Este trabalho foi financiado por uma doação do MRC.

1. Acasalamento e coleta de ovos <ol><li> Medaka feminino e masculino podem ser facilmente distinguidas pelo tamanho e forma das barbatanas dorsal e anal. As barbatanas anal dos machos são maiores e em forma de paralelogramo comparada com a das fêmeas. A barbatana anal do sexo feminino é menor e em forma triangular. A barbatana dorsal do sexo masculino tem um entalhe claramente visível profunda entre os dois últimos raios. </li><li> Medaka colocar até 40 ovos todos os dias e as fêmeas carregam os ovos medaka agrupado em sua barriga por filamentos de ligação para várias horas antes de serem arrancados de plantas no tanque. </li><li> Fêmeas pode ser pego em uma rede mantido dentro suavemente de ambos os lados por um lado. Os ovos podem ser suavemente arreliado da barriga com o dedo indicador da outra mão. A fêmea pode então ser devolvido ao tanque. Os ovos devem ser transferidos para uma placa de Petri 6 centímetros cheia de mídia embrião por fórceps sem corte ou um dedo. </li><li> Pares Medaka raramente luta quando eles são mantidos em uma caixa pequena de acasalamento. Portanto, eles podem ser mantidos em um pequeno tanque com fluxo de água para que possam ser alimentados e os ovos podem ser coletados a partir do mesmo par todos os dias por um par de meses. </li><li> É importante que os peixes fêmeas não devem ser mantidos sem machos, uma vez que a ovulação ocorre todos os dias em medaka fêmeas. Caso contrário, as fêmeas não podem entregar os ovos e tornar-se indisposto. </li></ol> 2. Embriões de limpeza <ol><li> Transferência unclustered ovos com uma pipeta de vidro a lixa (P2000 tamanho do grão, à prova d&#39;água) colocado na tampa de uma placa de Petri nove centímetros. Remova o meio de excesso, mas garantir um volume suficiente permanece como para evitar a secagem de embriões. </li><li> Rolo delicadamente sobre embriões lixa usando o dedo indicador, aplicando o mínimo de pressão e manter paralelo dedo para a superfície do papel de areia por cerca de 45-60 segundos para remover alguns dos cabelos superfície externa do córion. Não enrole mais de embriões 07/05 de uma vez esta precaução irá minimizar o risco de esmagamento embriões um embaixo do outro. </li><li> Transferência de embriões limpo para um prato fresco de meio de embrião. </li></ol> 3. Fazer placas de agarose para a realização de embriões durante a microinjeção Embriões são mantidos em bebedouros durante a injeção feita com um molde de acrílico em agarose 1,5% (Figura 1). A concentração de agarose é importante para manter os embriões corretamente. <ol><li> Primeiro, faça um quadro de agarose para segurar o molde de acrílico. Despeje de agarose 1,5% em água a uma profundidade 0,5 cm em uma placa de Petri nove centímetros e espere até que ele se solidifica completamente. Cortar uma área da agarose apenas maior que o tamanho do molde. </li><li> Despeje de agarose 1,5% para preencher a área de corte e coloque o molde para que não haja bolhas e espere até que agarose solidifica. Esta placa de agarose podem ser armazenados na geladeira para acelerar solidifaction. </li><li> Remover o molde para criar calhas para segurar os ovos. Adicionar médio embrião o suficiente para mergulhar o molde, cubra e armazenar a 4 ° C até ser necessário. <img src="/files/ftp_upload/1937/1937fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Esquemática do molde feito sob medida usada para preparar as calhas em placas de agarose para microinjeção. </li></ol> 4. Microinjeção de embriões medaka Em medaka, DNA, RNA, oligonucleotides morfolino e corantes traçador são microinjeção através do córion para o citoplasma da 1-64 de células de embriões, em vez de estágio a gema como em zebrafish. Uma vez que o citoplasma é menor e menos visível na medaka, a prática pela injeção de corantes como rodamina-dextran é recomendado para desenvolver esta habilidade. Além do vermelho de fenol como traçador também é estimulada para permitir a confirmação das injeções. Como o córion torno embriões medaka é dura, um short, agulha de injeção forte e ampla é necessária (Figura 2). Prepare esta agulha de injeção forte de largura a partir de um filamento de vidro contendo-capilar. <ol><li> Preparar a solução de injeção com vermelho de fenol como traçador e carregá-lo para dentro da agulha na parte de trás com um microloader Eppendorf. Conecte a agulha para a bomba de ar do injetor. </li><li> Os ovos devem ser recolhidos e unclustered o mais rapidamente possível após a fertilização para injetar na fase de uma célula. Mais embriões podem ser injetadas, armazenando-os em gelo (não mais de 30 minutos) para interromper a divisão celular. <img src="/files/ftp_upload/1937/1937fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Comparação de agulhas e medaka zebrafish. Observe a ponta da agulha MF (em cima) é mais curto e mais largo, portanto, mais forte para a perfuração do córion dura em torno de embriões medaka. </li><li> Transferência de ovos na placa de agarose e alinhá-las nos bebedouros com uma pinça. Imediatamente antes da injecção, cinco ovos, devem ser mudados para que a membrana da célula do citoplasma de uma célula pode ser atingido por diaagulha e perpendicularmente. O citoplasma da célula de um pode ser encontrado por olhar para uma área desprovida de pequenas gotículas de óleo que fica em frente ao lado do ovo com gotas de óleo mais denso. A área identificada pode ser confirmado para ser o citoplasma através da visualização de lado. </li><li> Coloque a agulha para fechar os ovos. Abra a ponta da agulha suavemente tocar a ponta da agulha para o córion ou usando micropinças (Figura 3). Uma pequena quantidade de substância injecção deve ser visto a fluir para fora. </li><li> Punção através do córion para colocar a ponta da agulha no interior do córion. Ajuste a pressão de realização do injector a ser relativamente alto, para garantir que nenhum refluxo ocorre devido à alta pressão sobre punção através do córion resistente (configurações de 80-100hPA para exploração e pressão de 500 700hPa para a pressão de injeção). </li><li> Insira a ponta da agulha para o citoplasma acentuadamente por cutucando sua membrana. Evite inserir a ponta da agulha na gema. Ao contrário de peixe-zebra, material injetado na gema não será transferido para o citoplasma. Líquidos injetados tem um limite diferente quando injetado na gema enquanto que o limite é turva quando no citoplasma (Figura 4). Ocasionalmente, a agulha pode ficar bloqueado por agarose / detritos. Fórceps pode ser usado para tocar / quebrar novamente a ponta da agulha e remova o bloqueio. Se a agulha quebra em qualquer ponto durante a injeção, borbulhando será visto no meio de embrião e que a substância está a injectar será perdido. As injeções devem ser realizadas sistematicamente de cima para baixo ao longo dos canais agarose e da esquerda para a direita através do molde. </li><li> Embriões injetados devem ser transferidos para um prato limpo contendo meio de embrião e desenvolvido na temperatura adequada. <img src="/files/ftp_upload/1937/1937fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Quebrar a ponta da agulha antes da injeção. 1: Mova a ponta da agulha perto do córion do embrião; 2: Toque no córion e mover a agulha para trás e para frente com cuidado para quebrar ponta; 3: Quando uma pequena quantidade de substância de injeção flui para fora da extremidade da agulha isto confirma a quebra da ponta. </li></ol> 5. Resultados representativos <img src="/files/ftp_upload/1937/1937fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Imagens representativas de embriões injetados medaka. Um painel mostra uma imagem representativa da injeção correta de rodamina-dextran no citoplasma de uma célula embrionária de um estágio medaka. Painel B mostra uma imagem representativa de injeção incorreta de rodamina-dextran no saco vitelino de uma célula do embrião estágio medaka. Painéis C e D mostram os embriões a partir de painéis A e B, respectivamente, cerca de 30 horas após a injecção. EM: embrião, anterior é para cima em painéis C e D e vista é dorsal. Observe o corpo do embrião no painel D não é vermelho como o corante foi incorretamente injetado no saco vitelino. Setas em B e D indicam rodamina-dextran injetado incorretamente no saco vitelino observe o limite distintos circular. Linhas pontilhadas em A e B indicam esboço do citoplasma de uma célula, visão é lateral.

<ol>
	<li>Furutani-Seiki, M., Sasado, T., Morinaga, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+genome-wide+screen+for+mutations+affecting+organogenesis+in+Medaka,+Oryzias+latipes.">A systematic genome-wide screen for mutations affecting organogenesis in Medaka, Oryzias latipes.</a> Mech Dev. 121, 647-658 (2004).</li><li>Furutani-Seiki, M., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medaka+and+zebrafish,+an+evolutionary+twin+study.">Medaka and zebrafish, an evolutionary twin study.</a> Mech. Dev. 121, 629-6237 (2004).</li></ol>

Neste vídeo, demonstramos um método para rastreamento de células, mRNA, ou DNA anti-senso de injeção de oligonucleotídeos em uma célula de embriões estágio medaka. Esta técnica permitiu-nos para estudar vários processos de desenvolvimento in vivo, em tempo real. Este processo e posterior análise detalhada que proporciona tem o potencial de aumentar significativamente a nossa compreensão da organogênese vertebrados e da biologia da célula subjacente. Tal conhecimento pode ser importante para, e rendimento de aplicações terapêuticas na medicina regenerativa.

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>4" fine net</td>
<td>Tools</td>
<td>J &amp; K Aquatics Ltd.</td>
<td>MD001</td>
<td>Used to capture fish during egg harvesting.</td>
</tr>
<tr>
<td>Embryo medium</td>
<td>Reagent</td>
<td>Made in-house</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>200ml 50X stock solution, 1ml 1%methyleneblue in H2O/10 liter RO water (50X stock solution: NaCl 14.7g, KCl 0.6g, CaCl2 2H2O 2.4g, MgSO4 7H2O 4.0g/1 litre RO water.</td>
</tr>
<tr>
<td>Fine waterproof sandpaper - p2000 grit size </td>
<td>Tools</td>
<td>Hermes Abrasives Ltd.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Very fine grit size for rolling/cleaning embryos with chorions.</td>
</tr>
<tr>
<td>Borosilicate glass capillaries</td>
<td>Tool</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>GC100-10F</td>
<td>For making microinjection needles.</td>
</tr>
<tr>
<td>Micropipette puller</td>
<td>Equipment</td>
<td>Narishige scientific instrument lab</td>
<td>Model PP-830</td>
<td>For making microinjection needles.</td>
</tr>
<tr>
<td>Eppendorf microloader</td>
<td>Tool</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5242956.003</td>
<td>For loading microinjection needles.</td>
</tr>
<tr>
<td>Microinjector apparatus </td>
<td>Equipment</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Model 5242.</td>
</tr>
<tr>
<td>Micromanipulator</td>
<td>Equipment</td>
<td>Narishige</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Model MN151.</td>
</tr>
<tr>
<td>Agarose injection plate</td>
<td>Tools</td>
<td>Made in-house</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>For holding embryos during injection.</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

microinjection of medaka embryos for use as a model genetic organism

Neste vídeo, demonstramos a técnica da microinjeção em embriões de uma célula estágio medaka. Medaka é um pequeno peixe de água doce do egg-laying que permite que ambas as análises genéticas e embriológicas e é um dos organismos modelo de vertebrados em que genome-wide-driven fenótipo mutante telas foram realizadas 1, como no peixe-zebra eo mouse. Divergência de sobreposição funcional de genes relacionados entre medaka zebrafish e permite a identificação de fenótipos romance que não são identificáveis ​​em uma única espécie 2, assim medaka e peixe-zebra são complementares para análise genética de funções genoma dos vertebrados. Para aproveitar medaka peixes cujos embriões são transparentes e desenvolver externamente, microinjeção é uma técnica essencial para injetar células-traçadores para as células rotulagem, mRNAs ou sentido anti-oligonucleotides para o excesso de expressar e batendo-down genes de interesse, e para a tomada de DNAs linhagens transgênicas.

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Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

Medaka e peixe-zebra são complementares para análise genética de funções genoma dos vertebrados. Este protocolo destaca os pontos chave para a microinjeção de sucesso em embriões medaka, uma técnica importante para a análise embriológica e genética utilizando medaka zebrafish e em um laboratório.

Microinjeção de embriões Medaka para uso como um organismo modelo genético

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows ...

microinjection-of-medaka-embryos-for-use-as-a-model-genetic-organism

Research

JoVE Journal

Biology

25.4K visualizações.  University of Bath. Medaka e peixe-zebra são complementares para análise genética de funções genoma dos vertebrados. Este protocolo destaca os pontos chave para a microinjeção de sucesso em embriões medaka, uma técnica importante para a análise embriológica e genética utilizando medaka zebrafish e em um laboratório.

Vídeo: Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

Vibrio cholerae: Model Organism to Study Bacterial Pathogenesis - Interview

Vibrio cholerae: organismo modelo para estudar Patogênese Bacteriana - Entrevista

Biologia

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever.  The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever. The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

Microinjeção de embriões A. aegypti obter mosquitos transgênicos

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Método para a Cultura de Embriões início pintainho ex vivo (Nova Cultura)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Monte Whole dupla hibridização in situ de embriões de galinha precoce

Use of Rotorod as a Method for the Qualitative Analysis of Walking in Rat

High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a rotorod, animals remain in approximately the same place making repetitive movements of stepping. Thus the task provides a rich source of information on the details of foot stepping movements. Subjects were hemi-Parkinson analogue rats, produced by injection of 6-hydroxydopamine (6-OHDA) into the right nigrostriatal bundle to deplete nigrostriatal dopamine (DA). The present report provides a video analysis illustration of animals previously were filmed from frontal, lateral, and posterior views as they walked (15). Rating scales and frame-by-frame replay of the video records of stepping behavior indicated that the hemi-Parkinson rats were chronically impaired in posture and limb use contralateral to the DA-depletion. The contralateral limbs participated less in initiating and sustaining propulsion than the ipsilateral limbs. These deficits secondary to unilateral DA-depletion show that the rotorod provides a use task for the analysis of stepping movements.

The rotorod test is used to assess motor status in the walking movement of hemi-Parkinson analogue rats.

Uso de Rotorod como um método de análise qualitativa de Walking in Rat

High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a ...

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Microinjeção de mRNA e Oligonucleotídeos Anti-Senso Morpholino em embriões Zebrafish.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Microinjeção de embriões Zebrafish para analisar a função do gene

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers. Genetic studies in mammalian systems have been limited due to the lack of readily available tools including defined mutant genetic cell lines, regulatory expression systems, and appropriate selectable markers. To circumvent these difficulties, model genetic systems in lower eukaryotes have become an attractive choice for the study of functionally conserved DNA repair proteins and pathways. We have developed a model yeast system to study the poorly defined genetic functions of the Werner syndrome helicase-nuclease (WRN) in nucleic acid metabolism. Cellular phenotypes associated with defined genetic mutant backgrounds can be investigated to clarify the cellular and molecular functions of WRN through its catalytic activities and protein interactions. The human WRN gene and associated variants, cloned into DNA plasmids for expression in yeast, can be placed under the control of a regulatory plasmid element. The expression construct can then be transformed into the appropriate yeast mutant background, and genetic function assayed by a variety of methodologies. Using this approach, we determined that WRN, like its related RecQ family members BLM and Sgs1, operates in a Top3-dependent pathway that is likely to be important for genomic stability. This is described in our recent publication [1] at <a href="http://www.impactaging.com">www.impactaging.com</a>. Detailed methods of specific assays for genetic complementation studies in yeast are provided in this paper.

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System

Genetic studies in yeast can be employed to investigate the molecular and cellular functions of human genes in cellular DNA metabolism. Methods are described for the genetic characterization of the human WRN gene product defective in the premature aging disorder Werner syndrome in functionally conserved pathways using yeast as a tractable model system.

Estudos genéticos de proteínas de reparo do DNA Humano Utilizando Levedura como um sistema modelo

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

Dechorionation of Medaka Embryos and Cell Transplantation for the Generation of Chimeras

Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the three vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of the vertebrate genome functions. Manipulation of medaka embryos, such as dechorionation, mounting embryos for imaging and cell transplantation, are key procedures to work on both medaka and zebrafish in a laboratory. Cell transplantation examines cell autonomy of medaka mutations. Chimeras are generated by transplanting labeled cells from donor embryos into unlabeled recipient embryos. Donor cells can be transplanted to specific areas of the recipient embryos based on the fate maps 3 so that clones from transplanted cells can be integrated in the tissue of interest during development. Due to the hard chorion and soft embryos, manipulation of medaka embryos is more involved than in zebrafish. In this video, we show detailed procedures to manipulate medaka embryos.

Due to the hard chorion and soft embryos, manipulation of medaka embryos is more involved than in zebrafish. This video shows step-by-step procedures for how to manipulate medaka embryos, including dechorionation, mounting in agarose for imaging and cell transplantation for the production of chimeras. These procedures are essential to use medaka and zebrafish in a laboratory to take full advantage of their complementary features for the genetic dissection of vertebrate genome functions.

Dechorionation de Embriões Medaka e Transplante de Células de Geração de Quimeras

Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the three vertebrate model organisms in ...

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages as well as by the availability of genetic mutants and transgenic strains expressing a myriad of fusion proteins1-4. In addition, dynamic processes such as cell division can be viewed using fluorescently labeled reporter proteins. The study of mitosis can be facilitated through the use of time-lapse experiments in various systems including intact organisms; thus the early C. elegans embryo is well suited for this study. Presented here is a technique by which in vivo imaging of sub-cellular structures in response to anoxic (99.999% N2; &lt;2 ppm O2) stress is possible using a simple gas flow through setup on a high-powered microscope. A microincubation chamber is used in conjunction with nitrogen gas flow through and a spinning disc confocal microscope to create a controlled environment in which animals can be imaged in vivo. Using GFP-tagged gamma tubulin and histone, the dynamics and arrest of cell division can be monitored before, during and after exposure to an oxygen-deprived environment. The results of this technique are high resolution, detailed videos and images of cellular structures within blastomeres of embryos exposed to oxygen deprivation.

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Described here is an in vivo technique to image sub-cellular structures in animals exposed to anoxia using a gas flow through microincubation chamber in conjunction with a spinning disc confocal microscope. This method is straightforward and flexible enough to suit a variety of experimental parameters and model systems.

Uso de Microscopia Time Lapse para Visualize Anoxia induzida Suspended Animation em<em&gt; C. elegans</em&gt; Embriões

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages ...