização de ganho de função e / ou experiências de resgate fenótipo, algumas mudanças morfológicas observadas podem ser devido aos efeitos do transplante. Assim transplantes múltiplos são necessários. Depois de 2-3 dias, melanóforos devem estar presentes no saco vitelino, cabeça, olhos e tronco. Se presente em embriões transplantados em seguida, uma quimera sucesso foi provavelmente produzido (Figura 3). </li></ol> Se necessário, embrião doador genótipo (s), transferindo a PCR tubo (s) contendo 25μl de proteinase K. 20mg/ml Incubar a 55 ° C por 4 horas seguido por 10 minutos a 94 ° C e realizar PCR. 5. Resultados representativos <img src="/files/ftp_upload/2055/2055fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Posição Exemplo de um embrião agarose-embedded. Anterior é mostrado à direita e vista é dorsal. Painel B: células endoteliais pode ser visto em ambos os lados do corpo do embrião e são rotulados com GFP conduzido pelo promotor fli. <img src="/files/ftp_upload/2055/2055fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Imagens de pós-transplante de embriões. A imagem mostra um embrião de doador e receptor imediato pós-transplante. O embrião doador é mostrado à direita com uma blastoderma completamente vermelho (seta). O embrião destinatário é mostrado do lado esquerdo e é facilmente identificado pela pequena massa de células transplantadas vermelho visível no blastoderma (seta). Imagem B mostra dois embriões destinatário aproximadamente 7 horas pós-transplante (incubados a 27 ° C). Observe as células transplantadas migraram do local de transplante e estão agora dispersos por todo o blastoderma (setas). Imagem C mostra um embrião destinatário, E-29 (aproximadamente 74hpf). Observe a pigmentação no olho ea presença de melanóforos na região do tronco e cérebro (setas). As células-rodamina rotulado pode ser visto para ser colonizar muitas das estruturas embrionárias indicando o sucesso da produção de uma quimera.

