Agradecemos ao Conselho de Engenharia e Ciências Físicas Research (EPSRC) para apoio financeiro (HLB). Agradecemos também Sridevi Maalika Ramanoudjame por sua assistência durante as filmagens deste procedimento.

Síntese 1. em fase sólida de Peptóides NOTA: Peptóides são sintetizados manualmente utilizando o procedimento submonï¿½ero de síntese em fase sólida peptóide. Este método permite alta eficiência de acoplamento e bons rendimentos do produto final. Síntese em fase sólida, também permite que os reagentes em excesso para ser removida facilmente no final de cada passo e o método foi modificado aqui para permitir (resíduos ou seja, do tipo arginina e do tipo lisina) diferentes funcionalizados monómeros catiónicos para ser incluído dentro da mesma sequência. 1,2 <ol><li> Síntese de um peptóide linear Atenção: Realizar avaliações de segurança antes de iniciar a síntese. Realizar todas as reações em um exaustor e usar equipamento de protecção individual adequado, conforme apropriado (ou seja, luvas de borracha nitrílica descartáveis, óculos de segurança e uma bata de laboratório). Tome cuidado especial ao utilizar os seguintes reagentes e solventes. Dimetilformamida (DMF) é um agente teratogénico e d suspeitaichloromethane (DCM) é um agente cancerígeno. N, diisopropilcarbodiimida N &#39;(DIC) e piperidina são perigosos para os olhos, pele, por inalação respiratório e pode causar sensibilização da pele. Hidrazina é um cancerígeno, fatal se for inalado e causa queimaduras graves na pele ou olhos. ácido bromoacético também é perigoso para a pele, olhos e trato respiratório e pode causar queimaduras por contacto. ácido trifluoroacético (TFA) é um líquido volátil e pode causar queimaduras graves por isso manuseie com cuidado. luvas pesados ​​são recomendados. <ol><li> Adicionar 0,12 g de resina de Rink amida protegida com Fmoc (0,1 mmol, carga típica 0,7 mmol / g) a um vaso reaccional de 20 ml de polipropileno tapados com duas fritas. Adicionar 5 ml de dimetilformamida (DMF) a inchar a resina e deixar o recipiente em repouso durante pelo menos 60 minutos à temperatura ambiente. Drenar o DMF, utilizando uma plataforma de vácuo de extracção em fase sólida. </li><li> Para desproteger o grupo Fmoc na resina aumentada de volume, adiciona-se 2 ml de solução de piperidina (20% em DMF v / v). Colocar o recipiente sobreuma plataforma de agitação à temperatura ambiente (450 rpm) e agitar durante 5 min. Remover a solução através da estação de vácuo. <ol><li> Repetir desprotecção Fmoc com 2 ml de solução de piperidina e agita-se durante 15 min à temperatura ambiente. Escorra a solução como antes. </li></ol></li><li> Lava-se a resina por adição de 2 ml de DMF e a mistura da resina durante 30 seg. Escorra o DMF e repita três vezes mais. </li><li> Para a acetilação, adicionar 1 ml de uma solução de ácido bromoacético (0,6 M em DMF) e 0,2 ml de N, solução de diisopropilcarbodiimida N &#39;(DIC, 50% em DMF v / v). Deixar vaso de reacção a agitar durante 20 min à temperatura ambiente. Drenar a solução e lava-se a resina com 2 ml de DMF três vezes. </li><li> Para o deslocamento, adicionar 1 ml de uma solução de amina (1,5 M em DMF). Agitar a resina durante 60 minutos à temperatura ambiente. Drenar a solução e lava-se a resina com 2 ml de DMF três vezes. <ol><li> Para adicionar um monômero do tipo arginina, siga o passo 1.7. Dependendo da sequência desejada peptóide, aminas diferentesserá adicionado. </li></ol></li><li> Repita os passos 1.1.4 e 1.1.5. </li><li> Para incluir um monómero funcionalizado de guanidina (isto é, N Arg), adicionar 1 ml de uma solução de diamina não protegida (1,5 M no seio de DMF) à resina e agita-se durante 60 min à temperatura ambiente. <ol><li> Drenar a solução e lava-se a resina com 2 ml de DMF três vezes. </li><li> Adicionar 2-acetyldimedone (0,2 g, 1 mmol em 0,5 mL de DMF, 10 equivalentes) para adicionar o grupo Dde para a amina primária livre e agitar por 60 min à temperatura ambiente. Drenar a solução e lava-se a resina com 2 ml de DMF três vezes. </li></ol></li><li> Continuar a síntese submonï¿½ero como em 1.1.4 a 1.1.7 até que a sequência desejada é feita. Adicionar 2 ml de DMF para se lavar a resina e repetir três vezes. </li><li> Para desproteger o grupo Dde em resina, adicionar solução de hidrazina 4 ml de 2% (em DMF v / v) e agita-se durante 3 minutos à temperatura ambiente. Escorra a solução e repita três vezes. </li><li> Drenar a solução e lava-se a resina com 2 ml de DMF três times. </li><li> Adicionar pirazole-1-carboxamidina (6 equivalentes por amina livre, ou seja, por monómeros N Arg, no volume mínimo de DMF) e N, N-diisopropiletilamina ou DIPEA (6 equivalentes por amina livre) e agitar à temperatura ambiente durante 60 min . </li><li> Drenar a solução e lava-se a resina com 2 ml de diclorometano três vezes. Deixar a resina a secar ao ar durante 10 min, em seguida, a resina pode ser armazenado até clivagem (secção 2). </li><li> Para interromper a síntese, lava-se a resina com 2 ml de DMF três vezes. Adicionar 2 ml de DMF, tapar o vaso de síntese e deixar à temperatura ambiente numa hotte. NOTA: A síntese pode ser pausado depois (podem ser formadas, exceto o segundo passo deslocamento como dicetopiperazinas) qualquer fase de deslocamento. </li></ol></li><li> A desprotecção da cadeia lateral e clivagem a partir da resina <ol><li> Realizar um cleave de teste para verificar o progresso da síntese (pureza e massa) em qualquer ponto durante a síntese após o displaetapas de cimento, adição ou remoção dos grupo protectores Dde ou depois da sequência final tenha sido feita. <ol><li> Transferir cerca de 10 pérolas de resina do recipiente de reacção para um novo cartucho de filtro de vidro sinterizado 8 ml de polipropileno. </li><li> Adicionar 1 ml de cocktail de clivagem de ácido trifluoroacético (contendo 95% de TFA, 2,5% de H2O, 2,5% de triisopropilsilano) e agitar durante 90 min à temperatura ambiente. </li><li> Filtra-se o cocktail de clivagem de TFA da resina utilizando o vaso de reacção de vidro sinterizado de 10 ml em frasco de fundo redondo. </li><li> Evapora-se o cocktail de clivagem utilizando um evaporador rotativo e redissolver o óleo resultante em 1 ml de acetonitrilo / água para a apresentação de LC-MS ou HPLC analítica. </li></ol></li><li> Para a clivagem final: no mesmo cartucho de frita de polipropileno de reacção utilizado para a síntese, adicionar 4 ml de cocktail de TFA a clivagem (95% de TFA, 2,5% de H2O, 2,5% de triisopropilsilano) e cobrir o recipiente. Agitar por 90 min à temperatura ambiente. </li><li> th filtroe TFA cocktail de clivagem a partir da resina utilizando o vaso de reacção de vidro sinterizado de 50 ml em frasco de fundo redondo. </li><li> Evapora-se o cocktail de clivagem utilizando um evaporador rotativo. Após o TFA foi removido, o produto deve ser obtido na forma de um óleo. Para facilitar a remoção de TFA a partir deste óleo em bruto, adiciona-se éter dietílico anidro e 2 ml da peptóide deve precipitar. <ol><li> De qualquer remover o éter dietílico através de uma pipeta e desfazer-se ou evapora-se utilizando um evaporador rotativo. Repita éter dietílico a precipitação três vezes. </li></ol></li><li> Dissolve-se o peptóide em bruto em 10 ml de solução de acetonitrilo / água acidificada (50% de acetonitrilo, 0,1% de TFA em água v / v). Transferir para um recipiente pré-pesado, congelar a 20 ° C e liofilizar para um pó seco. </li></ol></li></ol> 2. Purificação e Caracterização NOTA: A síntese peptóide pode ser monitorizado e o último peptóide avaliada através de fase reversa HPLC analítica utilizando uma coluna C18 e Elespectrometria ectrospray-cromatograf ia líquida de massa (LC-MS). Todos os solventes de HPLC de solventes para LC-MS deve ser preparada. <ol><li> CLAP analítica <ol><li> Pesar 1 mg de peptóide num pequeno frasco de vidro. Adicionar o volume mínimo de acetonitrilo para dissolver e dilua para 1 ml com água. Certifique-se de que o peptóide se ter dissolvido completamente. </li><li> Injectam-se 10 uL para HPLC analítica (gradiente sugeriu 0 - 100% de solvente B ao longo de 30 minutos, onde o solvente A = 95% água, 5% acetonitrilo, 0,05% de TFA e o solvente B = 95% acetonitrilo, 5% de água, 0,03% de TFA) , de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Visualizar espectro de UV a 220 nm. </li></ol></li><li> ESI CL-EM <ol><li> Adicione uma solução peptóide mg / ml, tal como no passo 2.1.1. </li><li> Injectar 1 ul de electropulverização LC-MS para determinar se o peso molecular do peptóide alvo está presente, utilizando as instruções do fabricante. </li><li> Verifique a massa alvo da sequência peptï¿½de usando um Peptcalculadora oid, conforme instruções da calculadora. 