Este protocolo oferece um método de entrega de terapia genética a múltiplos tecidos oculares de forma segura, fácil e eficaz. Também é adaptável para injeções intraestromais e sub-retinianas em pequenos animais. A utilização da via de injeção subconjuntival é minimamente invasiva.
Representa menos riscos e é uma grande promessa para a entrega de AV para tratar múltiplas doenças oculares. Com mais de 1 bilhão de pessoas em todo o mundo sofrendo de deficiência visual, o uso de um método seguro e fácil para a administração de medicamentos oferece ampla aplicabilidade para o tratamento de muitas causas diferentes de cegueira. Os métodos de entrega de genes descritos neste protocolo são de particular interesse para aqueles que estão desenvolvendo potenciais estratégias de intervenção e praticando oftalmologistas, que eventualmente entregarão esses medicamentos aos pacientes.
O maior desafio para alguém que está realizando este protocolo pela primeira vez é provavelmente a inserção da agulha no conceito de espaço conjuntival. Para começar, monte o sistema de injeção colocando um microscópio estéreo e uma bomba de seringa em um gabinete de biossegurança. Em seguida, corte a tubulação de polietileno em um comprimento de aproximadamente 50 centímetros.
Insira a extremidade de uma agulha de calibre 36 em uma extremidade da tubulação. Em seguida, encha uma seringa descartável de 3 mililitros com água estéril e insira-a no lado do tubo oposto à agulha. Lave a tubulação três vezes, alternando entre água estéril e álcool a 70% para desinfetar a tubulação e garantir que não haja vazamentos, entupimentos ou danos em toda a tubulação.
Usando a seringa descartável de 3 mililitros, encha a tubulação com água estéril e deixe a tubulação presa à seringa descartável. Em seguida, coloque um pedaço de paraespuma na superfície do gabinete de biossegurança e adicione uma piscina de água estéril a ele. Submerja a parte da tubulação conectada à agulha na piscina de água estéril.
Em seguida, puxe a seringa descartável para fora da abertura do tubo para evitar que qualquer ar entre no sistema de tubos após a remoção da seringa. Em seguida, encha uma seringa Hamilton de 10 microlitros com água estéril. Em seguida, conecte a agulha da seringa Hamilton à extremidade aberta da tubulação submergindo a ponta da agulha da seringa Hamilton na piscina de água estéril no filme para.
Mantenha pressionado o botão de marcha à ré rápida na tela da bomba para mover os blocos de pressão para o comprimento aproximado da seringa. Em seguida, desenrosque os botões de fixação do suporte para soltar os suportes de retenção no empurrador e os blocos do suporte da seringa. Subsequentemente, carregue a seringa Hamilton no bloco do suporte da seringa e prenda a seringa de acordo com as instruções do fabricante.
Para ajustar os parâmetros na tela de configuração da bomba, pressione o botão Force"e defina o nível de força em 30% Em seguida, aceite as alterações para voltar à tela de configuração. Pressione o botão Início Rápido", selecione Método e, em seguida, selecione a opção "Injetar somente". Para a opção de seringa, selecione Hamilton 1700, clique em "Vidro" e selecione 10 microlitros.
Mais tarde, selecione a velocidade de perfusão e o volume de injeção. Ejete a água da seringa Hamilton enquanto deixa a tubulação e a agulha de injeção cheias de água pressionando o botão "Infuse". Em seguida, retire o vírus colocando a agulha de injeção em uma alíquota do estoque de vírus.
Em seguida, puxe ligeiramente para trás a seringa Hamilton pressionando o botão reverso para introduzir uma pequena bolha de ar na tubulação. Depois de anestesiar o animal, pegue a conjuntiva com fórceps. Em seguida, insira a agulha na conjuntiva até que o bisel esteja totalmente coberto pela membrana conjuntival e coloque a agulha contra o globo.
Simultaneamente, inicie a injeção pressionando o botão Start"" usando o interruptor de pé. Para examinar a distribuição do vetor AAV, os tecidos oculares e circundantes foram corados com hematoxilina e eosina. Os cortes sagitais representativos demonstraram que a dispersão da tinta da Índia ocorreu principalmente adjacente aos músculos extraoculares na superfície externa da esclera nos tecidos conjuntivos peroculares soltos.
Para confirmar a transdução do AAV 8 auto-complementar às oito semanas após a injeção, a abundância de proteína de fluorescência verde nos cortes transversais foi examinada por coloração por imunofluorescência. Os resultados revelaram que os vetores AAV 8 transduziram eficientemente os músculos perioculares posteriores ao olho e à córnea. Para analisar a biodistribuição vetorial, os números de cópias do genoma vetorial e compartimentos oculares distintos em outros órgãos, incluindo fígado e coração, foram examinados por reação quantitativa em cadeia da polimerase usando primers e sondas específicas para o transgene.
A expressão do transgene foi confirmada pela reação em cadeia da polimerase quantitativa de transcrição reversa, que sugeriu que a injeção subconjuntival de AAV 8 resulta em expressão transgênica na pálpebra, conjuntiva, córnea e nervo óptico. A bolha de ar servirá como uma barreira entre a água no tubo e a droga terapêutica. Esta técnica permite que outros pesquisadores explorem o uso da via subconjuntival de administração para soluções oftálmicas e terapias genéticas oculares para múltiplas doenças.
