PDK é suportado por uma operação CIHR subvenção (MOP 86,523)

1. Técnica Cirúrgica <ol><li> Experimentos devem ser realizados com técnica asséptica e seguindo os protocolos de uso de animais de sua instituição específica. Instrumentos e materiais (soluções, as substâncias, marcadores, agulhas, etc) entrem em contacto com tecidos vivos, deve ser esterilizado para evitar infecções e impactos negativos no bem-estar animal e os potenciais impactos negativos sobre o estudo. </li></ol> 2. Anestesia <ol><li> Ratos serão anestesiados utilizando um sistema vaporizador veterinária isoflurano. Uso de oxigênio classe médica a uma taxa de 0,8 L / min para vaporizar o gás isoflurano. Colocar o animal na caixa de anestesia em anexo e marcar em uma concentração de isoflurano de 4%, até a respiração desacelerou e se o animal está tranqüilo. </li><li> Em seguida, mudar o fluxo de gás para o anexo máscara de gás para o quadro estereotáxico e colocar o animal no aparelho estereotáxico. Por sua vez a concentração de isoflurano para 2% e monitorar anestesia. Animais de maior porte (&gt; 300g) pode exigir uma maior concentração de isoflurano. A anestesia deve ser monitorizada durante a cirurgia e dosagem isoflurano ajustado em conformidade. Profundidade e taxa de respiração deve ser constantemente avaliados e avaliação toe pitada (a cada 5 minutos) para a ausência de dor profunda deve ser realizada. </li><li> Uma vez que a cirurgia está completa, desligue o isoflurano e permitir que o animal ao oxigênio da respiração por vários minutos antes da remoção do dispositivo estereotáxico. Temperatura corporal deve ser mantida, cobrindo o animal com um cobertor cirúrgica e / ou usar um cobertor de aquecimento regulados durante a cirurgia. </li></ol> 3. Abordagem cirúrgica <ol><li> Molhar o pêlo no alto da cabeça com etanol 70% para tornar a pele mais fácil de cortar. Retire a pele de entre os olhos usando um cortador ou tesoura afiada. Limpar a área da incisão três vezes, com aplicações alternadas de solução de detergente de iodo (Betadine Proviodine, etc), seguido pelo etanol 70%. Manter a córnea úmida durante toda a cirurgia através da aplicação de pomada oftálmica nos olhos (lágrimas Naturale PM) para a córnea. Espalhar a pomada sobre a superfície da córnea por manualmente abrindo e fechando as pálpebras. </li><li> Usando uma lâmina n º 11, fazer uma incisão ao longo da linha média da cabeça de aproximadamente 0,5 cm à frente dos olhos a 1 cm atrás dos olhos. Recolher o flap de pele sobre o olho com a pinça e gentilmente provocar afastado o tecido conjuntivo subjacente com a parte de trás do bisturi. Então, recolher o flap de pele lateralmente e para baixo e segure no lugar com um retrator cirúrgico que pode ser colado na base do aparelho estereotáxico. </li><li> Faça uma incisão ao longo da borda superior do osso orbital, enquanto puxando a fáscia que cobre com uma pinça afiada. Isso vai retirar a fáscia que recobre a órbita do olho. A borda do osso orbital pode ser claramente demarcada usando uma pinça para empurrar para baixo sobre a fáscia que recobre a órbita. Usando um cautério ou bisturi, continue a incisão para trás para o limite posterior da órbita do olho. Use o osso da órbita superior como um guia para a incisão. Em seguida continue a frente da incisão para o limite anterior da órbita. A incisão da órbita superior é o melhor feito usando um cautério pequenos, a fim de evitar sangramento dos vasos subjacentes que se comunicam com os seios venosos. </li><li> Se o sangramento ocorre várias etapas podem ser tomadas. Em primeiro lugar, aplicar pressão usando swabs estéreis cirúrgica ou cotonetes. Se o sangramento continua, aplicar frio, solução salina tampão estéril de fosfato (PBS) para a área usando um conta-gotas, e manter a pressão. Sangramento menor vai parar depois de alguns segundos usando este procedimento. Se o sangramento persistir, aplique a tração para o tecido com o cotonete cirúrgico ou cotonete, a fim de identificar a origem da hemorragia e rapidamente cauterizar o vaso comprometido. Depois que o sangramento é contido, use frio PBS esterilizado para limpar a área cirúrgica do sangue. A área cirúrgica devem ser periodicamente limpos desta forma, a fim de visualizar melhor as estruturas na órbita do olho. </li><li> Uma vez que a incisão tenha sido limpo, utilize uma pinça e parte de trás do bisturi para limpar o tecido conjuntivo na parte de trás do olho que recobre o conteúdo orbital. Parte de trás do bisturi n º 11 funciona bem como a ponta é fina. Isto irá abrir porções mais profundas da cavidade orbital proporcionando uma maior janela cirúrgica para trabalhar dentro Use Dumont 7b # sharp-curvo-serrilhada forceps durante o trabalho no olho como a sua curvatura e dicas finas são ideais para a manipulação de estruturas em órbita. Além disso, o serrilhas ajudar com estruturas de fixação. </li><li> Em seguida, retire o tecido conjuntivo que envolve a divisão oftálmica do nervo trigêmeo, que fica perto da linha média, e remover o nervo usando uma pinça. Este passo não