26 Este utilitário web também permite a atribuição de quaisquer exclusão / produtos de adição visto no espectro de massa 26. </li></ol></li><li> HPLC de fase inversa preparativa <ol><li> Dissolver peptï¿½des bruto em 2 ml de água acidificada / acetonitrilo (95% água, 5% de MeCN, 0,1% de TFA) e purifica-se por RP-HPLC preparativa utilizando o protocolo do fabricante. Determinar o gradiente por o tempo de eluição obtido a partir de HPLC analítica e a quantidade injectada irá depender das dimensões da coluna. </li><li> Visualizar usando um detector ajustado a 220 nm. </li><li> Recolha fracções em tubos de 15 ml de centrífuga, congelar a 20 ° C e liofilizar. </li><li> Re-analisar fracções utilizando LC-MS e HPLC analítico de acordo com o protocolo do fabricante. Reunir em fracções purificadas. </li></ol></li></ol> 3. Teste Biológica contra a Leishmania mexicana Parasitas Caução:. As avaliações de segurança deve ser realizada antes de iniciar a síntese de Leishmania mexicana é classificada um perigo grupo 2 patógeno no Reino Unido e medidas de controlo adequadas devem estar no local antes de iniciar o teste. Todo o trabalho deve ser realizado numa câmara de segurança microbiológica classe 2 e equipamento de protecção individual adequado usado como adequadas (ou seja, luvas de borracha nitrílica, óculos de segurança e uma bata de laboratório). <ol><li> Subcultura de parasitas <ol><li> Descongelar 1 ml de -150 ° C estoque congelada Leishmania mexicana M379 colocando frasco num banho de água a 37 ° C durante 30 seg. </li><li> Transferir a solução de reserva a 10 ml de meio de insecto de Schneider (a pH 7,0 suplementado com 15% de soro bovino fetal inactivado por calor e 1% de penicilina / estreptomicina) num balão de cultura de 25 centímetros de células 3 com uma tampa não-ventilada. </li><li> Incubar a 26 ° C durante 72 h. </li><li> Examine parasitas sob o microscópio (aumento de 400X) para verificar a condição. ºey deve ser promastigotas estágio de insetos, as formas procíclica em fase log com muitas células em divisão. </li><li> Manter promastigotas procíclicos por parasitas sub-cultura a uma concentração de 5 x 10 5 parasitas / ml a cada três dias. Contagem de células utilizando um hemocitómetro de Neubauer melhorada. </li></ol></li><li> Transformação de L. mexicana estágio inseto em forma amastigota de mamíferos estágio axênico 27 <ol><li> Dia 0: Preparar 10 ml de cultura de parasitas de fase log em 5 x 10 5 parasitas / ml em meio de insecto de Schneider (a pH 7,0 suplementado com 15% de calor-inactivado de soro fetal bovino e 1% de penicilina / estreptomicina) num três células 25 centímetros frasco de cultura com uma tampa não ventilada. </li><li> Incubar a 26 ° C durante 48 h. </li><li> Dia 3: Transferir 10 ml de cultura para um tubo de centrífuga de 50 ml e centrifugar a 447 xg durante 5 min. </li><li> Deitar fora meio antigo e adicionar 10 ml de meio Insect da Schneider (pH 5,5 suplementado com 20% hcomer inactivado de soro fetal bovino e 1% de penicilina / estreptomicina). Suavemente ressuspender o sedimento de parasitas no novo meio utilizando uma pipeta. </li><li> Contar o número de parasitas, utilizando uma melhoria hemocitômetro Neubauer. Dilui-se a uma concentração de 5 x 10 5 parasitas / ml, com pH 5,5 e meio de transferência para um frasco de cultura de 25 centímetros de células 3. </li><li> Incubar a 26 ° C durante aproximadamente 6 dias. </li><li> Dia 9: Examine parasitas sob um microscópio (400X). Eles devem estar no não-replicante, fase de promastigote infeccioso metacíclica. </li><li> Contar o número de parasitas, utilizando uma melhoria hemocitômetro Neubauer. Dilui-se a uma concentração de 5 x 10 5 parasitas / ml com meio de pH 5,5. </li><li> Retirar 10 ml de cultura de células e transferir para um frasco de cultura de células. Incubar a 32 ° C durante 5 dias. </li><li> Dia 14: Verifique aparecimento de parasitas sob o microscópio (400X). Eles devem estar na fase de amastigote patogénico, sem o carácter flageloistic de promastigotas, e pronto para o ensaio. </li></ol></li><li> Ensaio de citotoxicidade em L. mexicana amastigotas axênicas. NOTA: O teste biológico dos peptï¿½des utiliza ensaios de alto rendimento realizados em placas de 96 poços. Este protocolo descreve o ensaio de L. mexicana amastigotas axênicas, mas ensaios idênticos também podem ser realizadas sobre os parasitas fase promastigotas em meio adequado. Os compostos são incubados com parasitas em concentrações a partir de 3 - 100 uM durante 60 min e, em seguida, incubadas durante 24 horas na sequência de uma diluição de 10 vezes. Os resultados são obtidos através da medição da fluorescência dos poços após a incubação com a solução de viabilidade celular baseado em Resazurina (por exemplo, alamarBlue). <ol><li> Preparar soluções de reserva dos compostos. Pesar 1 mg do produto peptóide final purificado utilizando uma balança analítica. Adicionar o volume apropriado de sulfóxido de dimetilo de grau de biologia molecular (DMSO) a uma concentração de 5 mM. Faça 6 mL alíquotas econgelar a -20 ° C. </li><li> Preparar soluções de compostos em placas de 96 poços (de uma placa de layout recomendada pode ser visto na secção de resultados, a Figura 6), em triplicado, 100-3 uM. Adicionar 2 ml de solução de estoque de 5 mM de cada composto da linha superior (isto é, A). Adicionar 48 ul de meio de insecto de Schneider fresco (a pH 5,5 e soro de bovino fetal a 20% (FBS), 1% de penicilina / estreptomicina (P / S)) a linha superior, utilizando uma pipeta multi-canal. Adicionar 25 ul meio de insecto de Schneider para todas as outras linhas (B - F). <ol><li> Realizar uma diluição em série por pipetagem 25 solução ul a partir da linha superior. Adicione a linha abaixo e misture. Efectuar diluições até a última fila, onde a última solução de 25 ul deve ser descartado. </li><li> Use anfotericina B (5 mM de stocks) como um controlo positivo e DMSO (solução 2%) como um controlo negativo em triplicado. </li></ol></li><li> Preparar a solução parasita: cultura da transferência para um tubo de centrífuga de 50 ml e centrifugar a447 xg durante 5 min. Decantar meio antigo e adicionam-se 10 ml de meio de Schneider Insecto (a pH 5,5 e 20% de FBS, 1% de P / S). </li><li> Suavemente dissolver o sedimento de parasitas no novo meio utilizando uma pipeta e contagem usando um hemocitómetro de Neubauer melhorada. Dilui-se a cultura a 8 x 10 6 parasitas / ml. </li><li> Adicionar 25 ul L. Mexicana cultura a cada poço. Incubar as placas durante 60 min a 32 ° C. </li><li> Remova a placa do incubador e remover a solução de 40 ul de cada poço. </li><li> Adicionar 90 ul de meio fresco e incuba-se durante 24 h a 32 ° C. </li><li> Adicionar 10 ul de solução de viabilidade celular baseado em Resazurina a cada poço. Incuba-se durante 4 h a 32 ° C. </li><li> Medir a fluorescência utilizando um leitor de placas (ex λ = 540 nm, em = λ 600 nm), de acordo com as instruções do fabricante. Analisar os dados através da remoção de fundo médio (a partir de meio apenas poços) e comparando a fluorescência dos poços após a normalização em relação a tele DMSO controlos. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

<html> Peptóides estão cada vez mais a ser estudados na biologia química e campos de química medicinal em aplicações tais como novas terapias 3-5, agentes de entrega de células 18,20 e ferramentas de diagnóstico. 29 Tipicamente, estas sequências são catiónico para proporcionar um grau de selectividade para o agente patogénico sobre células de mamíferos, a capacidade de penetrar através das membranas celulares e também ajudar a solubilidade em sistemas aquosos. Existem inúmeros exemplos de peptoids catiônicos que contêm resíduos exclusivamente lisina- ou arginina-mimética na literatura. No entanto, até à data, a síntese de peptóides que contêm ambos estes resíduos catiónicos na mesma sequência tem sido dificultada pela falta de um processo de síntese adequado. O protocolo aqui descrito permite peptï¿½des catiónicos mistos a ser sintetizado de uma maneira eficiente e é altamente desejável, uma vez que oferece uma via para modular as propriedades biológicas e químicas do peptï¿½des anfipáticos. nt &quot;&gt; O nosso método utiliza uma adaptação à síntese peptóide submonï¿½ero comumente utilizados e permite a adição de ambos os monómeros de lisina- e do tipo arginina dentro da mesma sequência. Ela usa acoplamentos temperatura ambiente e estabeleceu protector da química do grupo assim prevê-se que este método irá ser útil para a maioria dos grupos de pesquisa. para adicionar protecção ortogonal para o resíduo de tipo arginina, uma diamina não protegida é adicionada sob condições padrão de deslocamento e, em seguida, protegida num acoplamento de 60 minutos com Dde-OH. uma variedade de diaminas podem ser utilizada que permite que as cadeias laterais de dois carbonos a 6 carbonos de comprimento ser instalado, ou seja, 1,2-diaminoetano, a 1,6-diamino-hexano respectivamente. a protecção Dde-OH dissolve bem em DMF e é um grupo de protecção muito eficaz e selectivo para aminas primárias. o grupo de protecção Dde-aminas secundárias folhas inalteradas, por exemplo, o terminal N desprotegido da cadeia peptóide. 30 Uma limitação é que todo o syntese foi realizada manualmente; No entanto, antecipa-se que as condições de acoplamento desenvolvido tornar o método favorável para uso com o péptido / sintetizadores automatizados peptï¿½des. A resina na desprotecção dos grupos Dde é realizado utilizando-se uma solução de hidrazina a 2% em DMF para deixar aminas livres que podem ser guanidinylated na resina utilizando pirazole-1-carboxamidina. Seis equivalentes do pirazole-1-carboxamidina e seis equivalentes de DIPEA são utilizados por amina livre na resina (isto é, seis equivalentes de cada tipo de monómero N Arg a ser instalada). Mais uma vez, esta reacção também é eficiente e o reagente de pirazole-1-carboxamidina tem boa solubilidade em DMF. A conclusão da reacção é normalmente visto através de LC-MS depois de 60 minutos à temperatura ambiente. Devido à versatilidade do método do submonï¿½ero, uma ampla variedade de aminas primárias pode ser utilizado no passo de deslocamento de modo que as condições podem necessitar de ser optimizado para aumentar a efi acoplamentoeficiência e rendimentos globais de produtos ou pureza. 31 Para as sequências discutidas acima, há condições especiais eram necessárias para acoplamentos bem sucedidos. No entanto, tempos mais longos de deslocamento ou concentrações mais elevadas de amina pode ser utilizado para deslocamentos problemáticos (isto é, para aminas estericamente volumosos nucleofílicos ou mal). Algumas aminas podem não ser completamente solúveis em DMF, caso em que é recomendado para os dissolver em N-metil-2-pirrolidona (NMP), ou outros solventes adequados para as reacções em fase sólida, em vez de em um método para a síntese anterior abrangente submonï¿½ero de peptóides. 32 para incorporar monómeros que contêm heteroátomos não protegidos nas cadeias laterais, acetilação utilizando ácido cloroacético tem sido mostrado para ser eficaz por outros grupos. 33 Adicionalmente, outras resinas podem ser utilizadas com este método para se obter peptï¿½des com diferentes funcionalização do terminal C. Wang resinas e resinas de cloreto de 2-clorotritilo são rotineiramente utilizados nasubmonï¿½ero síntese de peptóides. Por exemplo, este método tem sido usado com sucesso com resina de cloreto de 2-clorotritilo no nosso grupo. 2 diferentes suportes sólidos irá exigir um procedimento de carga diferente de Rink amida discutidos aqui (dependente da resina específica utilizada) de modo que este deve ser verificado com a literatura antes da síntese. Semelhante a síntese de péptidos, as condições para a clivagem final da resina peptóide fora também pode ser optimizado para a sequência específica. Neste protocolo, um cocktail de clivagem TFA foi utilizado (com triisopropilsilano e água como catadores). Os peptoids aqui apresentados continha apenas protecção Boc que é um grupo lábil razoavelmente ácido. Para assegurar a desprotecção completa das sequências com uma maior proporção de resíduos de ácido protegido ou menos grupos de protecção lábil, os tempos de clivagem mais longos podem ser necessários (isto é, os tempos de clivagem em excesso de 2 horas são recomendados para sequências que contêm Pbf ou terc-buéster Tyl grupos protegidos). sequestrantes alternativos também podem ser usados ​​para as cadeias laterais especializadas (por exemplo, de etanoditiol ou de 2-mercaptoetanol são muitas vezes utilizados em péptidos que têm cadeias laterais contendo enxofre tais como a cisteína ou metionina). O ensaio biológico é apresentado um ensaio de citotoxicidade padrão que pode ser alterado para se adequar a diferentes linhas celulares. É importante notar que cada placa de 96 poços deverão conter controlos suficientes para permitir que a confiança nos resultados obtidos. Neste caso, a anfotericina B é utilizado como um controlo positivo, uma vez que é uma droga conhecida utilizada para tratar a doença e DMSO é usado como um controlo negativo como este é o solvente usado para fazer reservas de composto para o ensaio. Se outras linhas de células estão a ser utilizados, os controlos adequados, alternativos deve ser obtida e validada antes da utilização. L. Mexicana é incubada com o peptóide a concentrações entre 100 e 2 ^ M, durante uma hora, e, em seguida, a solução parasita / peptóide é diluída pelaum factor de dez para incubação durante a noite (isto é, os poços inicialmente com 100 uM da peptóide são diluídos para 10 | iM). O reagente de viabilidade de células são adicionados a cada poço (10% do volume total do bem) no final do ensaio. Uma mudança de cor visível é visto entre poços com parasitas viáveis ​​(rosa), os poços de controlo sem parasitas viáveis ​​(azul) e um espectro entre com os números intermédios de parasitas viáveis. A fluorescência é proporcional ao número de células vivas e corresponde à actividade metabólica das células; resazurina corante (não fluorescente) é convertido para o fluorescente resorufina por meio de reacções de redução nas células metabolicamente activas. 34 Neste ensaio, o tempo de incubação com o reagente de viabilidade celular foi optimizado para L. mexicana. Os tempos de incubação com o reagente de viabilidade variará para placas semeadas em concentrações de células diferentes ou com diferentes linhas de células (por exemplo, este método também pode ser usadocom células de mamíferos). Dependendo do leitor de placas exacta utilizada, considerações devem ser feitas antes das medições de fluorescência são tomadas. Quaisquer bolhas de ar em cavidades deve ser removida para garantir leituras precisas podem ser tomadas. Alguns leitores de placas de ler a partir do fundo de placas, no qual caso de fundo plano de 96 placas de poços devem ser usados. Outras máquinas podem ler a partir do topo da placa, de modo que a tampa da placa deve ser removida antes da medição. Finalmente, no futuro, este protocolo pode ser compatível com sintetizadores automatizados que são capazes de fazer muitas sequências em paralelo. Além disso, a síntese de peptóides cíclicos também é possível, utilizando este método. Este protocolo deve fornecer aos pesquisadores um procedimento sintético prático que pode ser usado para acessar novos scaffolds peptï¿½des com ambos os monómeros lisina- e do tipo arginina, que podem ser de uso em muitas aplicações, incluindo materiais ou campos medicinais.

Peptóides (ou poli- N-substituído glycines) são uma classe de miméticos de péptidos-que oferecem propriedades semelhantes a péptidos e, como tal, estão cada vez mais a ser investigados para aplicações medicinais e materiais. Em péptidos, a cadeia lateral de cada aminoácido está ligado ao α-carbono da espinha dorsal de amida; em peptï¿½des as cadeias laterais são deslocados para o átomo de azoto do esqueleto. Fundamentalmente, isto dá peptï¿½des maior resistência à proteólise. Peptóides são normalmente sintetizados utilizando o método submonï¿½ero iniciada por Zuckermann et al., Onde monómeros peptï¿½des pode ser construído por haloacetylation sequencial de uma funcionalidade amina ligado a um suporte sólido e subsequente deslocamento do halogéneo com uma amina primária. 1 O nosso grupo desenvolveu recentemente uma adaptação deste método para permitir submonï¿½ero lisina- e do tipo arginina resíduos peptï¿½des para ser incluído dentro da mesma sequência para o f peptóideirst tempo. 2 Esta abordagem manual em fase sólida para a síntese de peptï¿½des utiliza reagentes comercialmente disponíveis e equipamentos de laboratório comum, tornando-o acessível para a maioria dos laboratórios. Peptóides ter sido demonstrado ter actividade promissora contra uma vasta gama de bactérias Gram-negativas, as espécies bacterianas e fúngicas Gram-positivas que são comparáveis aos diversos péptidos antimicrobianos conhecidos. 09/03 Em nosso trabalho, peptoids têm sido usados como compostos anti-infecciosos inovadoras para o tratamento da leishmaniose doença tropical negligenciada. 5,10 leishmaniose é endêmica em mais de 80 países em todo o mundo e estima-se que mais de 12 milhões de pessoas estão infectadas em todo o mundo. 11 A doença é causada por parasitas protozoários que são transmitidos pela picada de um mosquito pólvora. espécie de Leishmania pode causar leishmaniose cutânea, uma condição que conduz à formação de cicatrizes e a lesão das membranas mucosas, ou a leis visceral com risco de vidahmaniasis, o que provoca danos em órgãos fatal. Nenhuma vacina está actualmente disponível para esta doença e os tratamentos actuais dependem de um pequeno número de fármacos que têm efeitos secundários graves. Além disso, a resistência a fármacos existentes é um problema emergente e grave assim novos tratamentos são desesperadamente necessário para tratar eficazmente a leishmaniose no futuro 12-16. Nestas aplicações antimicrobianas, peptóides são frequentemente concebidos para serem anfipático com uma mistura de monómeros hidrófobos e catiónico. Isto pode dar 3,4 peptï¿½des um grau de selectividade em relação a células bacterianas, reduzir a toxicidade para as células de mamíferos, e para melhorar a sua actividade como transportadores moleculares . 17-20 a maioria dos peptï¿½des anti-infecciosos na literatura contêm cadeias laterais catiónicas que são exclusivamente constituídas por qualquer amino funcionalizado monómeros do tipo lisina ou resíduos de tipo arginina. quimeras péptido-peptï¿½des, onde as cadeias catiónicos são compostos de um amino ácidos lisina ou arginina, também foram sintetizados para analisar o efeito de grupos catiónicos sobre a actividade e a toxicidade 21-25. peptï¿½des poli-lisina podem ser facilmente sintetizados utilizando aminas protegidas com Boc comercialmente disponíveis. Os peptóides poli-arginina relatado pode ser feita utilizando um método que utiliza pirazole-1-carboxamidina como um agente guanidinylation. 18 No entanto, isso só pode ser realizada após a peptóide foi clivado a partir da resina e a protecção Boc na cadeia lateral removida, assim cada resíduo de tipo lisina dentro da sequência é transformada em um resíduo de arginina. Num esforço para aperfeiçoar as propriedades químicas e biológicas dos compostos, foi desenvolvido um método que permite a dupla funcionalidade catiónica (por exemplo, N e N Lys Arg) para ser incluído em qualquer dada sequência peptóide pela primeira vez 2. Aqui, nós descrevemos a síntese, purificação e caracterização de TWo romance peptoids que contêm ambos os resíduos lisina- e do tipo arginina na mesma sequência. O método utiliza ortogonal protecção N-Boc e N -Dde em resina com pirazole-1-carboxamidina como um reagente guanidinylation. A avaliação biológica destas peptï¿½des também é descrito em ensaios de citotoxicidade contra Leishmania mexicana, o agente causador da leishmaniose cutânea. Isto fornece um método prático para acessar peptoids com a funcionalidade catiônica dupla e para avaliar sua atividade biológica. Espera-se que este método vai ajudar a síntese de peptóides anfipáticos pela comunidade peptóide no futuro.

<table><tbody><tr><td>Polypropylene solid phase extraction cartridges with two frits</td><td>Crawford Scientific</td><td>12131017 and 12131015</td><td>20 ml and 6 ml cartridges used in this preparation</td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid</td><td>Tokyo Chemical Industry (Europe)</td><td>T0431-100g</td><td>&gt;98%; CAUTION: can cause severe burns and respiratory irritation</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N&#039;&lt;/em&gt;-diisopropylcarbodiimide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>38370-100ML</td><td>&gt;98%; CAUTION: hazardous to eyes, skin and via respiratory inhalation, may also cause sensitisation</td></tr><tr><td>Dimethylformamide</td><td>Fischer Scientific</td><td>10346180</td><td>HPLC grade; CAUTION: suspected teratogen</td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Fischer Scientific</td><td>10407440</td><td>HPLC grade</td></tr><tr><td>Dichloromethane</td><td>Fischer Scientific</td><td>10354263</td><td>99.8%; CAUTION: suspected carcinogen</td></tr><tr><td>Bromacetic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>17000-100G</td><td>&gt;99%; CAUTION: causes burns and hazardous to skin, eyes and respiratory tract</td></tr><tr><td>(&lt;em&gt;S&lt;/em&gt;)-(-)-alpha methylbenzylamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>115568-100G</td><td>98%; CAUTION: harmful if swallowed, toxic in contact with skin, causes severe skin burns and eye damage, used to synthesise the Nspe monomer</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-Boc 1,4-diaminobutane</td><td>Tokyo Chemical Industry (Europe)</td><td>A1373-25g</td><td>&gt;98%; CAUTION: causes severe skin burns and eye damage, used to synthesise the NLys monomer</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-Boc 1,2-diaminoethane</td><td>Tokyo Chemical Industry (Europe)</td><td>A1371-25g</td><td>&gt;97%; CAUTION: causes severe skin burns and eye damage, used to synthesise the Nae monomer</td></tr><tr><td>1,2-diaminobutane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D13208-100G</td><td>99%; CAUTION: flammable liquid and vapour, harmful if swallowed or inhaled, toxic in contact with skin, causes severe skin burns and eye damage, used in the synthesis of the NhArg monomer</td></tr><tr><td>1,4-diaminoethane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>03550-250ML</td><td>&gt;99.5%; CAUTION: flammable liquid and vapour, harmful if swallowed or inhaled, toxic in contact with skin, causes severe skin burns and eye damage, used in the synthesis of the NnArg monomer&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>1H-pyrazole-1-carboxamidine HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>402516-10G</td><td>as HCl salt; CAUTION: harmful if swallowed and may cause an allergic skin reaction, causes serious eye damage</td></tr><tr><td>Hydrazine monohydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>207942-5G</td><td>reagent grade; CAUTION: suspected carcinogen, fatal if inhaled and causes severe burns to skin and eyes</td></tr><tr><td>2-acetyl dimedone</td><td>Novabiochem</td><td>8510150005</td><td>Dde-OH</td></tr><tr><td>Rink Amide resin</td><td>Novabiochem</td><td>8551190005</td><td>100-200 mesh, high loading</td></tr><tr><td>Piperidine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>411027-1L</td><td>&gt;99.5%, a controlled substance, so adequate permission must be obtained before purchase; CAUTION: highly flammable liquid and vapour, harmful if swallowed and toxic in contact with skin or if inhaled, causes severe skin burns and eye damage, harmful to aquatic life with long lasting effects</td></tr><tr><td>Triisopropylsilane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>233781-50G</td><td>98%; CAUTION: flammable liquid and vapour, causes skin irritation and serious eye irritation</td></tr><tr><td>alamarBlue</td><td>ThermoFischer&amp;nbsp;</td><td>DAL1025</td><td>Not classified as hazardous</td></tr><tr><td>Schneider&#039;s Insect Medium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9895-1L</td><td>Powdered, medium must be made prior to use following manafacturers instructions; allow to warm to room temperature before use in biological assays</td></tr><tr><td>96 well plates</td><td>VWR</td><td>734-1793</td><td>Flat bottom (to allow fluorescence measurement from the bottom), tissue-culture treated</td></tr><tr><td>Solvent reservoirs</td><td>VWR</td><td>613-1182</td><td>Used with multi channel pipette</td></tr><tr><td>Multi channel pipette</td><td>Eppendorf</td><td>3122000043</td><td></td></tr><tr><td>Pipette tips</td><td>Starlab Group</td><td>S1111-3810, S1113-1810, S1111-6810</td><td>Volume of tip dependent on pipette used. 10&amp;nbsp;&amp;micro;l, 10 - 200&amp;nbsp;&amp;micro;l and 1,000&amp;nbsp;&amp;micro;l recommended for assays</td></tr><tr><td>25 cm&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt; cell culture flasks</td><td>VWR</td><td>734-2312</td><td></td></tr><tr><td>50 ml centrifuge tubes</td><td>VWR</td><td>525-0791</td><td></td></tr><tr><td>dimethylsulphoxide (molecular biology grade)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8418-50ML</td><td>Not classified as hazardous</td></tr><tr><td>Heat Inactivated Fetal Bovine Serum</td><td>ThermoFischer&amp;nbsp;</td><td>10082139-100mL</td><td>Gibco</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>ThermoFischer&amp;nbsp;</td><td>15140148-20mL</td><td>Abbreviation: P/S</td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>46006-100mg</td><td>Amphotericin B trihydrate, VetranalTM analytical standard</td></tr></tbody></table>

an efficient method for the synthesis of peptoids with mixed lysine-type/arginine-type monomers and evaluation of their anti-leishmanial activity

This protocol describes the manual solid-phase synthesis of linear peptoids that contain two differently functionalized cationic monomers. In this procedure amino functionalized 'lysine' and guanido functionalized 'arginine' peptoid monomers can be included within the same peptoid sequence. This procedure uses on-resin (N-(1-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohexylidene)ethyl) or Dde protection, orthogonal conditions to the Boc protection of lysine monomers. Subsequent deprotection allows an efficient on-resin guanidinylation reaction to form the arginine residues. The procedure is compatible with the commonly used submonomer method of peptoid synthesis, allowing simple peptoids to be made using common laboratory equipment and commercially available reagents. The representative synthesis, purification and characterization of two mixed peptoids is described. The evaluation of these compounds as potential anti-infectives in screening assays against Leishmania mexicana is also described. The protozoan parasite L. mexicana is a causative agent of cutaneous leishmaniasis, a neglected tropical disease that affects up to 12 million people worldwide.

Como um resultado representativo, a síntese e a caracterização de duas 12 peptï¿½des resíduo contendo dois monómeros do tipo de lisina e arginina do tipo de dois monómeros de cada um serão descritas. Os resultados de ensaio de citotoxicidade subsequentes também são mostrados. Dois peptóides [(N Narg N SPE N SPE) (N AE N SPE N SPE)] 2 (a) e [(hArg N SPE N SPE N) (N Lys N SPE N SPE)] 2 (b) foram sintetizados usando 120 mg de resina de Rink amida cada (carga = 0,79 mmol / g). Todos os passos de acetilação e de deslocamento foram realizados como descrito acima, com todos os reagentes adquiridos comercialmente. Para estes resíduos, as seguintes aminas foram usadas na fase de deslocamento: N SPE (S) - (-) - α-metilbenzilamina, N AE N - (terc-butoxicarbonil) -1,2-diaminoethane, N Lys N - (terc-butoxicarbonil) -1,4-diaminobutano. Para os resíduos derivado de arginina, as seguintes diaminas não protegidos foram acoplados: N hArg 1,4-diaminobutano ou N Narg 1,2-diaminoetano, seguido de protecção sobre resina com 2-acetyldimedone (Dde-OH). Depois de toda a sequência ter sido sintetizado, hidrazina desprotecção do Dde produz aminas livres nos guanidinylate. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54750/54750fig1.jpg" /> Figura 1. peptóide estruturas (a) [(N Narg N N SPE SPE) (AE N N N SPE SPE)] 2 e (b) [(N hArg N N SPE SPE) (N <stro<html> ng&gt; Lys N spe N spe)] 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54750/54750fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54750/54750fig2.jpg" /> Figura 2. O método utilizado para sintetizar peptï¿½des arginina / lisina mistos. I. etapa deslocamento padrão no método submonï¿½ero com diamina; II. A adição de DDE-oh, 90 minutos para proteger amina livre; III. Mais adições para estender a cadeia peptóide usando o método submonï¿½ero; IV. A desprotecção de Dde utilizando 2% de hidrazina em DMF; V. Guanidinylation de amina livre na resina com pirazole-1-carboxamidina e DIPEA em DMF; vi. clivagem ácida da resina e desprotecção de grupos Boc.large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. A seguir à clivagem a partir da resina e liof ilização, os produtos em bruto foram obtidos na forma de pós brancos: (a) 154 mg, (b) 163 mg. Os produtos foram purificados por meio de RP-HPLC, tal como descrito com um máximo de 50 mg injecções usando uma bomba de cromatografia líquida, com um detector de UV-VIS (λ = 250 nm) numa coluna analítica, 250 mm x 10 mm, 5 mm; caudal = 2 ml / min. As fracções correspondentes à massa alvo foram combinadas e obtido na forma de pós brancos: (a) 54 mg (b) 65 mg, rendimento final de aproximadamente 30% para as fracções&gt; 90% puros. As identidades composto final, depois da purificação foram confirmados por LC-MS (ver Figura 3), utilizando um espectrómetro de massa de quadrupolo triplo equipado com um UPLC e um detector de arranjo de fotodiodos. espectrometria de massa exata foi realizada usando o mesmo espectrómetro em t<html> ele [M + 2H] 2+. A seguir, calculado e massas observadas foram encontrados em estreita concordância (Figura 4): (a) calculado = 896,0026 amu, observado = 896,0038 amu; (B) calculado = 952,0691 amu, observado = 952,0730 amu. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54750/54750fig3.jpg" /> Figura 3. LC-MS para peptï¿½des purificadas. (A) m / z = 1792 e (b) m / z = 1903. Onde o topo é TIC, meio espectro de LC-MS, cromatograma UV inferior a 220 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54750/54750fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54750/54750fig4.jpg" /> Figura 4. Dados de espectrometria de massa precisas para peptóides (a) e (b).&quot;Https://www.jove.com/files/ftp_upload/54750/54750fig4large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. A pureza do produto foi avaliada utilizando um RP-HPLC (Bomba LC com um detector de UV-vis numa coluna analítica, 4,6 mm x 100 mm, 3,5 uM; taxa de fluxo = 1 mL / min) analítica, e visualizados a 220 nm, a absorvância amida do esqueleto. a Figura 5a e 5b mostra que os compostos são homogéneas. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54750/54750fig5.jpg" /> Figura 5. HPLC analítica para os peptï¿½des purificados (a) e (b). Existe um gradiente de 0-100% de B ao longo de 30 minutos, forno de coluna a 40 ° C (A = 95% de H2O, 5% de MeCN, 0,05 % de TFA;. B = 95% de MeCN, 5% de H 2 O, 0,03% de TFA) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54750/54750fig5large.jpg" target="_blank">Por favor cl</a>ick aqui para ver uma versão maior desta figura. Os peptóides purificados (A) e (B) foram testadas em ensaios de citotoxicidade contra L. mexicana amastigotas axênicas. Reservas congeladas de L. Mexicana foram descongelados e transformado para o estádio de amastigote pronto para o ensaio. 72 horas após o descongelamento, os parasitas deve ser promastigotas estágio de insetos em sua forma pró-cíclica, em fase log com muitas células em divisão. Nesta fase, o parasita pode ser transformado no estádio de amastigote usando a mudança de pH e temperatura descrito. 27 No dia 9 da transformação, os parasitas se na fase de promastigote infeccioso metacíclica não replicantes. Finalmente, no dia 14, os parasitas deve estar na fase de amastigote patogénico parasitas onde falta a característica dos flagelos promastigotas 28. Soluções reserva 5 mM dos compostos foram feitas em DMSO de grau de cultura de células e testado em triplicado sobreum mínimo de duas ocasiões, para assegurar um conjunto de dados robusto foi recolhido. Um plano de placa de 96 poços representativo é mostrado na Figura 6. No final do ensaio, o reagente de viabilidade celular foi adicionado a cada poço e a fluorescência foi medida como descrito para calcular a viabilidade dos parasitas em cada concentração ensaiada (ver Figura 7 ). Os valores de ED50 foram calculados como peptóide (a)&gt; 100 uM e peptóide (b) 37 uM, respectivamente. As barras de erro plotados, mostram a variação entre os poços como um desvio padrão e pode ser visto que estes são razoáveis ​​para a maioria das barras. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/54750/54750fig6.jpg" /> Figura 6. 96 representativas plano de placa bem para um ensaio de citotoxicidade em 2 peptï¿½des soluções (incluindo os controlos positivos e negativos). Med + = médio (Insecto meio de Schneider, pH 5,5, 20% de FBS, 1% de P / S). L. mex. =8 x 10 6 / ml cultura parasita no med +. AmphoB = 5 mM em DMSO. solução de peptï¿½de = 5 mM em DMSO. Poços vazios devem conter água estéril. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54750/54750fig6large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/54750/54750fig7.jpg" /> Figura 7. Resultados do ensaio de citotoxicidade contra L. mexicana axénica parasitas amastigotas usando peptóide (a) e (b). Pode ser visto que o peptóide (b) é mais eficaz do que peptóide (a) a redução da percentagem de parasitas viáveis, com ambos os compostos tendo um efeito dependente da dose. As barras de erro plotados mostram a variação entre os poços como um desvio padrão. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54750/54750fig7large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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An Efficient Method for the Synthesis of Peptoids with Mixed Lysine-type/Arginine-type Monomers and Evaluation of Their Anti-leishmanial Activity

A protocol to synthesize peptoids with mixed cationic functionality in the same sequence is presented (lysine- and arginine-type monomers). Subsequent testing of these compounds against Leishmania mexicana, the protozoan parasites that cause cutaneous leishmaniasis, is also described.

Um método eficiente para a Síntese de Peptóides com Monómeros Mixed tipo de lisina / arginina-tipo e avaliação da sua actividade anti-leishmaniose

This protocol describes the manual solid-phase synthesis of linear peptoids that contain two differently functionalized cationic monomers. In this ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

12.0K visualizações.  Durham University. A protocol to synthesize peptoids with mixed cationic functionality in the same sequence is presented (lysine- and arginine-type monomers). Subsequent testing of these compounds against Leishmania mexicana, the protozoan parasites that cause cutaneous leishmaniasis, is also described.

Vídeo: An Efficient Method for the Synthesis of Peptoids with Mixed Lysine-type/Arginine-type Monomers and Evaluation of Their Anti-leishmanial Activity

Split-and-pool Synthesis and Characterization of Peptide Tertiary Amide Library

Peptidomimetics are great sources of protein ligands. The oligomeric nature of these compounds enables us to access large synthetic libraries on solid phase by using combinatorial chemistry. One of the most well studied classes of peptidomimetics is peptoids. Peptoids are easy to synthesize and have been shown to be proteolysis-resistant and cell-permeable. Over the past decade, many useful protein ligands have been identified through screening of peptoid libraries. However, most of the ligands identified from peptoid libraries do not display high affinity, with rare exceptions. This may be due, in part, to the lack of chiral centers and conformational constraints in peptoid molecules. Recently, we described a new synthetic route to access peptide tertiary amides (PTAs). PTAs are a superfamily of peptidomimetics that include but are not limited to peptides, peptoids and N-methylated peptides. With side chains on both &#945;-carbon and main chain nitrogen atoms, the conformation of these molecules are greatly constrained by sterical hindrance and allylic 1,3 strain. (Figure 1) Our study suggests that these PTA molecules are highly structured in solution and can be used to identify protein ligands. We believe that these molecules can be a future source of high-affinity protein ligands. Here we describe the synthetic method combining the power of both split-and-pool and sub-monomer strategies to synthesize a sample one-bead one-compound (OBOC) library of PTAs.

Peptide tertiary amides (PTAs) are a superfamily of peptidomimetics that include but are not limited to peptides, peptoids and N-methylated peptides. Here we describe a synthetic method which combines&#160;both split-and-pool and sub-monomer strategies to synthesize a one-bead one-compound library of PTAs.

Split-and-piscina Síntese e Caracterização de Peptídeos Terciário Amide Biblioteca

Peptidomimetics are great sources of protein ligands. The oligomeric nature of these compounds enables us to access large synthetic libraries on solid ...

Química

Solid-phase Submonomer Synthesis of Peptoid Polymers and their Self-Assembly into Highly-Ordered Nanosheets

Peptoids are a novel class of biomimetic, non-natural, sequence-specific heteropolymers that resist proteolysis, exhibit potent biological activity, and fold into higher order nanostructures. Structurally similar to peptides, peptoids are poly N-substituted glycines, where the side chains are attached to the nitrogen rather than the alpha-carbon. Their ease of synthesis and structural diversity allows testing of basic design principles to drive de novo design and engineering of new biologically-active and nanostructured materials.
Here, a simple manual peptoid synthesis protocol is presented that allows the synthesis of long chain polypeptoids ( up to 50mers) in excellent yields. Only basic equipment, simple techniques (e.g. liquid transfer, filtration), and commercially available reagents are required, making peptoids an accessible addition to many researchers' toolkits. The peptoid backbone is grown one monomer at a time via the submonomer method which consists of a two-step monomer addition cycle: acylation and displacement. First, bromoacetic acid activated in situ with N,N'-diisopropylcarbodiimide acylates a resin-bound secondary amine. Second, nucleophilic displacement of the bromide by a primary amine follows to introduce the side chain. The two-step cycle is iterated until the desired chain length is reached. The coupling efficiency of this two-step cycle routinely exceeds 98% and enables the synthesis of peptoids as long as 50 residues. Highly tunable, precise and chemically diverse sequences are achievable with the submonomer method as hundreds of readily available primary amines can be directly incorporated.
 
Peptoids are emerging as a versatile biomimetic material for nanobioscience research because of their synthetic flexibility, robustness, and ordering at the atomic level. The folding of a single-chain, amphiphilic, information-rich polypeptoid into a highly-ordered nanosheet was recently demonstrated. This peptoid is a 36-mer that consists of only three different commercially available monomers: hydrophobic, cationic and anionic. The hydrophobic phenylethyl side chains are buried in the nanosheet core whereas the ionic amine and carboxyl side chains align on the hydrophilic faces. The peptoid nanosheets serve as a potential platform for membrane mimetics, protein mimetics, device fabrication, and sensors. Methods for peptoid synthesis, sheet formation, and microscopy imaging are described and provide a simple method to enable future peptoid nanosheet designs.

A simple and general manual peptoid synthesis method involving basic equipment and commercially available reagents is outlined, enabling peptoids to be easily synthesized in most laboratories. The synthesis, purification and characterization of an amphiphilic peptoid 36mer is described, as well as its self-assembly into highly-ordered nanosheets.

Síntese em fase sólida Submonomer de Polímeros Peptoid e seus Automontagem em altamente ordenada nanofolhas

Peptoids are a novel class of biomimetic, non-natural, sequence-specific heteropolymers that resist proteolysis, exhibit potent biological activity, and ...

Bioengenharia

Development of a Backbone Cyclic Peptide Library as Potential Antiparasitic Therapeutics Using Microwave Irradiation

Protein-protein interactions (PPIs) are intimately involved in almost all biological processes and are linked to many human diseases. Therefore, there is a major effort to target PPIs in basic research and in the pharmaceutical industry. Protein-protein interfaces are usually large, flat, and often lack pockets, complicating the discovery of small molecules that target such sites. Alternative targeting approaches using antibodies have limitations due to poor oral bioavailability, low cell-permeability, and production inefficiency.
Using peptides to target PPI interfaces has several advantages. Peptides have higher conformational flexibility, increased selectivity, and are generally inexpensive. However, peptides have their own limitations including poor stability and inefficiency crossing cell membranes. To overcome such limitations, peptide cyclization can be performed. Cyclization has been demonstrated to improve peptide selectivity, metabolic stability, and bioavailability. However, predicting the bioactive conformation of a cyclic peptide is not trivial. To overcome this challenge, one attractive approach it to screen a focused library to screen in which all backbone cyclic peptides have the same primary sequence, but differ in parameters that influence their conformation, such as ring size and position.
We describe a detailed protocol for synthesizing a library of backbone cyclic peptides targeting specific parasite PPIs. Using a rational design approach, we developed peptides derived from the scaffold protein Leishmania receptor for activated C-kinase (LACK). We hypothesized that sequences in LACK that are conserved in parasites, but not in the mammalian host homolog, may represent interaction sites for proteins that are critical for the parasites&#39; viability. The cyclic peptides were synthesized using microwave irradiation to reduce reaction times and increase efficiency. Developing a library of backbone cyclic peptides with different ring sizes facilitates a systematic screen for the most biological active conformation. This method provides a general, fast, and facile way to synthesize cyclic peptides.

A simple and general method for the synthesis of cyclic peptides using microwave irradiation is outlined. This procedure enables the synthesis of backbone cyclic peptides with a collection of different conformations while retaining the side chains and the pharmacophoric moieties., and therefore, allows to screen for the bioactive conformation.

Desenvolvimento de um Backbone cíclica Biblioteca de Peptídeos como potencial antiparasitário Therapeutics Usando Microondas Irradiação

Protein-protein interactions (PPIs) are intimately involved in almost all biological processes and are linked to many human diseases. Therefore, there is ...

Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs

Mimicking and exploiting virus properties and physicochemical and physical characteristics holds promise to provide solutions to some of the world's most pressing challenges. The sheer range and types of viruses coupled with their intriguing properties potentially give endless opportunities for applications in virus-based technologies. Viruses have the ability to self- assemble into particles with discrete shape and size, specificity of symmetry, polyvalence, and stable properties under a wide range of temperature and pH conditions. Not surprisingly, with such a remarkable range of properties, viruses are proposed for use in biomaterials 9, vaccines 14, 15, electronic materials, chemical tools, and molecular electronic containers4, 5, 10, 11, 16, 18, 12.
In order to utilize viruses in nanotechnology, they must be modified from their natural forms to impart new functions. This challenging process can be performed through several mechanisms including genetic modification of the viral genome and chemically attaching foreign or desired molecules to the virus particle reactive groups 8. The ability to modify a virus primarily depends upon the physiochemical and physical properties of the virus. In addition, the genetic or physiochemical modifications need to be performed without adversely affecting the virus native structure and virus function. Maize rayado fino virus (MRFV) coat proteins self-assemble in Escherichia coli producing stable and empty VLPs that are stabilized by protein-protein interactions and that can be used in virus-based technologies applications 8. VLPs produced in tobacco plants were examined as a scaffold on which a variety of peptides can be covalently displayed 13. Here, we describe the steps to 1) determine which of the solvent-accessible cysteines in a virus capsid are available for modification, and 2) bioconjugate peptides to the modified capsids. By using native or mutationally-inserted amino acid residues and standard coupling technologies, a wide variety of materials have been displayed on the surface of plant viruses such as, Brome mosaic virus 3, Carnation mottle virus 12, Cowpea chlorotic mottle virus 6, Tobacco mosaic virus 17, Turnip yellow mosaic virus 1, and MRFV 13.

Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs

A method to analyze the solvent accessibility of the thiol group of cysteine residues of Maize rayado fino virus (MRFV)-virus-like particles (VLPs) followed by a peptide cross-linking reaction is described. The method takes advantage of the availability of several chemical groups on the surface of the VLPs that can be targets for specific reactions.

Análise da acessibilidade de solvente de resíduos de cisteína em<em&gt; Milho rayado fino vírus</em&gt; Partículas semelhantes a vírus produzidas em<em&gt; Nicotiana benthamiana</em&gt; Plantas e cross-linking de peptídeos para VLP

Mimicking  and exploiting virus properties and physicochemical and physical  characteristics holds promise to provide solutions to some of  the world's ...

Imunologia e Infecção

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have been thought of as a type of molecular information storage. Mass spectrometry analysis has been considered the method of choice for sequencing peptoids. Peptoids can be synthesized via solid phase chemistry using a repeating two-step reaction cycle. Here we present a method to manually synthesize oligo-peptoids and to analyze the sequence of the peptoids using tandem mass spectrometry (MS/MS) techniques. The sample peptoid is a nonamer consisting of alternating N-(2-methyloxyethyl)glycine (Nme) and N-(2-phenylethyl)glycine (Npe), as well as an N-(2-aminoethyl)glycine (Nae) at the N-terminus. The sequence formula of the peptoid is Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, where Ac is the acetyl group. The synthesis takes place in a commercially available solid-phase reaction vessel. The rink amide resin is used as the solid support to yield the peptoid with an amide group at the C-terminus. The resulting peptoid product is subjected to sequence analysis using a triple-quadrupole mass spectrometer coupled to an electrospray ionization source. The MS/MS measurement produces a spectrum of fragment ions resulting from the dissociation of charged peptoid. The fragment ions are sorted out based on the values of their mass-to-charge ratio (m/z). The m/z values of the fragment ions are compared against the nominal masses of theoretically predicted fragment ions, according to the scheme of peptoid fragmentation. The analysis generates a fragmentation pattern of the charged peptoid. The fragmentation pattern is correlated to the monomer sequence of the neutral peptoid. In this regard, MS analysis reads out the sequence information of the peptoids.

A protocol is described for the manual synthesis of oligo-peptoids followed by sequence analysis by mass spectrometry.

Síntese e análise de espectrometria de massa de Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...

Facile Protocol for the Synthesis of Self-assembling Polyamine-based Peptide Amphiphiles (PPAs) and Related Biomaterials

Polyamine-based Peptide Amphiphiles (PPAs) are a new class of self-assembling amphiphilic biomaterials-related to the peptide amphiphiles (PAs). Traditional PAs possess charged amino acids as solubilizing groups (lysine, arginine), which are directly connected to a lipid segment or can contain a linker region made of neutral amino acids. Tuning the peptide sequence of PAs can yield diverse morphologies. Similarly, PPAs possess a hydrophobic segment and neutral amino acids, but also contain polyamine molecules as water solubilizing (hydrophilic) groups. As is the case with PAs, PPAs can also self-assemble into diverse morphologies, including small rods, twisted nano-ribbons, and fused nano-sheets, when dissolved in water. However, the presence of both primary and secondary amines on a single polyamine molecule poses a significant challenge when synthesizing PPAs. In this paper, we show a simple protocol, based on literature precedents, to achieve a facile synthesis of PPAs using solid phase peptide synthesis (SPPS). This protocol can be extended to the synthesis of PAs and other similar systems. We also illustrate the steps that are needed for cleavage from the resin, identification, and purification.

Facile Protocol for the Synthesis of Self-assembling Polyamine-based Peptide Amphiphiles PPAs and Related Biomaterials

The synthesis of polyamine-based peptide amphiphiles (PPAs) is a significant challenge due to the presence of multiple amine nitrogens, which requires judicious use of protecting groups to mask these reactive functionalities. In this paper, we describe a facile method for the preparation of these new class of self-assembling molecules.

Facile protocolo para a síntese de auto montagem baseada em poliamina peptídeo Amphiphiles (CAE) e biomateriais relacionados

Polyamine-based Peptide Amphiphiles (PPAs) are a new class of self-assembling amphiphilic biomaterials-related to the peptide amphiphiles (PAs). ...

Synthesis of Information-bearing Peptoids and their Sequence-directed Dynamic Covalent Self-assembly

This protocol presents the use of Lewis acidic multi-role reagents to circumvent kinetic trapping observed during the self-assembly of information-encoded oligomeric strands mediated by paired dynamic covalent interactions in a manner mimicking the thermal cycling commonly employed for the self-assembly of complementary nucleic acid sequences. Primary amine monomers bearing aldehyde and amine pendant moieties are functionalized with orthogonal protecting groups for use as dynamic covalent reactant pairs. Using a modified automated peptide synthesizer, the primary amine monomers are encoded into oligo(peptoid) strands through solid-phase submonomer synthesis. Upon purification by high-performance liquid chromatography (HPLC) and characterization by electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS), sequence-specific oligomers are subjected to high-loading of a Lewis acidic rare-earth metal triflate which both deprotects the aldehyde moieties and affects the reactant pair equilibrium such that strands completely dissociate. Subsequently, a fraction of the Lewis acid is extracted, enabling annealing of complementary sequence-specific strands to form information-encoded molecular ladders characterized by matrix assisted laser desorption/ionization mass spectrometry (MALDI-MS). The simple procedure outlined in this report circumvents kinetic traps commonly experienced in the field of dynamic covalent assembly and serves as a platform for the future design of robust, complex architectures.

A protocol is presented for the synthesis of information-encoded peptoid oligomers and for the sequence-directed self-assembly of these peptoids into molecular ladders using amines and aldehydes as dynamic covalent reactant pairs and Lewis acidic rare-earth metal triflates as multi-role reagents.

Síntese de Peptoides portadores de informações e sua Auto-montagem Dinâmica Covalent e dirigida por sequência

This protocol presents the use of Lewis acidic multi-role reagents to circumvent kinetic trapping observed during the self-assembly of information-encoded ...

Constructing Cyclic Peptides Using an On-Tether Sulfonium Center

In recent years, cyclic peptides have attracted increasing attention in the field of drug discovery due to their excellent biological activities, and, as a consequence, they are now used clinically. It is, therefore, critical to seek effective strategies for synthesizing cyclic peptides to promote their application in the field of drug discovery. This paper reports a detailed protocol for the efficient synthesis of cyclic peptides using on-resin or intramolecular (intermolecular) bisalkylation. Using this protocol, linear peptides were synthesized by taking advantage of solid-phase peptide synthesis with cysteine (Cys) and methionine (Met) coupled simultaneously on the resin. Further, cyclic peptides were synthesized via bisalkylation between Met and Cys using a tunable tether and an on-tether sulfonium center. The whole synthetic route can be divided into three major processes: the deprotection of Cys on the resin, the coupling of the linker, and the cyclization between Cys and Met in a trifluoroacetic acid (TFA) cleavage solution. Furthermore, inspired by the reactivity of the sulfonium center, a propargyl group was attached to the Met to trigger thiol-yne addition and form a cyclic peptide. After that, the crude peptides were dried and dissolved in acetonitrile, separated, and then purified by high-performance liquid chromatography (HPLC). The molecular weight of the cyclic peptide was confirmed by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS), and the stability of the cyclic peptide combination with the reductant was further confirmed using HPLC. In addition, the chemical shift in the cyclic peptide was analyzed by 1H nuclear magnetic resonance (1H NMR) spectra. Overall, this protocol aimed to establish an effective strategy for synthesizing cyclic peptides.

This protocol presents the synthesis of cyclic peptides via bisalkylation between cysteine and methionine and the facile thiol-yne reaction triggered by the propargyl sulfonium center.

Construindo peptídeos cíclicos usando um centro de sulfônio on-tether

In recent years, cyclic peptides have attracted increasing attention in the field of drug discovery due to their excellent biological activities, and, as ...

Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using "Safety Catch" Methodology

In 1962, R.B. Merrifield published the first procedure using solid-phase peptide synthesis as a novel route to efficiently synthesize peptides. This technique quickly proved advantageous over its solution-phase predecessor in both time and labor. Improvements concerning the nature of solid support, the protecting groups employed and the coupling methods employed over the last five decades have only increased the usefulness of Merrifield's original system. Today, use of a Boc-based protection and base/nucleophile cleavable resin strategy or Fmoc-based protection and acidic cleavable resin strategy, pioneered by R.C. Sheppard, are most commonly used for the synthesis of peptides1.
Inspired by Merrifield's solid supported strategy, we have developed a Boc/tert-butyl solid-phase synthesis strategy for the assembly of functionalized bis-peptides2, which is described herein. The use of solid-phase synthesis compared to solution-phase methodology is not only advantageous in both time and labor as described by Merrifield1, but also allows greater ease in the synthesis of bis-peptide libraries. The synthesis that we demonstrate here incorporates a final cleavage stage that uses a two-step "safety catch" mechanism to release the functionalized bis-peptide from the resin by diketopiperazine formation.
Bis-peptides are rigid, spiro-ladder oligomers of bis-amino acids that are able to position functionality in a predictable and designable way, controlled by the type and stereochemistry of the monomeric units and the connectivity between each monomer. Each bis-amino acid is a stereochemically pure, cyclic scaffold that contains two amino acids (a carboxylic acid with an &alpha;-amine)3,4. Our laboratory is currently investigating the potential of functional bis-peptides across a wide variety of fields including catalysis, protein-protein interactions and nanomaterials.

The efficient solid-phase peptide synthesis of a functionalized bis-peptide trimer utilizing a "safety catch" cleavage procedure from HMBA resin is described.

Síntese em Fase Sólida de um funcionalizada Bis Peptide-Usando o &quot;Safety Catch&quot; Metodologia

In 1962, R.B. Merrifield published the first procedure using solid-phase peptide synthesis as a novel route to efficiently synthesize peptides. This ...

Biologia

Specificity Analysis of Protein Lysine Methyltransferases Using SPOT Peptide Arrays

Lysine methylation is an emerging post-translation modification and it has been identified on several histone and non-histone proteins, where it plays crucial roles in cell development and many diseases. Approximately 5,000 lysine methylation sites were identified on different proteins, which are set by few dozens of protein lysine methyltransferases. This suggests that each PKMT methylates multiple proteins, however till now only one or two substrates have been identified for several of these enzymes. To approach this problem, we have introduced peptide array based substrate specificity analyses of PKMTs. Peptide arrays are powerful tools to characterize the specificity of PKMTs because methylation of several substrates with different sequences can be tested on one array. We synthesized peptide arrays on cellulose membrane using an Intavis SPOT synthesizer and analyzed the specificity of various PKMTs. Based on the results, for several of these enzymes, novel substrates could be identified. For example, for NSD1 by employing peptide arrays, we showed that it methylates K44 of H4 instead of the reported H4K20 and in addition H1.5K168 is the highly preferred substrate over the previously known H3K36. Hence, peptide arrays are powerful tools to biochemically characterize the PKMTs.

Peptide arrays synthesized by the SPOT method can be used to analyze the substrate specificity of Protein lysine methyltransferases (PKMTs) and to define the substrate spectrum of PKMTs to understand their biological role. This protocol describes how to synthesize peptide arrays, methylate them with PKMTs, and analyze the results.

Especificidade Análise de Proteína Lisina Metiltransferases Usando SPOT Peptide Arrays

Lysine methylation is an emerging post-translation modification and it has been identified on several histone and non-histone proteins, where it plays ...

Um método eficiente para a Síntese de Peptóides com Monómeros Mixed tipo de lisina / arginina-tipo e avaliação da sua actividade anti-leishmaniose

Resumo

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