A técnica permite estudar a função e a gama de moléculas de sinalização durante a embriogênese transplantando fontes de sinalização ectópica. Também facilita a geração eficiente de mutantes germinos. O protocolo pode ser aplicado aos embriões de zebrafish e medaka em estágio blastula, e provavelmente também a outros estágios embrionários e espécies de TDO.
Para montar o dispositivo de transplante, conecte uma ponta de isca de 25 microliter gás de seringa apertada a um suporte de micro pipeta usando o encaixe da trava de isca. Em seguida, monte o dispositivo diretamente em um micro manipulador manual. Para usar o dispositivo de transplante, coloque o micro manipulador com o dispositivo montado ao lado de um microscópio estéreo.
Em seguida, remova o êmbolo e insira a agulha de transplante. Abaixe a agulha em um prato cheio com a solução de Ringer em um ângulo de 45 graus até que a ponta da agulha esteja imersa. Insira o êmbolo aproximadamente a meio caminho para eliminar as soluções do Ringer, deixando apenas um pequeno volume de água na parte fina e afilada da agulha.
Ao usar uma agulha de transplante pela primeira vez, cubra o interior da agulha, elaborando jugo de um embrião sacrificado e expulsando completamente o material do jugo. Em seguida, usando uma agulha de transplante, posicione suavemente o embrião doador, em seguida, posicione a agulha abrindo ortogonal à superfície do embrião e puxe cuidadosamente o êmbolo para atrair as células para dentro da agulha. Uma vez que o número desejado de células é atraído, pare a sucção empurrando suavemente o êmbolo para baixo e remova a agulha do embrião empurrando a agulha para o lado em um movimento curto e rápido.
Deixe alguma solução ringer em ambos os lados da coluna celular restringindo as células à extremidade afilada da agulha. Limpe qualquer gema ou detritos celulares restantes movendo lentamente o êmbolo para cima e para baixo e lavando as células com a solução de Ringer. Em seguida, mova a antena de transplante com a mão não dominante para posicionar a agulha ortogonal à superfície do embrião hospedeiro.
Aplique uma leve pressão sobre o embrião apertando-o cuidadosamente contra as paredes. Em seguida, com um movimento rápido e afiado, fure a camada envolvente do embrião hospedeiro tomando cuidado para não arranhar a gema com a agulha. Uma vez que a agulha esteja dentro, empurre suavemente o êmbolo para extruir a coluna das células no embrião, e retraia lentamente a agulha simultaneamente.
Para o transplante de células germinativas, preencha uma antena de transplante com a solução de Ringer, depois transfira a esfera descorioada para dome stage embriões para o prato de transplante e posicione os embriões de hospedeiro e doador em colunas alternadas para transplantar as células de um embrião doador para seis embriões hospedeiros diferentes. Para realizar o transplante, oriente os embriões com margem para a agulha de transplante. Para transplante de germina, pegue as células de origem da margem e deposite-as no mesmo local no embrião hospedeiro.
Uma vez concluído o transplante, permita que o embrião se recupere na solução de Ringer por 30 minutos a uma hora. Em seguida, usando um microscópio estéreo de fluorescência, examine as células transplantadas. Em seguida, transfira os embriões para uma placa revestida de 24 poços Agarose com o meio de embrião agrupando todos os embriões hospedeiros que receberam células do mesmo doador para o mesmo poço.
Em seguida, incubar os embriões a 28 graus Celsius até o dia seguinte. Se necessário, transfira os embriões doadores para tiras pcr rotuladas para genotipagem. 30 horas após a fertilização, tela os embriões hospedeiros para transplantes germeinos bem sucedidos sob um microscópio estéreo fluorescência.
As células germinativas devem estar presentes no sulco acima da extensão da gema. Cresça a larva transplantada com sucesso para a idade adulta de acordo com as condições padrão de criação. Em transplantes bem sucedidos, o embrião parece normal e semelhante em forma e clareza de gema a embriões não transplantados sem grandes lágrimas no blastoderm.
Em contraste, se um embrião estiver visivelmente danificado durante o transplante, ele não se desenvolverá normalmente. Embora o dispositivo de transplante tenha sido usado principalmente em embriões de zebrafish em estágios de blastula, o transplante e extirpação celular também podem ser realizados em embriões desordenados do estágio blastula do peixe-arroz japonês medaka. No caso específico do transplante de germes, um bom transplante resulta em um embrião com uma longa coluna horizontal de células diretamente acima da margem da gema.
No entanto, o sucesso do procedimento só pode ser avaliado após 24 a 30 horas de fertilização quando as células germinativas são distintas em sua fluorescência de células somáticas. As células germinativas primordiais aparecerão como pequenas esferas fluorescentes na ranhura diretamente acima da extensão da gema. A presença dessas células germinativas no local correto indica transplante de germe bem sucedido.
Exemplos de transplantes mal sucedidos são mostrados aqui. No primeiro exemplo, embora as células germinativas tenham atingido o mesoderme gonadal, como o embrião hospedeiro é severamente deformado, ele não se desenvolverá normalmente. No segundo exemplo, as células fluorescentes só são detectadas fora da ranhura.
Essas células são células somáticas ou células germinativas que não migraram corretamente. E ambos os tipos de células não contribuirão para a linha de germes do embrião. É fundamental evitar danos às células transplantadas e ao embrião hospedeiro.
As células devem ser elaboradas lentamente, ser limpas de qualquer gema restante e ser inseridas cuidadosamente. Este método fornece uma maneira fácil de transplantar células em embriões de zebrafish, e será útil para gerar fontes ectópicas e mutantes germinos. A principal vantagem deste dispositivo, ele é de baixo custo, e é muito e usa.