é necessário, no entanto remover o nervo irá proporcionar uma maior janela de access para o nervo óptico mais tarde. </li><li> Após a remoção do nervo, utilize uma pinça para retirar o vaso sanguíneo abaixo e completamente cauterizar o vaso. Esta etapa também não é necessário, no entanto cautério da embarcação permite que ele seja transferido anteriormente, criando assim uma janela maior uma vez que o nervo óptico é atingido. </li><li> Use um par de pinças afiadas, ou fórceps que tiveram suas pontas dobradas para dentro, para escolher com cuidado e retire a fina camada de tecido conjuntivo ao longo dos músculos extra-oculares e glândula lacrimal. Retrair os músculos oculares extra a partir de anterior para posterior da órbita. Segure a parte proximal do músculo com uma pinça e usar um segundo par de pinças curvas serrilhadas vestir olho para aplicar tração externa sobre o músculo. Certifique-se que a pinça de vestir os olhos são orientadas na mesma direção como o músculo ao puxar para evitar rasgamento. Retire o músculo mais anterior da órbita (Superior Oblique) dessa maneira. O músculo será liberado de dentro da órbita eo comprimento restante pode ser retraído, a fim de girar o olho para fora. </li><li> Repita o Passo 3,8 com o músculo seguinte (reto medial) que está localizado entre os lobos da glândula lacrimal e Gland Harderian perto da linha média da superfície dorsal do olho. Tape as retrator para manter a tração sobre os músculos. </li><li> Remova com cuidado o tecido remanescente conjuntivo sobre a superfície da glândula lacrimal e levante a glândula para cima usando uma pinça. Não comprimir ou apertar as glândulas. , A fim de retirar a glândula, apenas um único navio no pólo posterior precisa ser cauterizado. Levante a extremidade posterior da glândula para cima, e depois cauterizar o vaso. </li><li> Em seguida, flap da glândula lacrimal para a frente para abrir a parte posterior da órbita e permitir livre acesso para os músculos que recobrem o nervo óptico. Manter a área sempre úmida usando PBS estéril e secagem com compressas cirúrgicas ou cotonetes. </li><li> Utilizando uma pinça afiada, mais uma vez remover o tecido fino conectivo que envolve os músculos da órbita posterior (levantador da pálpebra superior e reto superior) e separar os feixes de músculos subjacentes. Retrair os músculos de forma independente ou em conjunto, utilizando a curva serrilhada forceps vestir olho, mais uma vez, puxando em linha com as fibras musculares. Anexar os comprimentos musculares restantes para o afastador juntamente com os músculos que foram recolhidos nas Etapas 3.8 e 3.9 e fita para baixo o retrator para aplicar tração. Um total de 4 músculos agora será anexado ao retrator. Isso irá girar o olho para a frente e para fora, a fim de revelar a capa de gordura que contêm que envolve o nervo óptico. </li></ol> 4. Acessando o Nervo Óptico <ol><li> Use uma pinça afiada (Fine ponta Dumont) para puxar para cima sobre o tecido conjuntivo que envolve a bainha de gordura do nervo óptico. Faça um corte longitudinal com uma tesoura pequena mola Vannas. Expandir o corte como necessário. A gordura contida pela bainha começará a protuberância para fora uma vez que o corte é feito. Em seguida retire os retalhos de tecido conjuntivo com cuidado puxando para cima a partir da borda e cortar as abas em forma de crescente de tecido. </li><li> Remova a gordura que cobre o nervo óptico, usando uma pinça para puxar a gordura, enquanto o corte com a tesoura primavera Vannas. Manter a área limpa usando PBS esterilizado e compressas cirúrgicas para limpar a pequenas quantidades de sangue que surgem a partir da remoção do tecido. </li><li> O nervo óptico é agora visível. Para acessar o nervo, a bainha meníngea que envolve o nervo deve ser removido sem danificar a artéria oftálmica que alimenta a retina interna. Examine o padrão vascular da bainha meníngea usando uma pinça para girar suavemente a bainha. Procure uma área desprovida de vasos sanguíneos, e permitindo um corte longitudinal a ser feita na bainha meníngea. </li><li> Usando a ponta fina Dumont fórceps, beliscar a dura e puxar para cima. Perto da base da cunha triangular em forma de dura que é criado, use a tesoura primavera Vannas para fazer uma pequena incisão na bainha. Insira o menor lâmina da tesoura na incisão e cortar a bainha paralela à direção do nervo óptico, cuidado para não danificar os vasos com cortes laterais. Use a pinça e tesouras para armar a dura para ambos os lados do nervo óptico. </li><li> O revestimento único remanescente do nervo é a membrana aracnóide. É muito fina e transparente. A fim de determinar se a membrana está ainda presente, utilize uma pinça afiada para beliscar a superfície do nervo. É a aracnóide está presente, apertar a membrana e puxe para cima para criar uma cunha triangular de tecido. Fazer uma pequena incisão com a ponta da tesoura semelhante ao Passo 4.4. Em seguida, insira a parte inferior da lâmina da tesoura e fazer um corte longitudinal na aracnóide. Em seguida, use a sua tesoura e uma pinça para armar a aracnóide para ambos os lados do nervo óptico. </li><li> Usando um micro-surgancho tecnológico, elevar o nervo óptico para fora da bainha meníngea. Passe a ponta do anzol em torno da borda externa do nervo e certifique-se que o gancho fica em contato com o nervo, para que você não pegar as membranas das meninges com o gancho e acidentalmente transecto-los. Levante cuidadosamente o nervo óptico para fora da bainha meníngea e completamente transecto o nervo atrás do ponto apoiado pelo gancho. O coto do nervo óptico transeccionados terá agora uma extremidade livre, permitindo a remoção do gancho. </li><li> Se o RGCs vão ser retrogradamente marcados, a fim de quantificar a sobrevivência, coloque um pequeno pedaço de gelfoam embebido em Fluorogold 3% (ou outra tracer retrógrada) sobre o coto do nervo seccionado óptica (ver <a href="http://www.jove.com/details.php?id=2261">JOVE protocolo de 2261</a> ). </li></ol> 5. Fechamento e recuperação <ol><li> Aliviar a tração sobre os músculos oculares extras e voltar os olhos para uma posição neutra. Ao fazê-lo, certifique-se para empurrar o gelfoam para dentro da órbita do olho para garantir que a vista é girada de volta no lugar, o gelfoam permanece em torno do coto do nervo óptico. Retorno da glândula lacrimal e músculos oculares extra para suas posições naturais. </li><li> Devolver o retalho de pele para a linha média e sutura do ferimento. Aplicar pomada oftálmica para ambos os olhos. Então, desligue a fonte de isoflurano e permitir que o animal ao oxigênio da respiração por vários minutos. Colocar o animal em uma gaiola aquecida ou uma gaiola debaixo de uma lâmpada de calor para se recuperar. Não coloque nenhum fundamento na gaiola de recuperação para eliminar a possibilidade de aspiração da cama durante a recuperação. </li><li> Animais devem ser alojados de forma independente após a cirurgia. Pós-cirúrgica analgésicos devem ser administrados de acordo com as diretrizes de sua autoridades cuidados com os animais e os animais devem ser cuidadosamente monitorizados após a cirurgia. </li></ol> 6. Resultados representativos: Transecção do nervo óptico resultados na perda de 90% dos RGCs feridos dentro de 14 dias postaxotomy 9-11. O principal mecanismo da morte RGC é apoptose 9, 12. A densidade normal de RGCs é de aproximadamente 2.500 células / mm 2. Imagens de epifluorescência ou confocal pode ser usado para visualizar RGCs retrogradamente marcados após axotomia. Apoptose RGC é adiada por aproximadamente 4 dias após axotomia, deixando uma janela de tempo para manipulações experimentais. Menos 1 dia após a axotomia e rotulagem retrógrada com Fluorogold, corpos celulares RGC na camada de células ganglionares da retina e fascículos axônio na camada de fibras nervosas da retina são claramente visíveis quando a imagem de um preparo flatmounted (Fig 1a). Por 14 dias após a axotomia, a maioria dos RGCs morreram, e um RGCs poucos remanescentes são intercaladas entre microglia da retina (Fig 1b). Quando RGCs sofrem apoptose, microglia fagocitam as células mortas e, como resultado tornar transcellularly rotulado com o marcador fluorescente que era usado para rotular a RGCs 13, 14. A aparência do marcador no fagossomos de microglia é diferente daquela em RGCs sobreviventes. Microglia conter o marcador nos fagossomos altamente concentrada e extremamente luminosos, que são relativamente grandes e espalhados por todo o seu citoplasma (Fig. 1c). RGCs têm um padrão mais difuso de coloração (Fig. 1c) com pequenas vesículas puntiformes que foram transportados retrogradamente para baixo seus axônios apresentação do citoplasma da célula. Essas vesículas são muito menores e têm menos intensa fluorescência permitindo que se possa diferenciar RGCs sobrevivente da microglia. Além disso, microglia têm corpos celulares muito menores e tendem a ter uma morfologia estreladas ou amoeboid ao contrário RGCs que têm corpos celulares relativamente grandes e arredondadas. As árvores dendríticas de RGCs também pode ajudar a diferenciá-los dos processos curto brilhante da microglia, ao quantificar a sobrevivência da célula. Sobrevivência da célula podem ser quantificados em diferentes regiões da retina e da densidade (células / mm 2) podem ser extrapolados a partir da área do micrografias correspondentes, desde RGCs são encontrados em uma monocamada dentro da camada de células ganglionares. <img src="/files/ftp_upload/2241/2241fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Micrografias de epifluorescência de Fluorogold RGCs rotulados após axotomia e aplicação do traçador ao coto do nervo óptico. (A) um dia após axotomia RGCs fascículos e seu axônio são rotulados com o marcador de uma forma bem pontuada. (B) Por 14 dias após a axotomia, 90% dos RGCs morreram e brilhantemente rotulados microglia que fagocitados células mortas também são rotulados com o marcador. (C) Maior aumento ilustrando a diferença entre RGCs e microglia (setas vermelhas) em 14 postaxotomy dias. Barra de escala em A e B é 50 mm. Barra de escala em C é 25 mm.

<ol>
	<li>Bahr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+or+let+die+-+retinal+ganglion+cell+death+and+survival+during+development+and+in+the+lesioned+adult+CNS.">Live or let die - retinal ganglion cell death and survival during development and in the lesioned adult CNS.</a> Trends Neurosci. 23, 483-4890 (2000).</li><li>Isenmann, S., Kretz, A., Cellerino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+determinants+of+retinal+ganglion+cell+development,+survival,+and+regeneration.">Molecular determinants of retinal ganglion cell development, survival, and regeneration.</a> Prog Retin Eye Res. 22, 483-543 (2003).</li><li>Koeberle, P. D., Bahr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+guidance+cues+for+regenerating+axons:+where+have+they+gone.">Growth and guidance cues for regenerating axons: where have they gone.</a> J Neurobiol. 59, 162-180 (2004).</li><li>Weishaupt, J. H., Bahr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degeneration+of+axotomized+retinal+ganglion+cells+as+a+model+for+neuronal+apoptosis+in+the+central+nervous+system+-+molecular+death+and+survival+pathways.">Degeneration of axotomized retinal ganglion cells as a model for neuronal apoptosis in the central nervous system - molecular death and survival pathways.</a> Restor. Neurol. Neurosci. 19, 1-2 (2001).</li><li>Valenzuela, G. a. r. c. i. a., E, S. C. S. h. a. r. m. a. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+retinal+ganglion+cells+from+axotomy-induced+apoptosis+through+TRK+oncogene+transfer.">Rescue of retinal ganglion cells from axotomy-induced apoptosis through TRK oncogene transfer.</a> Neuroreport. 9, 3165-3170 (1998).</li><li>Kugler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transduction+of+axotomized+retinal+ganglion+cells+by+adenoviral+vector+administration+at+the+optic+nerve+stump:+an+in+vivo+model+system+for+the+inhibition+of+neuronal+apoptotic+cell+death.">Transduction of axotomized retinal ganglion cells by adenoviral vector administration at the optic nerve stump: an in vivo model system for the inhibition of neuronal apoptotic cell death.</a> Gene Ther. 6, 1759-1767 (1999).</li><li>Lingor, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Down-regulation+of+apoptosis+mediators+by+RNAi+inhibits+axotomy-induced+retinal+ganglion+cell+death+in+vivo.">Down-regulation of apoptosis mediators by RNAi inhibits axotomy-induced retinal ganglion cell death in vivo.</a> Brain. 128, 550-558 (2005).</li><li>Koeberle, P. D., Gauldie, J., Ball, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+adenoviral-mediated+gene+transfer+of+interleukin-10,+interleukin-4,+and+transforming+growth+factor-beta+on+the+survival+of+axotomized+retinal+ganglion+cells.">Effects of adenoviral-mediated gene transfer of interleukin-10, interleukin-4, and transforming growth factor-beta on the survival of axotomized retinal ganglion cells.</a> Neuroscience. 125, 903-920 (2004).</li><li>Berkelaar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axotomy+results+in+delayed+death+and+apoptosis+of+retinal+ganglion+cells+in+adult+rats.">Axotomy results in delayed death and apoptosis of retinal ganglion cells in adult rats.</a> J Neurosci. 14, 4368-4374 (1994).</li><li>Villegas-Perez, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influences+of+peripheral+nerve+grafts+on+the+survival+and+regrowth+of+axotomized+retinal+ganglion+cells+in+adult+rats.">Influences of peripheral nerve grafts on the survival and regrowth of axotomized retinal ganglion cells in adult rats.</a> J Neurosci. 8, 265-280 (1988).</li><li>Villegas-Perez, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+protracted+phases+of+retinal+ganglion+cell+loss+follow+axotomy+in+the+optic+nerve+of+adult+rats.">Rapid and protracted phases of retinal ganglion cell loss follow axotomy in the optic nerve of adult rats.</a> J Neurobiol. 24, 23-36 (1993).</li><li>Quigley, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+ganglion+cell+death+in+experimental+glaucoma+and+after+axotomy+occurs+by+apoptosis.">Retinal ganglion cell death in experimental glaucoma and after axotomy occurs by apoptosis.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 36, 774-786 (1995).</li><li>Thanos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+transcellular+carbocyanine-labelling+of+rat+retinal+microglia+during+injury-induced+neuronal+degeneration.">Specific transcellular carbocyanine-labelling of rat retinal microglia during injury-induced neuronal degeneration.</a> Neurosci Lett. 127, 108-1012 (1991).</li><li>Thanos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+transcellular+staining+of+microglia+in+the+adult+rat+after+traumatic+degeneration+of+carbocyanine-filled+retinal+ganglion+cells.">Specific transcellular staining of microglia in the adult rat after traumatic degeneration of carbocyanine-filled retinal ganglion cells.</a> Exp Eye Res. 55, 101-117 (1992).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Há muitas variações deste procedimento cirúrgico e vários dos passos neste protocolo não são necessárias. Só é necessário para retrair os músculos que recobrem o nervo óptico, a fim de ganhar acesso ao nervo. No entanto, isso resulta em um espaço muito limitado trabalhando ao redor do nervo fazendo os estágios críticos final da transecção mais difícil. Em certas situações é desejável transfecção as células do tronco do nervo óptico e do espaço maior acesso proporcionada pela retração de tod...

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Stereotaxic Frame</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stoelting, Kopf, WPI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rat Gas Mask</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stoelting, Kopf, WPI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anesthesia System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VetEquip</td>
<td>901806</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Isoflurane (PrAErrane)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Baxter Corp</td>
<td>DIN 02225875</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Surgical Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>WPI, Zeiss, Leica</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fluorogold -(Hydroxystilbamidine bis(methanesulfonate)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>39286</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gelfoam</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pharmacia &amp; Upjohn</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tears Naturale P.M.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Alcon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Proviodine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Medline</td>
<td>MDS093945H</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vannas spring scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>15000-00</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fine tip Dumont forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11252-00</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micro surgical hook</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>10062-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Eye dressing serrated forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11152-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dumont #7b sharp curved serrated forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11270-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cauterizer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>18010-00</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

optic nerve transection: a model of adult neuron apoptosis in the central nervous system

Células ganglionares da retina (RGCs) são neurônios do SNC que a informação de saída visual da retina para o cérebro, através do nervo óptico. O nervo óptico pode ser acessado dentro da órbita do olho e completamente seccionado (axotomized), cortando os axônios de toda a população RGC. Transecção do nervo óptico é um modelo reprodutível de morte celular por apoptose neuronal no SNC adulto 1-4. Este modelo é particularmente atraente porque a câmara vítrea do olho funciona como uma cápsula para entrega de drogas para a retina, permitindo manipulações experimentais através de injeções intra-ocular. A difusão de substâncias químicas através do fluido vítreo garante que eles agem sobre toda a população RGC. Além disso, RGCs pode ser seletivamente transfectadas através da aplicação de curto RNAs de interferência (siRNAs), plasmídeos ou vetores virais para o fim do corte do nervo óptico vetores 5-7 ou injetar seu alvo, o colículo superior 8. Isso permite que os pesquisadores a estudar mecanismos apoptóticos na população neuronal desejado sem efeitos de confusão sobre os neurônios ou células gliais bystander outras circunvizinhas. Um benefício adicional é a facilidade e precisão com que a sobrevivência da célula podem ser quantificados após a lesão. A retina é um tecido, liso em camadas e RGCs estão localizadas na camada mais interna, a camada de células ganglionares. A sobrevivência da RGCs pode ser rastreado ao longo do tempo através da aplicação de um marcador fluorescente (3% Fluorogold) até o fim do corte do nervo óptico no momento da axotomia, ou pela injeção de traçador no colículo superior (alvo RGC) uma semana antes axotomia. O marcador é transportado retrogradamente, rotulagem toda a população RGC. Porque a camada de células ganglionares é uma monocamada (uma célula de espessura), as densidades RGC podem ser quantificados em tecido liso-montada, sem a necessidade de estereologia. Transecção do nervo óptico leva à morte apoptótica de 90% da RGCs feridos dentro de 14 dias postaxotomy 9-11. RGC apoptose tem uma característica de tempo-curso em que a morte da célula é retardado postaxotomy 3-4 dias, após o qual as células degeneram rapidamente. Isso proporciona uma janela de tempo para manipulações experimentais contra vias envolvidas na apoptose.

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Optic Nerve Transection: A Model of Adult Neuron Apoptosis in the Central Nervous System

Transecção do nervo óptico é um modelo amplamente utilizado de lesão do SNC adulto. Noventa por cento das células ganglionares da retina (RGCs) cujos axônios são completamente seccionado (axotomia) morrem dentro de 14 dias após a axotomia. Esse modelo se adequa facilmente a manipulações experimentais e altamente reprodutível.

Transecção do nervo óptico: Um Modelo de Apoptose Neuron Adultos no Sistema Nervoso Central

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be ...

optic-nerve-transection-model-adult-neuron-apoptosis-central-nervous

Research

JoVE Journal

Neuroscience

20.5K visualizações.  University of Toronto. Transecção do nervo óptico é um modelo amplamente utilizado de lesão do SNC adulto. Noventa por cento das células ganglionares da retina (RGCs) cujos axônios são completamente seccionado (axotomia) morrem dentro de 14 dias após a axotomia. Esse modelo se adequa facilmente a manipulações experimentais e altamente reprodutível.

Vídeo: Optic Nerve Transection: A Model of Adult Neuron Apoptosis in the Central Nervous System

Methods for Experimental Manipulations after Optic Nerve Transection in the Mammalian CNS

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. The optic nerve can be accessed within the orbit of the eye and completely transected (axotomized), cutting the axons of the entire RGC population. Optic nerve transection is a reproducible model of apoptotic neuronal cell death in the adult CNS 1-4. This model is particularly attractive because the vitreous chamber of the eye acts as a capsule for drug delivery to the retina, permitting experimental manipulations via intraocular injections. The diffusion of chemicals through the vitreous fluid ensures that they act upon the entire RGC population. Viral vectors, plasmids or short interfering RNAs (siRNAs) can also be delivered to the vitreous chamber in order to infect or transfect retinal cells 5-12. The high tropism of Adeno-Associated Virus (AAV) vectors is beneficial to target RGCs, with an infection rate approaching 90% of cells near the injection site 6, 7, 13-15. Moreover, RGCs can be selectively transfected by applying siRNAs, plasmids, or viral vectors to the cut end of the optic nerve 16-19 or injecting vectors into their target the superior colliculus 10. This allows researchers to study apoptotic mechanisms in the injured neuronal population without confounding effects on other bystander neurons or surrounding glia. RGC apoptosis has a characteristic time-course whereby cell death is delayed 3-4 days postaxotomy, after which the cells rapidly degenerate. This provides a window for experimental manipulations directed against pathways involved in apoptosis. Manipulations that directly target RGCs from the transected optic nerve stump are performed at the time of axotomy, immediately after cutting the nerve. In contrast, when substances are delivered via an intraocular route, they can be injected prior to surgery or within the first 3 days after surgery, preceding the initiation of apoptosis in axotomized RGCs. In the present article, we demonstrate several methods for experimental manipulations after optic nerve transection.

Optic Nerve transection is a widely used model of adult CNS injury. This model is ideal for performing a number of experimental manipulations that target the retina globally or directly target the injured neuronal population of retinal ganglion cells.

Métodos para manipulações experimentais após a transecção do nervo óptico no sistema nervoso central de mamíferos

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. The optic nerve can be ...

Neurociência

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, both in preclinical and clinical studies. However, to date results regarding functional outcome and/or tissue regeneration following stem cell transplantation are quite diverse. Generally, a clinical benefit is observed without profound understanding of the underlying mechanism(s)1. Therefore, multiple efforts have led to the development of different molecular imaging modalities to monitor stem cell grafting with the ultimate aim to accurately evaluate survival, fate and physiology of grafted stem cells and/or their micro-environment. Changes observed in one or more parameters determined by molecular imaging might be related to the observed clinical effect. In this context, our studies focus on the combined use of bioluminescence imaging (BLI), magnetic resonance imaging (MRI) and histological analysis to evaluate stem cell grafting.
BLI is commonly used to non-invasively perform cell tracking and monitor cell survival in time following transplantation2-7, based on a biochemical reaction where cells expressing the Luciferase-reporter gene are able to emit light following interaction with its substrate (e.g. D-luciferin)8, 9. MRI on the other hand is a non-invasive technique which is clinically applicable10 and can be used to precisely locate cellular grafts with very high resolution11-15, although its sensitivity highly depends on the contrast generated after cell labeling with an MRI contrast agent. Finally, post-mortem histological analysis is the method of choice to validate research results obtained with non-invasive techniques with highest resolution and sensitivity. Moreover end-point histological analysis allows us to perform detailed phenotypic analysis of grafted cells and/or the surrounding tissue, based on the use of fluorescent reporter proteins and/or direct cell labeling with specific antibodies.
In summary, we here visually demonstrate the complementarities of BLI, MRI and histology to unravel different stem cell- and/or environment-associated characteristics following stem cell grafting in the CNS of mice. As an example, bone marrow-derived stromal cells, genetically engineered to express the enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) and firefly Luciferase (fLuc), and labeled with blue fluorescent micron-sized iron oxide particles (MPIOs), will be grafted in the CNS of immune-competent mice and outcome will be monitored by BLI, MRI and histology (Figure 1).

This article describes an optimized sequence of events for multimodal imaging of cellular grafts in rodent brain using: (i) in vivo bioluminescence and magnetic resonance imaging, and (ii) post mortem histological analysis. Combining these imaging modalities on a single animal allows cellular graft evaluation with high resolution, sensitivity and specificity.

Imagem Multimodal de implante de células-tronco no sistema nervoso central de camundongos

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

Marcação de células individuais no Sistema Nervoso Central de<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses specifically on antisense oligonucleotides (ASOs), though the techniques shown in the video here can also be used to deliver a plethora of other drugs to the CNS. Antisense oligonucleotides (ASOs) have the capability to knockdown sequence-specific targets 1 as well as shift isoform ratios of specific genes 2. To achieve widespread gene knockdown or splicing in the CNS of mice, the ASOs can be delivered into the brain using two separate routes of administration, both of which we demonstrate in the video.
The first uses Alzet osmotic pumps, connected to a catheter that is surgically implanted into the lateral ventricle. This allows the ASOs to be continuously infused into the CNS for a designated period of time. The second involves a single bolus injection of a high concentration of ASO into the right lateral ventricle. Both methods use the mouse cerebral ventricular system to deliver the ASO to the entire brain and spinal cord, though depending on the needs of the study, one method may be preferred over the other.

We describe a method to target drugs to the central nervous system by either implanting a catheter or performing a bolus injection into the right lateral ventricle in mice. We focus specifically on the delivery of antisense oligonucleotides. This technique is readily adaptable to other drugs and to rats.

Entrega intraventricular direta de medicamentos para o Sistema Nervoso Central Rodent

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are tightly regulated, affecting the final dynamics of protein abundance. Various regulatory mechanisms exist at the translation step, rendering mRNA levels alone an unreliable indicator of gene expression. In addition, local regulation of mRNA translation has been particularly implicated in neuronal functions, shifting &#39;translatomics&#39; to the focus of attention in neurobiology. The presented method can be used to bridge transcriptomics and proteomics.
Here we describe essential modifications to the technique of polyribosome fractionation, which interrogates the translatome based on the association of actively translated mRNAs to multiple ribosomes and their differential sedimentation in sucrose gradients. Traditionally, working with in vivo samples, particularly of the central nervous system (CNS), has proven challenging due to the restricted amounts of material and the presence of fatty tissue components. In order to address this, the described protocol is specifically optimized for use with minimal amount of CNS material, as demonstrated by the use of single mouse spinal cord and brain. Briefly, CNS tissues are extracted and translating ribosomes are immobilized on mRNAs with cycloheximide. Myelin flotation is then performed to remove lipid rich components. Fractionation is performed on a sucrose gradient where mRNAs are separated according to their ribosomal loading. Isolated fractions are suitable for a range of downstream assays, including new genome wide assay technologies.

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

This protocol illustrates essential modifications of polyribosome fractionation in order to study the translatome of in vivo CNS samples. It allows global assessment of translation and transcription regulation through the isolation and comparison of total RNA to ribosome bound RNA fractions.

In vivo Interrogatório de Sistema Nervoso Central Translatome por Polyribosome Fracionamento

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

In vivo Optogenetic estimulação do sistema nervoso central de roedores

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Visual Evoked Potential Recording in a Rat Model of Experimental Optic Nerve Demyelination

The visual evoked potential (VEP) recording is widely used in clinical practice to assess the severity of optic neuritis in its acute phase, and to monitor the disease course in the follow-up period. Changes in the VEP parameters closely correlate with pathological damage in the optic nerve. This protocol provides a detailed description about the rodent model of optic nerve microinjection, in which a partial demyelination lesion is produced in the optic nerve. VEP recording techniques are also discussed. Using skull implanted electrodes, we are able to acquire reproducible intra-session and between-session VEP traces. VEPs can be recorded on individual animals over a period of time to assess the functional changes in the optic nerve longitudinally. The optic nerve demyelination model, in conjunction with the VEP recording protocol, provides a tool to investigate the disease processes associated with demyelination and remyelination, and can potentially be employed to evaluate the effects of new remyelinating drugs or neuroprotective therapies.

Focal demyelination is induced in the optic nerve using lysolecithin microinjection. Visual evoked potentials are recorded via skull electrodes implanted over the visual cortex to examine the signal conduction along the visual pathway in vivo. This protocol details the surgical procedures underlying electrode implantation and optic nerve microinjection.

Visual Gravação Potencial Evocado em um modelo de rato de Experimental Nervo Óptico desmielinização

The visual evoked potential (VEP) recording is widely used in clinical practice to assess the severity of optic neuritis in its acute phase, and to ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique non-linear deformations, dramatically hampering one's ability to evaluate cellular morphology, distribution and connectivity in the central nervous system (CNS). However, optical clearing techniques are changing the way tissues are visualized. These approaches permit one to probe deeply into intact organ preparations, providing tremendous insight into the structural organization of tissues in health and disease. Techniques such as Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) achieve this goal by providing a matrix that binds important biomolecules while permitting light-scattering lipids to freely diffuse out. Lipid removal, followed by refractive index matching, renders the tissue transparent and readily imaged in 3 dimensions (3D). Nevertheless, the electrophoretic tissue clearing (ETC) used in the original CLARITY protocol can be challenging to implement successfully and the use of a proprietary refraction index matching solution makes it expensive to use the technique routinely. This report demonstrates the implementation of a simple and inexpensive optical clearing protocol that combines passive CLARITY for improved tissue integrity and 2,2&#8242;-thiodiethanol (TDE), a previously described refractive index matching solution.

Optical clearing techniques are revolutionizing the way tissues are visualized. In this report we describe modifications of the original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol that yields more consistent and less expensive results.

Clearing óptica do Sistema Nervoso Central Rato Usando a claridade passiva

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

Partial Optic Nerve Transection in Rats: A Model Established with a New Operative Approach to Assess Secondary Degeneration of Retinal Ganglion Cells

Previous studies have shown that the secondary degeneration of retinal ganglion cells (RGCs) occurs commonly in glaucoma. Partial optic nerve transection is considered a useful and reproducible model. Compared with other optic nerve injury models used commonly for assessing secondary degeneration, e.g. complete optic nerve transection and optic nerve crush models, the partial optic nerve transection model is superior as it distinguishes primary from secondary degeneration in situ. Therefore, it serves as an excellent tool for evaluating secondary degeneration. This study describes a novel operative approach of partial optic nerve transection by directly accessing the area of the retrobulbar optic nerve through the orbital lateral wall of the eyeball. Moreover, we present a newly designed, low cost surgical instrument to assist with transection. As demonstrated by the representative results in distinguishing the boundary of primary and secondary injury areas, the new approach and instrument ensures high efficiency and stability of the model by providing adequate space for surgical operation. This in turn makes it easy to separate the meningeal sheath and ophthalmic vessels from the optic nerve before transection. An additional benefit is that this space-saving operative approach improves the investigators&#39; ability to administer drugs, carriers, or selective RGC tracers to the stump of the partially transected optic nerve, allowing the exploration of mechanisms behind secondary injury in RGCs, in a new way.

Secondary degeneration of retinal ganglion cells (RGCs) occurs commonly in glaucoma. This study describes an innovative operative approach for partial optic nerve transection. The use of this space-saving operative approach extends the model's application range, and allows exploration of secondary injury mechanisms in RGCs in a new way.

Transecção parcial nervo óptico em ratos: um modelo estabelecido com uma nova abordagem operativa para avaliar secundária degeneração das células ganglionares da retina

Previous studies have shown that the secondary degeneration of retinal ganglion cells (RGCs) occurs commonly in glaucoma. Partial optic nerve transection ...

A Microbiomechanical System for Studying Varicosity Formation and Recovery in Central Neuron Axons

Axonal varicosities are enlarged structures along the shafts of axons with a high degree of heterogeneity. They are present not only in brains with neurodegenerative diseases or injuries, but also in the normal brain. Here, we describe a newly-established micromechanical system to rapidly, reliably, and reversibly induce axonal varicosities, allowing us to understand the mechanisms governing varicosity formation and heterogeneous protein composition. This system represents a novel means to evaluate the effects of compression and shear stress on different subcellular compartments of neurons, different from other in vitro systems that mainly focus on the effect of stretching. Importantly, owing to the unique features of our system, we recently made a novel discovery showing that the application of pressurized fluid can rapidly and reversibly induce axonal varicosities through the activation of a transient receptor potential channel. Our biomechanical system can be utilized conveniently in combination with drug perfusion, live cell imaging, calcium imaging, and patch clamp recording. Therefore, this method can be adopted for studying mechanosensitive ion channels, axonal transport regulation, axonal cytoskeleton dynamics, calcium signaling, and morphological changes related to traumatic brain injury.

This protocol describes a physiologically relevant, pressurized fluid approach for rapid and reversible induction of varicosities in neurons.

Um sistema de Microbiomechanical para estudar a formação de varizes e a recuperação no axônio do neurônio Central

Axonal varicosities are enlarged structures along the shafts of axons with a high degree of heterogeneity. They are present not only in brains with ...