Estas estratégias sensíveis podem ser usadas para avaliar a eficácia da inibição dos inibidores químicos e em combinação com a exclusão genética CRISPR-Cas9 para investigar os alvos da droga. Em vez de usar um ensaio de ponto final, o crescimento de parasitas pode ser monitorado ao longo do tempo para permitir o cálculo do tempo de duplicação do parasita usando uma proteína repórter sensível. Este ensaio pode potencialmente ser ampliado em 384 ou 1.536 microplacões de poço para o teste de múltiplos compostos ou para a triagem de bibliotecas de forma de alto rendimento.
Esta estratégia pode ser modificada para quantificar o crescimento de outros patógenos microbianos intracelulares e suas respostas à droga de interesse. Para realizar um ensaio de crescimento de Toxoplasma baseado em luciferase, comece aspirando cuidadosamente o meio de culturas de microplatos pré-semeados de 96 poços de fibroblastos de prepúcio humano e inoculado 150 microliters de suspensão parasita B nos poços em um formato de linha de três colunas cinco. Após uma incubação de quatro horas na incubadora de cultura celular, aspire cuidadosamente o meio de cada poço para remover os parasitas não invadidos e encher os poços em cada um, mas na primeira linha com temperatura ambiente fenól vermelho livre.
Em seguida, adicione 100 microlitadores de uma solução de substrato de luciferase de 12,5 micromolares em PBS em cada poço da linha superior e incubar as microplatas por 10 minutos à temperatura ambiente para permitir a lise celular completa. Ao final da incubação, meça a atividade da luciferase em um leitor de microplacos. Cada leitura representa o número inicial de parasitas invadidos em quatro horas após a infecção.
Repita a análise a cada 24 horas pelos próximos quatro dias sem alterar o meio. Para calcular a mudança normalizada do crescimento do parasita, cada leitura pode ser dividida pela leitura inicial em quatro horas após a infecção. O registro 2 da mudança normalizada do crescimento do parasita pode então ser plotado contra cada ponto de tempo e submetido a uma função de regressão linear para obter a inclinação que representa o tempo de duplicação.
Para avaliar a eficácia da inibição de um composto de juros sobre o crescimento do Toxoplasma, cultura de fibroblastos de prepúcio humano em microplatos de 96 poços por pelo menos sete dias antes de inocular cada poço de células com 150 microliters de parasitas como demonstrado por quatro horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Durante a incubação, prepare o composto de juros em oito concentrações diferentes em um reservatório de 12 poços por diluição serial. Diluir os compostos em um reservatório de 12 poços em uma diluição de um a três, pipetando cada mistura várias vezes com uma pipeta de um mililitro.
Às quatro horas após a infecção, substitua o meio em cada poço das colunas dois a nove com 150 microliters de médio suplementados a cada diluição do composto, deixando a primeira coluna preenchida com meio regular para servir como controle não tratado. Em seguida, devolva as culturas celulares à incubadora de cultura celular por 96 horas e meça a atividade da luciferase para cada poço para determinar a porcentagem de inibição de crescimento nas culturas em cada concentração de composto. Para calcular a atividade luciferase normalizada como porcentagem, divida a atividade luciferase média para cada concentração composta pela atividade luciferase média derivada dos parasitas não tratados.
Em seguida, use um programa de software gráfico apropriado para traçar as atividades de luciferase normalizadas contra o composto individual e calcular a concentração inibitória meia maximal para cada composto. Para gerar uma construção plasmida expressando RNA e Cas9 de guia único para excluir um gene de interesse, navegue até a página do Recurso de Genômica toxoplasma e recupere toda a sequência de codificação genética, incluindo os introns e exons, juntamente com a base de 1,5 quilobase cinco e três regiões não traduzidas principais. Copie a sequência TgCPL recuperada no software de análise de sequência e rotule as cinco e três regiões não traduzidas principais.
Na página Recursos de Genômica do Toxoplasma, clique em Download, Arquivos de Dados e Current_Release. Na pasta T.gondii GT1, selecione FASTA. Da pasta de dados, baixe o arquivo de sequência de genoma de tensão Toxoplasma gondii GT1.
Em seguida, crie uma pasta local chamada Genoma toxoplasma no software de análise de sequência de DNA e importe o arquivo de sequência de genomas toxoplasma para a pasta. Selecione Ferramentas, Clonagem e Encontre sites CRISPR e defina três principais cas9 prime para a localização do site pam. Selecione um RNA de guia único que demonstre uma pontuação de alta especificidade, geralmente superior a 98% e falta um G seguindo o NGG.
O RNA de guia único selecionado geralmente está localizado em locais próximos ao início e para os códons do gene de interesse. Em seguida, use uma pré-mistura pcr com as configurações indicadas na tabela para executar uma reação pcr para modificar o plasmídeo pré-existente expressando RNA de guia único que tem como alvo o gene TgUPRT. Para a transfecção do Toxoplasma, misture dois microgramas de DNA de modelo reparado com 20 microgramas de plasmídeos de expressão RNA Cas9 de guia único e misture 400 microliters de ressuspensão, DNA e cinco microliters de 200 mililitros ATP 500 milimolar reduzido glutatione em um tubo de centrífusão de 1,5 mililitro.
Adicione o tampão de citomix para trazer o volume total até 500 microliters conforme necessário e transfira a mistura de DNA parasita para uma lacuna de quatro milímetros com cuvette de eletroporação. Em seguida, eletroporar os parasitas a dois quilovolts e 50 ohms de resistência. Para clonar parasitas eliminatórios, primeiro realizar uma diluição em duas etapas dos parasitas para alcançar 10 parasitas por mililitro de médio D10 suplementado com a concentração de antibióticos apropriada.
Em seguida, transfira 150 microlitadores dos parasitas purificados resuspendados para cada poço de uma microplata de 96 poços pré-semeadas com fibroblastos de prepúcio e incubar a microplacão a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por sete dias. Ao final da incubação, identifique os poços contendo uma única placa e transfira 75 microlitadores dos fibroblastos humanos infectados pelo Toxoplasma de cada poço da cultura de microplatos de 96 poços em tubos individuais de 1,5 mililitro. Colete as células por centrifugação e resuspenque as pelotas em 10,25 microliters de tampão de lise contendo tampão de diluição no aditivo de liberação de DNA.
Em seguida, incubar as amostras por quatro minutos em temperatura ambiente e dois minutos a 98 graus Celsius antes de realizar pcr para testar a integração do de resistência à droga e perda do gene de interesse. As eficácias de inibição de LHVS e tipo selvagem em cepas delta CPL podem ser determinadas plotando suas atividades de luciferase contra diferentes concentrações inibidoras. Após o PCR, o plasmídeo mutado é linearizado e carregado em um gel de 1%agarose para a verificação de uma amplificação bem sucedida.
Após a extração de gel e a transformação de E.coli, os clones contendo os plasmídeos esperados podem ser rastreados por restrição de digestão endonuclease no sequenciamento de DNA. Após a amplificação do modelo de reparo, a eletroforese do gel agarose pode ser usada para verificar o tamanho correto do produto PCR. Geralmente, sete a oito clones são selecionados para a triagem inicial para verificar a exclusão da sequência de codificação do gene de interesse, seguido pela detecção dos cinco e três braços primos para ajudar a minimalizar o número total de clones a serem rastreados.
Uma verificação adicional pode ser completada por imunoblotação se algum anticorpo que reconheça a proteína alvo estiver disponível. Antes de obter medidas de atividade de luciferase, uma microplaca clara com uma infecção simulada deve ser verificada sob um microscópio para garantir que os parasitas não lisem totalmente as células hospedeiras.