<ol>
	<li>Furutani-Seiki, M., Sasado, T., Morinaga, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+genome-wide+screen+for+mutations+affecting+organogenesis+in+Medaka,+Oryzias+latipes.">A systematic genome-wide screen for mutations affecting organogenesis in Medaka, Oryzias latipes.</a> Mech Dev. 121, 647-658 (2004).</li><li>Furutani-Seiki, M., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medaka+and+zebrafish,+an+evolutionary+twin+study.">Medaka and zebrafish, an evolutionary twin study.</a> Mech Dev. 121, 629-6237 (2004).</li><li>Hirose, Y., Varga, Z. M., Kondoh, H., Furutani-Seiki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+lineage+and+regionalization+of+cell+populations+during+Medaka+neurulation.">Single cell lineage and regionalization of cell populations during Medaka neurulation.</a> Development. 131, 2553-2563 (2004).</li><li>Iwamatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+normal+development+in+the+medaka+Oryzias+latipes.">Stages of normal development in the medaka Oryzias latipes.</a> Zool Sci. 11, 825-839 (1994).</li><li>Cope, J., Fluck, R., Nicklas, L., Plumhoff, L. A., Sincock, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stellate+layer+and+rhythmic+contractions+of+the+Oryzias+latipes+embryo.">The stellate layer and rhythmic contractions of the Oryzias latipes embryo.</a> J Exp Zool. 254, 270-275 (1990).</li><li>Brend, T., Holley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+Whole+Mount+High-Resolution+Double+Fluorescent+In+Situ+Hybridization.">Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization.</a> J Vis Exp. , (2009).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Neste vídeo demonstramos como dechorionate e realizar transplanataion celular em embriões medaka. Esta é uma técnica poderosa para a produção de embriões quiméricos para o estudo do gene / proteína de função durante o desenvolvimento, bem como para elucidar a autonomia do gene / proteína em questão. Medaka são um sistema modelo útil vertebrados para esta técnica, devido aos mapas destino bem estabelecida e seus empréstimos a transparência los bem na imagem em tempo real, vivo. O transplante pode ser combinado com microinjeção (como descrito em &#39;microinjeção de embriões Medaka &quot;o protocolo JOVE de acompanhamento) de modo que o comportamento das células transplantadas podem ser facilmente observadas.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Embryo medium</td>
<td>Reagent</td>
<td>Made in-house</td>
<td>N/A</td>
<td>200ml 50X stock solution, 1ml 1%methyleneblue in H2O/10 liter RO water (50X stock solution: NaCl 14.7g, KCl 0.6g, CaCl2 2H2O 2.4g, MgSO4 7H2O 4.0g/1 litre RO water.)</td>
</tr>
<tr>
<td>Micro-dissecting forceps</td>
<td>Tools</td>
<td>55 INOX A.DUMONT&amp;FILS</td>
<td>N/A</td>
<td>Very sharp fine tips for removal of chorion.</td>
</tr>
<tr>
<td>Fine waterproof sandpaper - p2000 grit size</td>
<td>Tools</td>
<td>Hermes Abrasives Ltd.</td>
<td>N/A</td>
<td>Very fine grit size for rolling/cleaning embryos with chorions.</td>
</tr>
<tr>
<td>3% methylcellulose</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>M 0512</td>
<td>High viscosity for holding embryos in place during transplantation.</td>
</tr>
<tr>
<td>1X BSS</td>
<td>Reagent</td>
<td>Made in-house</td>
<td>N/A</td>
<td>20XBSS: 130g NaCl, 8g KCl, 4g MgSO4.7H2O, 4g CaCl2.2H2O, and 10mg Phenol Red in 1L MilliQ water and autoclave; 500mM Hepes in MilliQ water autoclaved. Add 25ml 20XBSS and 15ml 500ml Hepes pH7.0, fill up to 500ml and filter sterilize before use.</td>
</tr>
<tr>
<td>Penicillin-streptomycin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco</td>
<td>15140-122</td>
<td>Added to BSS when incubating dechorionated embryos.</td>
</tr>
<tr>
<td>Pronase</td>
<td>Reagent</td>
<td>Calbiochem</td>
<td>53702</td>
<td>For dechorionation.</td>
</tr>
<tr>
<td>Hatching enzyme</td>
<td>Reagent</td>
<td>Made in-house</td>
<td>N/A</td>
<td>For dechorionation.</td>
</tr>
<tr>
<td>Tricaine mesilate (TMS)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>A-5040</td>
<td>400mg tricaine in 97.9ml distilled water and 2.1ml 1M Tris, pH adjusted to 7; 4.2ml of this solution in 100ml clean tank water.</td>
</tr>
<tr>
<td>3% ultra-low gelling temp. agarose</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>A-2576</td>
<td>Type IX-A. Used during embedding of embryos for observation.</td>
</tr>
<tr>
<td>Petri dish culture chamber</td>
<td>Tool</td>
<td>Iwaki, Asahi Techno Glass Corp.</td>
<td>11-004-008</td>
<td>Iwaki glass base dish 35mm with 12mm window. Used during embedding of embryos for observation.</td>
</tr>
<tr>
<td>Micromanipulator</td>
<td>Equipment</td>
<td>Narishige</td>
<td>N/A</td>
<td>Model MN151. For removal and insertion of cells during transplantation.</td>
</tr>
<tr>
<td>Borosilicate glass capillaries</td>
<td>Tool</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>GC100-10T</td>
<td>For making transplantation needles.</td>
</tr>
<tr>
<td>Flaming/Brown micropipette puller</td>
<td>Equipment</td>
<td>Sutter Instrument Co.</td>
<td>Model P-97 </td>
<td>For making transplantation needles.</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

dechorionation of medaka embryos and cell transplantation for the generation of chimeras

Medaka é um pequeno peixe de água doce do egg-laying que permite que ambas as análises genéticas e embriológicas e é um dos três organismos modelo vertebrados em que genome-wide-driven fenótipo mutante telas foram realizadas 1. Divergência de sobreposição funcional de genes relacionados entre medaka zebrafish e permite a identificação de fenótipos romance que não são identificáveis ​​em uma única espécie 2, assim medaka e peixe-zebra são complementares para a análise genética das funções genoma dos vertebrados. Manipulação de embriões medaka, como dechorionation, embriões de montagem para a imagem latente e transplante de células, são procedimentos essenciais para o trabalho em ambos os medaka zebrafish e em um laboratório. Transplante de células analisa autonomia de células de mutações medaka. Quimeras são gerados através do transplante de células marcadas a partir de embriões de doadores em embriões destinatário sem rótulo. Células do doador podem ser transplantadas para áreas específicas dos embriões destinatário com base no destino mapas 3 para que clones de células transplantadas podem ser integrados no tecido de interesse durante o desenvolvimento. Devido ao córion duro e macio embriões, manipulação de embriões medaka está mais envolvido do que em zebrafish. Neste vídeo, vamos mostrar os procedimentos detalhados para manipular embriões medaka.

Watch this Scientific Journal Video about Dechorionation of Medaka Embryos and Cell Transplantation for the Generation of Chimeras at JoVE.com

Dechorionation of Medaka Embryos and Cell Transplantation for the Generation of Chimeras

Devido ao córion duro e macio embriões, manipulação de embriões medaka está mais envolvido do que em zebrafish. Este vídeo mostra passo-a-passo os procedimentos de como manipular embriões medaka, incluindo dechorionation, montagem em agarose para a imagem latente e transplante de células para a produção de quimeras. Estes procedimentos são essenciais para a utilização medaka zebrafish e em um laboratório para tirar o máximo proveito de seus recursos complementares para a análise genética de funções genoma dos vertebrados.

Dechorionation de Embriões Medaka e Transplante de Células de Geração de Quimeras

Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the three vertebrate model organisms in ...

dechorionation-medaka-embryos-cell-transplantation-for-generation

Research

JoVE Journal

Biology

17.6K visualizações.  University of Bath. Devido ao córion duro e macio embriões, manipulação de embriões medaka está mais envolvido do que em zebrafish. Este vídeo mostra passo-a-passo os procedimentos de como manipular embriões medaka, incluindo dechorionation, montagem em agarose para a imagem latente e transplante de células para a produção de quimeras. Estes procedimentos são essenciais para a utilização medaka zebrafish e em um laboratório para tirar o máximo proveito de seus recursos comple...

Vídeo: Dechorionation of Medaka Embryos and Cell Transplantation for the Generation of Chimeras

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

Isolamento e Transplante de Células-Tronco Hematopoéticas (HSCs)

Biologia

Dissection of 6.5 dpc Mouse Embryos

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell interaction and signaling mechanisms that guide embryonic patterning. However, dissection of the mouse embryo from the decidua shortly after implantation can be a challenging procedure, and detailed step-by-step documentation of this process is lacking.

Here we demonstrate how post-implantation (6.5 dpc) embryos are isolated by first dissecting the uterus of a pregnant mouse (detection of the vaginal plug was designated day 0.5 poist coitum) and subsequently dissecting the embryo from maternal decidua. The dissection of Reichert's membrane is described as well as the removal of the ectoplacental cone.

Isolation of postimplantation-stage embryos allows one to study gene patterning and analyze cell-lineage decision making processes during embryonic development, but proper dissection of the early embryo can be challenging. This protocol describes a method for isolating early primitive-streak-stage embryos (~6.5 days post coitum [dpc]).

Dissecção de 6,5 embriões de camundongos dpc

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell ...

Tracheotomy: A Method for Transplantation of Stem Cells to the Lung

Lung disease is a leading cause of death and likely to become an epidemic given increases in pollution and smoking worldwide. Advances in stem cell therapy may alleviate many of the symptoms associated with lung disease and induce alveolar repair in adults. Concurrent with the ongoing search for stem cells applicable for human treatment, precise delivery and homing (to the site of disease) must be reassured for successful therapy. Here, I report that stem cells can safely be instilled via the trachea opening a non-stop route to the lung. This method involves a skin incision, caudal insertion of a cannula into and along the tracheal lumen, and injection of a stem cell vehicle mixture into airways of the lung. A broad range of media solutions and stabilizers can be instilled via tracheotomy, resulting in the ability to deliver a wider range of cell types. With alveolar epithelium confining these cells to the lumen, lung expansion and negative pressure during inhalation may also assist in stem cell integration. Tracheal delivery of stem cells, with a quick uptake and the ability to handle a large range of treatments, could accelerate the development of cell-based therapies, opening new avenues for treatment of lung disease.

Significant breakthroughs in stem cell identification are continuously being made. To translate these discoveries, however, novel methods for cellular delivery must be devised. Here I report that the airways provide a safe route for stem cell transplantation to the lungs.

Traqueotomia: Um Método para Transplante de Células-Tronco para o pulmão

Lung disease is a leading cause of death and likely to become an epidemic given increases in pollution and smoking worldwide. Advances in stem cell ...

Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

Plastic sections maintain true tissue morphology in thin sections of tissue that can be immunostained with fluorescent secondary antibodies, making this method more useful than paraffin-embedded or frozen sections for many types of tissue. The method for staining, plastic embedding, and sectioning is demonstrated in this video.

Incorporação de plástico e secção de embriões Xenopus laevis

Generation of Human CD40-activated B cells

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer immunotherapy 1-3. Compared to Dendritic cells (DCs), the best characterized APC, CD40-B cells have several distinct biological and technical properties. Similar to DCs, B cells show an increased expression of MHC and co-stimulatory molecules (Fig.1b), exhibit a strong migratory capacity and present antigen presentation efficiently to T cells, after stimulation with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L). However, in contrast to immature or mature DCs, CD40-B cells express the full lymph node homing triad consisting of CD62L, CCR7/CXCR4, and leukocyte function antigen-1 (LFA1, CD11a/CD18), necessary for homing to secondary lymphoid organs (Fig.1a) 3. CD40-B cells can be generated without difficulties from very small amounts of peripheral blood which can be further expanded in vitro to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients (Fig.1c,d) 1,4. 
In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated CD40-B cells from human PBMC. Key molecules for the cell culture are CD40 ligand, interleukin-4 (IL-4) and cyclosporin A (CsA), which are replenished in a 3-4 day culture cycle. For laboratory purposes CD40-stimulation is provided by NIH/3T3 cells expressing recombinant human CD40 ligand (tCD40L NIH/3T3) 5. To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the human CD40 ligand on the transfectants has to be checked regularly (Fig.2). 
After 14 days CD40-B cell cultures consist of more than 95% pure B cells and an expansion of CD40-B cells over 65 days is frequently possible without any loss of function 1, 4. CD40-B cells efficiently take up, process and present antigens to T cells 6. They do not only prime na&#970;ve, but also expand memory T cells 7,8. CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation, differentiation and function. Moreover, they represent a promising tool for therapeutic or preventive vaccination against tumors 9.

In this video we present the ex vivo generation and expansion of human CD40-activated B cells (CD40-B) from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by stimulation with CD40 ligand and interleukin-4.

Geração de humanos CD40-activated células B

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

A criação de embriões quiméricos Zebrafish por Transplante

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups of cells in a larger context are altered.  Watching how one cell interacts with and behaves in a unique environment is essential to characterizing cell functions.  Determining how the localized misexpression of a specific protein influences surrounding cells provides insightful information on the roles that protein plays in a variety of developmental processes.  Our lab uses the zebrafish model system to uniquely combine genetic approaches with classical transplantation techniques to generate genotypic or phenotypic chimeras.  We study neuron-glial cell interactions during the formation of forebrain commissures in zebrafish. This video describes a method that allows our lab to investigate the role of astroglial populations in the diencephalon and the roles of specific guidance cues that influence projecting axons as they cross the midline. Due to their transparency zebrafish embryos are ideal models for this type of ectopic cell placement or localized gene misexpression. Tracking transplanted cells can be accomplished using a vital dye or a transgenic fish line expressing a fluorescent protein. We demonstrate here how to prepare donor embryos with a vital dye tracer for transplantation, as well as how to extract and transplant cells from one gastrula staged embryo to another.  We present data showing ectopic GFP+ transgenic cells within the forebrain of zebrafish embryos and characterize the location of these cells with respect to forebrain commissures.  In addition, we show laser scanning confocal timelapse microscopy of Alexa 594 labeled cells transplanted into a GFP+ transgenic host embryo.  These data provide evidence that gastrula staged transplantation enables the targeted positioning of ectopic cells to address a variety of questions in Developmental Biology.

Zebrafish cell transplantation enables the combination of genetics and embryology to generate tissue specific chimeras. This video demonstrates gastrula staged cell transplantations that have allowed our lab to investigate the roles of astroglial populations and specific guidance cues during commissure formation in the forebrain.

Tecido alvo quimeras embrionárias: Zebrafish celular Gástrula Transplante

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

Preparação de embriões de Microscopia Eletrônica do Drosophila Tubo cardíaco embrionário

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their environment. Chimeric embryos, which are composed of cells of different genetic background, are great tools to study the cell-cell interactions mediated by genes of interest. The embryonic transparency of zebrafish at early developmental stages permits direct visualization of the morphogenesis of tissues and organs at the cellular level. Here, we demonstrate a protocol to generate chimeric retinas and brains in zebrafish embryos and to perform live imaging of the donor cells. The protocol covers the preparation of transplantation needles, the transplantation of GFP-expressing donor blastomeres to GFP-negative hosts, and the examination of donor cell behavior under live confocal microscopy. With slight modifications, this protocol can also be used to study the embryonic development of other tissues and organs in zebrafish. The advantages of using GFP to label donor cells are also discussed. 

We demonstrate a protocol to generate chimeric zebrafish embryos for live imaging cellular behavior during embryogenesis.

Transplante de GFP-expressando Blastômeros for Imaging ao vivo de Desenvolvimento da retina e do cérebro em embriões Zebrafish Quimérico

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1, as in zebrafish and the mouse. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions.
To take advantage of medaka fish whose embryos are transparent and develop externally, microinjection is an essential technique to inject cell-tracers for labeling cells, mRNAs or anti-sense oligonucleotides for over-expressing and knocking-down genes of interest, and DNAs for making transgenic lines.

Medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions. This protocol highlights the key points for successful microinjection into medaka embryos, an important technique for embryological and genetic analysis using medaka and zebrafish in a laboratory.

Microinjeção de embriões Medaka para uso como um organismo modelo genético

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows ...